Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le prestazioni e la funzione muscolare nel pesce zebra utilizzando la risposta evocata al tatto e i saggi di nuoto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della ricerca neuro-muscolare, come l'identificazione di prestazioni muscolari compromesse o difetti neurodegenerativi in modelli di malattia di zebrafish. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo automatizzato ad alto rendimento per valutare le prestazioni muscolari nei modelli malati di zebrafish.

Per eseguire il test, posizionare una capsula di Petri riempita con circa 25 millilitri di terreno embrionale su un tavolino illuminato a temperatura controllata impostato a circa 28 gradi Celsius. Montare la telecamera ad alta velocità sopra la parabola. Avvia il software di registrazione video e imposta la velocità di acquisizione su 1.000 fotogrammi al secondo per garantire che sia possibile catturare velocità di nuoto elevate.

Posizionare l'embrione al centro della capsula di Petri chiaramente visibile nel campo visivo. Premi Registra e poi eroga uno stimolo meccanosensoriale toccando delicatamente l'embrione con un ago smussato sulla parte superiore della testa. Interrompere la registrazione una volta che l'embrione è uscito dal campo visivo o è tornato a riposare.

Ripetere il test delle stesse larve principalmente per assuefazione o promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli malati con conseguente riduzione della risposta allo stimolo tattile, pertanto, ogni embrione dovrebbe essere testato solo una volta. Per quantificare il comportamento del nuoto, avvia il software e seleziona la locomozione delle singole larve con il nostro modulo di sottrazione in background per aprire il file video AVI. Seleziona lo strumento a mano libera o poligono dalla barra dei menu e seleziona la regione del filmato che comprende sia la posizione originale del pesce che l'area in cui nuota, escludendo la sonda utilizzata per fornire lo stimolo meccanosensoriale.

Fai clic su Esperimento nella barra dei menu e seleziona Esegui. Al prompt, salvare il file di analisi dei dati grezzi in formato PHR nella posizione desiderata. Quindi, fai clic su Avvia per iniziare l'analisi.

Una volta che il pesce è uscito dal campo visivo o il video clip è terminato, concludi l'analisi facendo clic su Stop nel menu Esperimento e apparirà una finestra che mostra i risultati. Scorri verso destra della finestra per ottenere il valore massimo di accelerazione. Esporta i dati facendo clic sul pulsante Esporta risultati istantanei nel menu a discesa Risultati.

Selezionare il file di analisi dei dati grezzi appropriato e fare clic per aprirlo. Questo salverà un file di testo nella cartella di destinazione che può essere aperto in un programma di fogli di calcolo. Posizionare le larve di prova in una piastra da 48 pozzetti, una per pozzetto.

Quindi, riempi i pozzetti con acqua fino a poco sotto la parte superiore del pozzo assicurandoti che non ci siano bolle. Conservare le piastre a 28 gradi Celsius per un'ora. Posizionare la lastra in una camera di registrazione dotata di una fotocamera digitale a infrarossi in grado di rilevare le larve al buio.

I ritmi circadiani e gli stimoli ambientali esterni possono influenzare in modo significativo il comportamento di nuoto del pesce zebra. L'ora del giorno e le condizioni di illuminazione devono essere standardizzate e la temperatura dell'acqua deve essere regolata rigorosamente. Avvia il software e seleziona il modulo di tracciamento.

In File, fare clic su Genera nuovo protocollo e modificare il numero di pozzetti utilizzati per l'esperimento, che in questo esempio è 48. Quindi, fai clic su Parametri e seleziona Parametri protocollo, quindi Tempo per impostare la durata dell'esperimento e il periodo di integrazione su 10 minuti. Sempre in Parametri protocollo, fare clic su Opzioni e verificare che la casella di controllo numeroscopio sia selezionata.

Per impostare le aree di registrazione, evidenziare l'intera griglia e fare doppio clic su uno dei pozzetti. Fai clic sul pulsante Disegna aree e disegna intorno ai pozzetti in alto a sinistra, in alto a destra e in basso a sinistra e fai clic su Costruisci. Il software determinerà quindi la posizione di ciascun pozzetto.

A questo punto, disegna anche la barra della scala e clicca su Applica al gruppo. Una volta completato, fai clic sul pulsante Disegna aree. Successivamente, seleziona il colore del pesce che in questo caso è nero e fai scorrere la barra della soglia di rilevamento a un livello in cui vengono evidenziati solo i movimenti del pesce senza sfondo.

Immettere le soglie di movimento per il rilevamento di inattività e movimenti piccoli e ingranditi. In questo esempio, è stata utilizzata una soglia di inattività di sei millimetri al secondo e una soglia di burst di attività di 30 millimetri al secondo. Fare clic sul menu Parametri, quindi sulle impostazioni di guida leggera e impostare l'intensità della luce della camera su 0%Chiudere lo sportello della camera di registrazione e avviare la registrazione video.

L'esperimento sarà completato in 10 minuti come indicato dal timer sullo schermo. Una volta completato, fai clic sul menu a discesa Esperimento e seleziona Interrompi. Verrà visualizzata una finestra di dialogo con i risultati.

Per esaminare i risultati utilizzando Excel, fare clic su Apri cartella contenitore e aprire il file che appare nella cartella risultante. Infine, il video può essere riprodotto per verificare se i valori di locomozione registrati rappresentano accuratamente i movimenti di nuoto del pesce. Ciò può essere ottenuto confrontando il movimento osservato nel file video con il profilo di locomozione generato dal software.

Le immagini istantanee di un embrione di pesce zebra scattate durante un saggio evocato al tatto mostrano il movimento tipico di un individuo nei primi 0,2 secondi dopo l'applicazione dello stimolo. Qui, la figura mostra un profilo di accelerazione per i primi 0,2 secondi della risposta di fuga dal nuoto a raffica in individui wild type rispetto a individui miopatici. L'accelerazione ha raggiunto il picco in entrambe le deformazioni in questa finestra temporale e l'accelerazione massima di picco è proporzionale alla capacità di generare forza del muscolo scheletrico.

I valori massimi di accelerazione sono stati mediati per i ceppi wild type e miopatici. I pesci miopatici hanno mostrato una significativa diminuzione dell'accelerazione massima, indicando una ridotta funzione muscolare. I saggi di locomozione di 10 minuti degli embrioni hanno registrato i modelli di movimento e i tipi di embrioni sia selvatici che miopatici e hanno generato rappresentazioni diagrammatiche dei movimenti di nuoto.

Sono stati mappati i periodi di movimento lento rappresentato da linee verdi e di movimento veloce rappresentato da linee rosse, così come i periodi di inattività rappresentati da linee nere. Gli individui wild type hanno mostrato alti livelli di attività con relativamente nessun periodo di inattività, in contrasto con gli individui miopatici che erano meno attivi durante il periodo di test. Ciò si è riflesso in differenze significative nel numero medio di movimenti e nella distanza percorsa dal tipo selvatico rispetto ai pesci miopatici.

Una volta padroneggiato, il saggio di risposta evocata al tatto può essere eseguito in 15 minuti per 15 pesci e i saggi di locomozione possono essere completati in circa 10 minuti per un massimo di 48 pesci. Durante il tentativo di questa procedura, è importante maneggiare con cura gli embrioni in quanto ciò potrebbe influire sulla loro attività. Dopo questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche come l'immunomarcatura o la microscopia elettronica per rispondere a ulteriori domande relative alla patologia muscolare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le prestazioni muscolari nello sviluppo precoce del pesce zebra.