Name: Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Impara a valutare le prestazioni muscolari in Danio rerio utilizzando saggi di risposta al tocco e locomozione. Questo metodo automatizzato consente analisi ad alto rendimento per studiare funzioni neuro-muscolari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Viewpoint per la gentile sponsorizzazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da un progetto (APP1010110) dell'Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC).

1. Assay risposta al tocco evocata <ol><li> Preparazione di 2 DPF embrioni per Touch-evocato Assay Risposta <ol><li> Assicurarsi che l&#39;ora del giorno in cui si svolge il test è coerente tra gli esperimenti perché l&#39;attività può variare notevolmente durante il giorno 17,18. NOTA: L&#39;esperimento deve essere eseguita in cieco e l&#39;ordine dei test randomizzati per ridurre al minimo gli artefatti sperimentali. </li><li> Assegnare il pesce ceppi un numero, che è sconosciuto per l&#39;individuo di effettuare l&#39;esperimento. A seguito di questo, utilizzando liberamente disponibili strumenti online generano un elenco casuale che determina l&#39;ordine delle prove. </li><li> Almeno un&#39;ora prima del test, gli embrioni dechorionate strappando un buco nel corion e delicatamente tirando il corion a parte con un paio di pinzette sottili. Rimuovere eventuali detriti dalla capsula di Petri prima di tornare in C incubatore 28 °. </li></ol></li><li> L&#39;esecuzione del test di risposta al tocco evocato <ol><li> sta di calorege a 28 ° C per almeno 15 minuti prima di iniziare il test. NOTA: Questa fase è controllata la temperatura e rimarrà a 28 &#160; ° C per la durata del test. Temperatura interesserà l&#39;attività ed è quindi importante per mantenere una temperatura costante. Se una fase riscaldata non è disponibile, la temperatura dell&#39;acqua deve essere monitorata e tutti gli esperimenti dovrebbe essere effettuata alla stessa temperatura. </li><li> Collocare un piatto Petri riempite con terreno di embrione (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 in acqua) su una fase illuminata e montare la telecamera ad alta velocità sulla capsula di Petri. </li><li> Avviare il software di video registrazione della videocamera (come flusso Pix 5, descritto qui) e nella scheda &quot;spazio di lavoro&quot; selezionare 1.000 frame al sec (1.000 fps), come la velocità di acquisizione per garantire che veloce nuoto del pesce viene registrato. </li><li> Lavorare con un embrione alla volta, posizionare l&#39;embrione nella MIDDle della capsula di Petri con la zebrafish chiaramente visibile nel campo visivo. NOTA: Se l&#39;embrione nuota via prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento sostituirlo con un altro, come riconquistare e il posizionamento dell&#39;embrione può provocare in esso diventando desensibilizzato agli stimoli e le risposte scoppio ripetuto può promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli di malattia. </li><li> Iniziare la registrazione cliccando sul pulsante &quot;record&quot; e, di fornire lo stimolo meccanosensoriali all&#39;embrione toccando delicatamente con un ago smussato sulla parte superiore della testa. </li><li> Arrestare la registrazione dopo l&#39;embrione ha nuotato fuori dal campo visivo o restituiti al resto. NOTA: I picchi di accelerazione entro il primo 0,2 sec della risposta fuga scoppiare seguenti stimolo meccanico. Pertanto, assicurare che almeno durante il primo 0,2 sec di registrare il pesce è nel campo di vista della risposta di fuga. Utilizzando il software descritto al punto 1.2.3, i dati saranno salvati automaticamentecome file video .avi. software di acquisizione video alternative come Free Video Capture o Softonic, entrambi i quali sono liberamente disponibili per il download, potrebbe anche essere utilizzato. </li><li> Ritorna l&#39;embrione di un nuovo piatto di Petri e selezionare un altro embrione per il test. Eseguire il test su un minimo di 15 pesci. </li></ol></li><li> La quantificazione di Nuoto Comportamento <ol><li> Per quantificare il comportamento di nuoto, avviare il software e selezionare il &quot;Single Larve Locomotion senza sfondo sottrazione&quot; modulo per aprire il file video salvato .avi. </li><li> Utilizzando la &quot;mano libera&quot; o strumento di &quot;poligono&quot; dalla barra dei menu selezionate aree del filmato da utilizzare per l&#39;analisi. Assicurarsi che la regione comprende sia la posizione originaria del pesce e l&#39;area che il pesce nuoterà in. Assicurarsi che la sonda è escluso dalla zona da analizzare. Il software traccia automaticamente la traiettoria del pesce nella zona desiderata. </li><li> Per eseguire tegli analisi, cliccare su &quot;esperimento&quot; dalla barra dei menu e selezionare &quot;eseguire&quot;. Quando richiesto salvare il file di analisi dei dati grezzi (.phr formato) nella posizione desiderata. Una volta salvati, cliccare su &quot;Start&quot; per iniziare l&#39;analisi. Terminare l&#39;analisi cliccando su &quot;stop&quot; sotto il &quot;esperimento&quot; menu a discesa. Verrà visualizzata una finestra contenente i risultati. </li><li> Scorrere verso destra per ottenere il valore &quot;accelerazione massima&quot;. Se lo si desidera, esportare questi dati chiudendo la finestra risultati e facendo clic sul pulsante &quot;Esporta risultati istantanei&quot; sotto i &quot;risultati&quot; menu a discesa. Selezionare il file raw appropriata analisi dei dati e fare clic su Apri. Un file di testo che può essere aperto in un foglio di calcolo verrà salvato nella cartella di destinazione. </li><li> Ripetere questo processo per ogni singolo pesce e media per ottenere la massima accelerazione media per ogni ceppo (vedi Figura 1). NOTA: In alternativa Using il software descritto qui, pacchetti simili, come il software ImageJ liberamente disponibile può essere utilizzata per estrarre i dati di movimento pertinenti. Il plugin 3D Particle Tracker può essere utilizzato per tenere traccia traiettorie di nuoto. </li></ol></li></ol> 2. Locomotion Assay - 10-minuti di nuotata di prova <ol><li> Preparazione di 6 DPF embrioni per l&#39;analisi nuoto <ol><li> Se necessario, ordinare embrioni per il genotipo desiderato, ad esempio esaminando espressione di una proteina fluorescente o fenotipo, e posto in una capsula di Petri separata (25-30 embrioni per piastra). In alternativa, il genotipo può essere determinato dopo il completamento del test locomozione. </li><li> A 3 dpf, riesaminare piastre di Petri e rimuovere eventuali embrioni non schiuse e detriti. Rientro capsule di Petri a 28 ° C incubatore fino al 6 dpf. </li><li> Eseguire il test di tutti i ceppi dalle 9 alle 12:00, che è il momento in cui le larve di zebrafish sono più attivi. Casuale l&#39;ordine delle prove e posizione nella pin ritardo di tipo selvatico e mutante campioni per ridurre al minimo gli effetti delle differenze circadiani e altri pregiudizi sperimentale. NOTA: E &#39;importante che il tempo di prova è coerente tra esperimenti perché l&#39;attività può variare notevolmente durante la giornata. </li><li> Almeno 30 minuti prima del test, posto larve in una piastra a 48 pozzetti con una larva per pozzetto. Dopo il trasferimento, riempire i pozzetti in modo che la superficie dell&#39;acqua è appena sotto la parte superiore del pozzo, garantendo l&#39;assenza di bolle. Rientro piastre a 28 ° C incubatore. </li><li> Prendere piastre fuori dell&#39;incubatore e acclimatarsi alla luce per cinque minuti prima del test. </li></ol></li><li> Esecuzione Locomotion Assay <ol><li> Posizionare la piastra a 48 pozzetti nella camera di registrazione, che è dotato di una fotocamera digitale infrarossi, catturare fino a 60 fotogrammi / sec, in modo che le larve può essere rilevata nel buio. Verificare che tutti i pozzetti sono posti all&#39;interno della griglia circolare sul software locomozione e che tutte le larve sono clearly rilevabile. </li><li> Avviare il software e selezionare il modulo &quot;tracking&quot;. In &quot;file&quot; cliccare su &quot;generare nuovo protocollo&quot; e modificare il numero di pozzi utilizzati per l&#39;esperimento. Impostare sia la durata dell&#39;esperimento e il periodo di integrazione per 10 minuti facendo clic su &quot;parametri&quot; menu a discesa e selezionando i &quot;parametri del protocollo&quot; e successivamente la scheda &quot;tempo&quot;. Nella stessa finestra di dialogo &quot;parametri del protocollo&quot; fare clic sulla scheda &quot;Opzioni&quot; e garantire la casella di controllo &quot;Numeriscope&quot; viene cliccato a seguito della quale, la finestra di dialogo &quot;parametri del protocollo&quot; può essere chiuso. </li><li> Per impostare le aree di registrazione evidenziano l&#39;intera griglia e fare doppio clic su uno dei pozzi. Fare clic sul pulsante &quot;disegnare aree&quot; e disegnare intorno in alto a sinistra, in alto a destra, e pozzi in basso a sinistra e fare clic su &quot;Build&quot;, che permette al software di determinare automaticamente la posizione di ogni bene. disegnare anche in una scalabar e clicca su &quot;applica al gruppo&quot;. Una volta completato, clicca sul pulsante &quot;disegnare aree&quot;. </li><li> Visivamente determinare la soglia di rilevazione facendo scorrere la barra &quot;soglia di rilevamento&quot; ad un livello in cui solo i movimenti di pesce sono evidenziate senza segnali di fondo. NOTA: La soglia di rilevamento varierà tra i ceppi, e quindi le soglie devono essere determinate ogni volta che un nuovo ceppo è testato. Nei dati rappresentativi presentati una soglia di rilevamento di 25 mm / sec è stato utilizzato. </li><li> Prima di iniziare il test entrare soglie di movimento per il rilevamento di inattività, e piccoli e grandi movimenti. NOTA: Nei dati rappresentativi presentati una soglia di inattività di 6 mm / sec e un&#39;attività scoppio soglia di 30 mm / sec è stato utilizzato. Le soglie determinano il movimento minimo da considerato attivo e il livello richiesto per essere considerato attività di scoppio e permettono una classificazione di attività in piccoli (attiva ma al di sotto Activi scoppiosoglie ty) e grandi (superiore alla soglia di attività scoppio movimenti). Le soglie possono essere modificati a seconda dell&#39;attività delle particolari ceppi di pesce analizzati. NOTA: Anche se il test può essere effettuato sia in condizioni di luce o buio, larve di pesce zebra hanno dimostrato di essere più attivi nel buio 18. </li><li> Impostare l&#39;intensità della luce all&#39;interno della camera di essere a 0% facendo clic sul pulsante &quot;Impostazioni di guida di luce&quot; sotto i &quot;parametri&quot; menu a discesa. Nella finestra di dialogo risultante, aggiungere le impostazioni di luce necessarie. NOTA: L&#39;intensità della luce all&#39;interno della camera può essere attivato per accendere e spegnere durante il periodo di prova per stimolare l&#39;attività larvale </li><li> Chiudere la porta della camera di registrazione e avviare la registrazione video. </li></ol></li><li> La quantificazione di Nuoto Comportamento <ol><li> Dopo l&#39;esperimento, fare clic su &quot;stop&quot; sotto il &quot;esperimento&quot; menu a discesa. A bo dialogoVerrà visualizzato x con tutti i risultati. </li><li> Per accedere a questi risultati in Excel fare clic su &quot;Apri cartella contenente&quot; e aprire il file di Excel che compare nella cartella risultante. I parametri importanti sono &quot;smlct&quot; (piccolo numero di movimenti), &quot;larct&quot; (grande numero di movimenti), &quot;smldist&quot; (distanza totale coperta dai pesci in piccoli movimenti) e &quot;lardist&quot; (distanza totale coperta dai pesci in grandi movimenti ). NOTA: Dopo la registrazione, il software restituisce anche due file di output aggiuntivi nella forma di un file AVI (contenente un video della registrazione 10 min) e un file di immagine .png (contenente una rappresentazione visiva della locomozione durante la 10- min esperimento; vedi figura 2). </li><li> Una volta che i valori sono calcolati locomozione, riprodurre i file .avi e .png di rivedere se i valori di locomozione calcolati accuratamente raffigurano i movimenti di nuoto del pesce (si veda la Figura3). NOTA: In alternativa usando il software qui descritto, pacchetti come il software ImageJ liberamente disponibili possono essere utilizzati per tenere traccia del comportamento motorio. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+splice+site+mutation+in+laminin-%CE%B12+results+in+a+severe+muscular+dystrophy+and+growth+abnormalities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43794(2012).</li>
<li>Gupta, V., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+%26+Mech%22%5BJournal%5D)">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+BAG3+myofibrillar+myopathy+suggest+a+toxic+gain+of+function+leading+to+BAG3+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).</li>
<li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).</li>
<li>Sztal, T. E., Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+nemaline+myopathy+reveal+a+spectrum+of+nemaline+bodies+contributing+to+reduced+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function.</a> Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).</li>
<li>Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+discovery+and+global+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish.</a> Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).</li>
<li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. , (2005).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. (82), e50925(2013).</li>
<li>Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+measurement+during+contraction+to+assess+muscle+function+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+6-minute+walk+test+as+a+new+outcome+measure+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).</li>
<li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+6-minute+walk+test+and+other+clinical+endpoints+in+duchenne+muscular+dystrophy%3A+reliability%2C+concurrent+validity%2C+and+minimal+clinically+important+differences+from+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study.</a> Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).</li>
<li>Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+of+locomotor+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).</li>
<li>MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+in+larval+zebrafish%3A+Influence+of+time+of+day%2C+lighting+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).</li>
<li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+dominant+ACTA1+disease+recapitulate+human+disease+and+provide+insight+into+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies.</a> Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).</li>
<li>Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ACTA1+mutation+resulting+in+a+severe+congenital+myopathy+with+nemaline+bodies%2C+intranuclear+rods+and+type+I+fibre+predominance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disord%22%5BJournal%5D)">A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance.</a> Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).</li>
<li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).</li>
<li>Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+larval+zebrafish%3A+ontogeny+of+body+waves+and+implications+for+locomotory+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development.</a> J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).</li>
<li>Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonia+congenita-associated+mutations+in+chloride+channel-1+affect+zebrafish+body+wave+swimming+kinematics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics.</a> PLoS ONE. 9 (8), e103445(2014).</li>
<li>Moggio, M., Colombo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disease+heterogeneity%3A+a+prognostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Myol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge.</a> Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti modelli animali diversi, tra cui topi, cani, zebrafish, mosche e vermi hanno contribuito alla nostra comprensione delle basi genetiche e molecolari di malattie muscolari, e assistito allo sviluppo di approcci terapeutici per combatterli. Il pesce zebra vanta diversi vantaggi per lo studio della malattia muscolare. Il zebrafish fornisce un sistema geneticamente manipolabile per valutare complesso patterning muscolare in un ambiente fisiologico, la quale non è possibile in sistemi di coltura in vitro. A differenza di altri modelli animali vertebrati, il gran numero di pesci prodotte, insieme con la sua chiarezza ottica, facilita la rapida, ad alta produttività in chimica vivo e screening genetico. Qui si descrive lo sviluppo di saggi di movimento zebrafish per fornire un alto throughput e metodo automatizzato per valutare le prestazioni dei muscoli durante l&#39;embriogenesi zebrafish. Per entrambi i test si deve riconoscere che i ritmi circadiani estimoli ambientali esterni influenzeranno in modo significativo il comportamento di nuoto zebrafish 17,18. Test ripetuta dello stesso zebrafish anche portare ad assuefazione causando una diminuzione in risposta tattile stimolo 23. Pertanto, al fine di ottenere risultati riproducibili tra esperimenti ogni embrione zebrafish dovrebbe essere testato solo una volta, il tempo delle condizioni di giorno e di illuminazione deve essere standardizzato, e la temperatura dell&#39;acqua deve essere strettamente regolata. Utilizzando il touch evocata analisi a 2 dpf possiamo misurare direttamente l&#39;accelerazione massima di un&#39;azione raffica nuoto, che è proporzionale alla forza muscolare. Tecniche precedenti in zebrafish hanno esaminato la forza muscolare legando entrambe le estremità degli embrioni destinati attrezzature sperimentali a seguito della quale la contrazione del muscolo viene stimolato utilizzando un campo elettrico e la capacità di generare forza del muscolo 14 viene misurata. Mentre questo metodo misura la forza capacità di generazione di tegli muscolare larvale, non misura la forza effettiva generata dal muscolo larvale durante il nuoto. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per valutare indirettamente la forza generata durante il normale movimento natatorio larvale per fornire una valutazione generale della salute dei muscoli. Il sistema video ad alta velocità, in grado di registrare singoli movimenti zebrafish in un frame rate di 1.000 fotogrammi / sec può essere utilizzato per identificare piccole ma significative differenze nella funzionalità muscolare, che non sono direttamente distinguibile ad occhio. Sarà interessante vedere come precedentemente riportato cambiamenti nella stimolato elettricamente vigore generazione correlazione con i cambiamenti nelle prestazioni di nuoto. Inoltre il tocco evocata saggi di risposta possono anche essere utilizzati per valutare la cinematica nuoto, quali la forma e la velocità dell&#39;onda corpo durante il movimento natatorio 24, per dare una misura quantitativa del comportamento locomotorio. A causa del movimento spontaneo di zebraflarve ish dopo 3 dpf, non siamo stati in grado di eseguire le analisi al tocco evocare per misurare la funzione muscolare. Al contrario, abbiamo misurato prestazioni muscolari nel corso di un periodo più lungo per la determinazione della distanza nuotato da larve zebrafish a 6 dpf. Questo test, anche se una misura indiretta della funzione muscolare, può essere utilizzato per identificare i pesci visualizzazione rendimento muscolare alterata 8 o neurodegenerazione 25,26. Questo test non solo fornisce una misura analoga al test del cammino 6 min, ma è adatto anche per automatizzata ad alta produttività in droga o mutagenesi schermi vivo.

Negli ultimi dieci anni zebrafish sono stati utilizzati sempre più per studiare la biologia delle cellule muscolari e le malattie. Lo sviluppo esterna rapida dell&#39;embrione zebrafish, insieme con la sua chiarezza ottica, permette la visualizzazione diretta della formazione muscolare, la crescita, e la funzione. Il processo di sviluppo muscolare è altamente conservata in zebrafish e questo ha permesso la modellazione di successo di una serie di malattie muscolari tra cui distrofie muscolari e miopatie congenite 1-8. Analisi dettagliata dei modelli zebrafish non solo ha fornito nuove intuizioni nella patobiologia di queste condizioni, ma anche fornito una piattaforma per la sperimentazione di terapie adeguate 6,9-13. L&#39;analisi dei modelli zebrafish di malattie muscolari si basa su analisi affidabili e riproducibili per misurare le prestazioni muscolari. Studi precedenti hanno misurato con successo la capacità forza generatrice del muscolo tronco zebrafish nel pesce tra 3 e 7 DPF bystimolando elettricamente contrazione di un pesce immobilizzato collegato a un sistema di forze trasduzione 14. Questo può fornire misurazioni dettagliate di forza, ma non sono l&#39;ideale per esperimenti di throughput più elevati e ci sono vantaggi per la misurazione delle prestazioni muscolari durante il nuoto. Al 2 dpf zebrafish muscolare è completamente funzionale e il pesce può suscitare movimenti scoppio di nuoto in risposta agli stimoli. Il test di risposta di fuga touch-evocare viene utilizzato per misurare l&#39;accelerazione durante un movimento raffica nuoto, che può essere usato come una misura della forza contrattile. Una delle misure più utilizzate della funzione muscolare nei pazienti miopatia è il test del cammino di 6 minuti, che registra la distanza totale camminato su una superficie piatta e dura 15,16. Abbiamo applicato un test simile per misurare la funzione muscolare in 6 dpf larve di pesce zebra, per cui monitoriamo la distanza totale nuotato, e il numero totale di movimenti effettuati da ciascun larva in un periodo di 10 min. Questa operazione viene eseguitautilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio, che fornisce misurazioni affidabili e ad elevato throughput di prestazioni muscolari. Entrambi i test muscolari sono altamente riproducibili e sono stati utilizzati per quantificare le differenze di prestazioni muscolari nei modelli miopatia zebrafish 8.

<table><tbody><tr><td>21 G x 1' Ago smussato</td><td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td><td>TE2125</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 48 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>M8937</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 90 mm Prodotti</td><td>da laboratorio Pacific Laboratory PT</td><td>S90001</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera ad alta velocità</td><td>Baumer</td><td>HXC20</td><td></td></tr><tr><td>http://www.randomization.com</td><td>N/A</td><td></td><td>Passi 1.1.2, 2.1.3</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TEI-43L</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in plastica</td><td>VWR</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>StreamPix5</td><td>NorPix</td><td></td><td>Passaggio 1.2.3</td></tr><tr><td>Unità di controllo della temperatura</td><td>Pinzette Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, stile 8</td><td>ProSciTech</td><td>T04-821</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox System</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Passi</td><td>1.3.1, 2.2.1</td> di Zebralab <td>Viewpoint</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in zebrafish

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

lo sviluppo muscolare zebrafish è altamente conservata con i sistemi di mammiferi che li rende un ottimo modello per studiare la funzione muscolare e le malattie. Molti miopatie che influenzano la funzione del muscolo scheletrico possono essere rapidamente e facilmente valutati in zebrafish nel corso dei primi giorni di embriogenesi. Con 24 ore di post-fecondazione (HPF), di tipo selvatico zebrafish spontaneamente contrarre i muscoli della coda e del 48 HPF, comportamenti di nuoto mostrano controllato zebrafish. Riduzione della frequenza di o altre alterazioni, questi movimenti possono indicare una disfunzione muscolo scheletrico. Per analizzare il comportamento di nuoto e valutare l&#39;andamento del muscolo nei primi mesi di sviluppo zebrafish, utilizziamo entrambi i test di risposta e di locomozione di fuga al tocco evocato. saggi di risposta di fuga touch-evocati possono essere utilizzati per valutare le prestazioni dei muscoli durante i movimenti breve scoppio risultante dalla contrazione delle fibre muscolari a contrazione rapida. In risposta ad uno stimolo esterno, che in questo caso è un rubinettola testa, di tipo selvatico zebrafish a 2 giorni dopo la fecondazione (DPF) di solito presentano una potente nuotata raffica, accompagnato da curve strette. Il nostro metodo quantifica funzione del muscolo scheletrico misurando l&#39;accelerazione massima durante un movimento raffica nuoto, l&#39;accelerazione essendo direttamente proporzionale alla forza prodotta dalla contrazione muscolare. Al contrario, saggi di locomozione durante precoce sviluppo larvale zebrafish sono utilizzati per valutare le prestazioni dei muscoli durante lunghi periodi di attività muscolare. Utilizzando un sistema di monitoraggio per monitorare il comportamento nuoto, otteniamo un calcolo automatico della frequenza di attività e distanza in 6 giorni old zebrafish, riflettente della loro funzione muscolare scheletrico. Le misurazioni delle prestazioni nuoto sono preziose per la valutazione fenotipica dei modelli di malattia e di high-throughput screening di mutazioni o trattamenti chimici che interessano la funzione del muscolo scheletrico.

Tocco evocata test di risposta può essere utilizzato per determinare la velocità e l&#39;accelerazione dei movimenti di nuoto che è una misura proporzionale della forza muscolare. In risposta ad uno stimolo meccanico, come un piccolo colpetto sulla testa 2 dpf tipo presentano zebrafish selvaggio un nuoto veloce. Video sono stati catturati e analizzati per due diversi modelli di zebrafish miopatia: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), un modello di miopatia nemalinica che ha dimostrato di avere un notevole debolezza muscolare, e un modello di distrofia muscolare di Duchenne, in cui sono stati descritti difetti muscolari gravi a 5 dpf 19,20. Immagini da un video di un tocco tipico evocati test sono rappresentati in figura 1A. Accelerazione del pesce zebra è stato esaminato e giudicato picco nella prima 0,2 sec della risposta raffica di nuoto di fuga (Figura 1B). Questa accelerazione massima di picco fornisce una misura proporzionale alla forza gcapacità del muscolo scheletrico enerating. I valori massimi di accelerazione sono stati mediati per ottenere un valore medio accelerazione massima (± errore standard della media) per ogni ceppo: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): media = 276,0 ± 28,8 m / sec 2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti che comprende 15 esemplari; Controllo di tipo selvatico: media = 500,8 ± 50.28 m / sec 2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 15 esemplari; DMD PC2 - / - mutante: media = 249.9 ± 19.1 m / sec 2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 12-19 esemplari; DMD PC2 +/- eterozigote: media = 235,9 ± 8,7 m / sec 2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 16-27 singolo pesce; DMD omozigoti PC2 + / + di tipo selvatico: media = 230,9 ± 8,7 m / sec 2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 8-27 singoli pesci (Figura 1C). Come previsto, il Tg (D286 ACTA1G -eGFP) pesci sono stati trovati ad avere una diminuzione significativa accelerazione massima indicando ridotta funzione muscolare, che è coerente con modelli di topo e dati dei pazienti 8,21,22. La DMD PC2 - / - pesce mutante però, non ha mostrato alcuna differenza nella massima accelerazione, a 2 DPF, in linea con la rilevazione dei difetti muscolari da 3 dpf 20 (Figura 1D). saggi locomozione sono stati eseguiti a 6 dpf per determinare l&#39;attività e la distanza swum da ceppi zebrafish come un&#39;indicazione del rendimento muscolare. Dopo il test, una rappresentazione schematica dei movimenti nuoto nel periodo di prova di dieci minuti è stata generata, con linee rosse e verdi che rappresentano rispettivamente i periodi di movimento lento e veloce e linee nere rappresentano i periodi di inattività (Figura 2). Individuale di tipo selvatico spettacolo zebrafish alta attività relativamente senza periodi di inattività come opposed al Tg (ACTA1 D286G -eGFP) i pesci, che sono meno attivi durante il periodo di prova (Figura 2B). Il comportamento di nuoto è stata quantificata la media dei valori individuali del numero di movimenti e swum distanza per ogni pesce (Figura 3). Entrambi, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) pesce (Figura 3A e 3B) e DMD PC2 - / - pesce mutante (Figura 3C e 3D) sono stati trovati ad avere una significativa diminuzione del numero medio di movimenti e la distanza nuotato rispetto al loro rispettivo controlli: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) pesce: numero medio di movimenti = 94,3 ± 13,6, distanza media nuotato = 112,9 ± 18,4 millimetri, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 45 pesci; controlli di tipo selvatico: numero di movimenti = 177.4 ± 14.0 significano, distanza media nuotato = 300.2 ± 22,8 millimetri, n = 3 r indipendentiesperimenti eplicate comprende 45 pesci; DMD PC2 - / - mutanti: numero di movimenti = 163.3 ± 30.0 dire, distanza media nuotato: 298,4 ± 60,37 millimetri, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 12-20 pesce; DMD PC2 +/- eterozigote: numero medio di movimenti = 362,3 ± 38,8, distanza media nuotato: 660,3 ± 86,1 millimetri n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 17-27 pesce; DMD omozigoti PC2 + / + di tipo selvatico: numero medio di movimenti = 341,9 ± 91,6, distanza media nuotato = 574,3 ± 170,9 millimetri n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 8-25 pesce. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> Figura 1:. Quantificazione di touch-evocano test di risposta per 2 dpf zebrafish embrioni immagini (A) un&#39;istantanea di un pesce zebra controllo durante touch-evocare test a 2 dpf. (B) del profilo di accelerazione per la prima 0.2 sec di unsingolo Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (rosso) e singolo controllo (blu) zebrafish a seguito dell&#39;applicazione del touch stimolo. L&#39;accelerazione massima è rappresentato dalle linee tratteggiate. (C, D) Quantificazione della accelerazione massima (m / sec 2) registrati da saggi di risposta al tocco evocato di (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafish e (D) PC2 DMD - / - pesce mutante rispetto al controllo zebrafish a 2 dpf. Le barre di errore rappresentano ± SEM per 3 esperimenti replicati, * p &lt;0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> Figura 2:. La rappresentanza dei test di locomozione per embrioni di zebrafish (A) zebrafish embrioni sono posti in piastre da 48 pozzetti e locomozione è registrato dall&#39;alto con una fotocamera digitale infrarossi. (B) Schema di movimento pesce zebra durante il periodo di prova con linee rosse raffigurante movimenti veloci, linee verdi che rappresentano movimenti lenti e linee nere raffiguranti inattività (come determinato dalle soglie di rilevazione inseriti nel software). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> Figura 3:. Quantificazione dei saggi di locomozione per 6 dpf zebrafish larve quantificazione del (A) numero di movimenti e (B) distanza percorsa dal Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafish rispetto ai controlli zebrafish a 6 dpf.La quantificazione della (C) numero di movimenti e (D) distanza percorsa dalla DMD PC2 - / - pesce mutante rispetto al controllo zebrafish a 6 dpf. Le barre di errore rappresentano ± SEM per 3 esperimenti replicati, * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

I pesci zebra sono un modello eccellente per studiare la funzione muscolare e le malattie. Durante l'embriogenesi precoce, il pesce zebra inizia contrazioni muscolari regolari producendo un comportamento ritmico di nuoto, che viene alterato quando il muscolo viene interrotto. Qui descriviamo una risposta evocata al tatto e un saggio di locomozione per esaminare le prestazioni di nuoto come misura della funzione muscolare.

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le prestazioni e la funzionalità muscolare nel pesce zebra mediante test di risposta al tocco e test di nuoto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo della ricerca neuro-muscolare, ad esempio identificando alterazioni delle prestazioni muscolari o difetti neurodegenerativi in modelli di pesce zebra malati. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo automatizzato ad alto rendimento per valutare le prestazioni muscolari in modelli di pesce zebra affetti da malattia.Per eseguire il saggio, posizionare una piastra di Petri riempita con circa 25 millilitri di mezzo per embrioni su un palco illuminato e a temperatura controllata impostato a circa 28 gradi Celsius. Montare la telecamera ad alta velocità sopra la piastra. Avviare il software di registrazione video e impostare la velocità di acquisizione a 1.000 fotogrammi al secondo per garantire che possano essere catturate velocità di nuoto elevate.Posizionare l'embrione al centro della piastra di Petri in modo che sia chiaramente visibile nel campo visivo. Premere Registra quindi applicare uno stimolo meccanosensoriale toccando delicatamente l'embrione con un ago smussato sulla sommità della testa. Interrompere la registrazione una volta che l'embrione ha nuotato fuori dal campo visivo o è tornato a riposo.Ripetere il test sugli stessi larvi potrebbe indurre abituazione o favorire un indebolimento muscolare in alcuni modelli malati, con conseguente riduzione della risposta allo stimolo tattile; pertanto, ogni embrione deve essere testato una sola volta. Per quantificare il comportamento nuotatorio, avviare il software e selezionare "locomozione singolo larva" con il nostro modulo di sottrazione dello sfondo per aprire il file video AVI. Selezionare lo strumento a mano libera o lo strumento poligono dalla barra del menu e definire l'area del filmato che comprende sia la posizione iniziale del pesce sia la zona in cui nuota, escludendo la sonda utilizzata per applicare lo stimolo meccanosensoriale.Fare clic su Esperimento nella barra del menu e selezionare Esegui. Nella finestra di dialogo, salvare il file di analisi dei dati grezzi in formato PHR nella posizione desiderata. Successivamente, fare clic su Avvia per iniziare l'analisi.Dopo che il pesce è uscito dal campo visivo o il video è terminato, concludere l'analisi facendo clic su Stop nel menu Esperimento e apparirà una finestra con i risultati. Scorrere verso destra nella finestra per ottenere il valore massimo di accelerazione. Esportare i dati facendo clic sul pulsante Esporta risultati istantanei nel menu a discesa Risultati.Selezionare il file appropriato di analisi dei dati grezzi e fare clic per aprirlo. Verrà salvato un file di testo nella cartella di destinazione, apribile con un programma per fogli elettronici. Posizionare le larve da sottoporre a test in una piastra a 48 pozzetti, una per pozzetto.Successivamente, riempire le pozzette con acqua fino appena sotto il bordo superiore, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria. Conservare le piastre a 28 gradi Celsius per un'ora. Posizionare la piastra in una camera di registrazione dotata di una telecamera digitale a infrarossi in grado di rilevare le larve al buio.I ritmi circadiani e gli stimoli ambientali esterni possono influenzare in modo significativo il comportamento natatorio del pesce zebra. L'orario della giornata e le condizioni di illuminazione devono essere standardizzati, e la temperatura dell'acqua deve essere rigorosamente regolata. Avviare il software e selezionare il modulo di tracciamento.Sotto File, fare clic su Genera nuovo protocollo e modificare il numero di pozzetti utilizzati per l'esperimento, che in questo esempio è 48. Successivamente, fare clic su Parametri e selezionare Parametri del protocollo, quindi Tempo per impostare la durata dell'esperimento e il periodo di integrazione a 10 minuti. Sempre in Parametri del protocollo, fare clic su Opzioni e assicurarsi che la casella di controllo numeroscopio sia selezionata.Per impostare le aree di registrazione, evidenzia l'intera griglia e fai doppio clic su una delle pozzette. Clicca sul pulsante Disegna Aree e traccia intorno alle pozzette in alto a sinistra, in alto a destra e in basso a sinistra, quindi clicca su Crea. Il software determinerà quindi la posizione di ciascuna pozzetta.A questo punto, disegnare anche la barra della scala e fare clic su Applica al gruppo. Al termine, fare clic sul pulsante Disegna aree. Successivamente, selezionare il colore del pesce, in questo caso nero, e spostare la barra della soglia di rilevamento a un livello in cui vengono evidenziati solo i movimenti del pesce, senza sfondo.Impostare le soglie di movimento per il rilevamento dell'inattività e dei movimenti piccoli e ampliati. In questo esempio, è stata utilizzata una soglia di inattività di sei millimetri al secondo e una soglia di attività improvvisa di 30 millimetri al secondo. Fare clic sul menu Parametri, quindi su Impostazioni di stimolazione luminosa e impostare l'intensità della luce nella camera al 0%. Chiudere la porta della camera di registrazione e avviare la registrazione video.L'esperimento sarà completato in 10 minuti, come indicato dal timer sullo schermo. Al termine, fare clic sul menu a discesa Esperimento e selezionare Arresta. Verrà visualizzata una finestra di dialogo con i risultati.Per esaminare i risultati utilizzando Excel, fare clic su Apri cartella contenente e aprire il file che appare nella cartella risultante. Infine, il video può essere riprodotto per verificare se i valori di locomozione registrati rappresentano accuratamente i movimenti nuotati del pesce. Questo può essere ottenuto confrontando il movimento osservato nel file video con il profilo di locomozione generato dal software.Immagini istantanee di un embrione di pesce zebra acquisite durante un saggio di risposta al tocco mostrano il movimento tipico di un individuo nei primi 0,2 secondi successivi all'applicazione dello stimolo. Qui, la figura mostra un profilo di accelerazione per i primi 0,2 secondi della risposta di fuga natatoria a scatto in individui di tipo selvatico rispetto a individui miopatici. L'accelerazione ha mostrato un picco in entrambe le linee genetiche in questa finestra temporale e l'accelerazione massima al picco è proporzionale alla capacità generatrice di forza del muscolo scheletrico.I valori massimi di accelerazione sono stati mediati per i ceppi di tipo selvaggio e miopatici. I pesci miopatici hanno mostrato una significativa riduzione dell'accelerazione massima, indicativa di una funzione muscolare compromessa. Saggi di locomozione di 10 minuti effettuati su embrioni hanno registrato i modelli e i tipi di movimento sia degli embrioni di tipo selvaggio che di quelli miopatici, generando rappresentazioni schematiche dei movimenti nuotatori.I periodi di movimento lento, rappresentati da linee verdi, e di movimento rapido, rappresentati da linee rosse, sono stati mappati, così come i periodi di inattività rappresentati da linee nere. Gli individui di tipo selvatico hanno mostrato livelli di attività elevati con periodi di inattività relativamente assenti, a differenza degli individui miopatici che sono risultati meno attivi durante il periodo di osservazione. Ciò si è riflesso in differenze significative nei numeri medi di movimenti e nella distanza percorsa tra i pesci di tipo selvatico e quelli miopatici.Una volta acquisita padronanza, il saggio della risposta evocata dal contatto può essere eseguito in 15 minuti per 15 pesci e i saggi di locomozione possono essere completati in circa 10 minuti per un massimo di 48 pesci. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante manipolare con attenzione gli embrioni poiché ciò potrebbe influenzarne l'attività. Dopo questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche come l'immunomarcatura o la microscopia elettronica per rispondere a ulteriori domande relative alla patologia muscolare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la performance muscolare nelle prime fasi dello sviluppo del pesce zebra.

using-touch-evoked-response-locomotion-assays-to-assess-muscle

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo sviluppato il Visual-Motor risposta per quantificare la potenza del motore di zebrafish larvale in risposta alla luce incrementi e decrementi. Abbiamo anche esaminato visione zebrafish mutanti, tra cui la non optocinetico risposta (NRC) mutanti, che si pensava essere completamente cieco quando testato da un altro saggio di visione, il riflesso optocinetica.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Questo video descrive il test di risposta all'evocazione tattile, che misura la risposta della larva di pesce zebra agli stimoli tattili.

Escape Response Assay: un metodo per studiare la risposta della larva di zebrafish agli stimoli tattili

Il video descrive l'evitamento e il test della tigmotassi delle larve di pesce zebra. Il video esamina il comportamento delle larve di pesce zebra in risposta a uno stimolo visivo avversivo.

Saggio di evitamento e tigmotassi del pesce zebra: un metodo ad alto rendimento per esaminare il comportamento larvale in risposta a uno stimolo visivo avversivo

Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

Misure di forza possono essere utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella funzione muscolare a causa di sviluppo, infortunio, malattia, trattamento o tossicità chimica. In questo video, dimostriamo un metodo per misurare la forza durante una contrazione massimale di zebrafish muscolare tronco larvale.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Il pesce zebra è ora uno strumento consolidato e potente per modellare distrofie muscolari, miopatie congenite e malattie neuromuscolari correlate. La birifrangenza e il comportamento di fuga evocato dal tatto sono due comuni test non invasivi utilizzati per determinare il grado di disorganizzazione muscolare e compromissione locomotiva degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo precoce.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Capace di recupero funzionale dopo lesioni del midollo spinale, il pesce zebra adulto è un sistema modello premier per chiarire i meccanismi innati di rigenerazione neurale. Qui, descriviamo la resistenza al nuoto e i saggi di comportamento del nuoto come letture funzionali della rigenerazione del midollo spinale.

Valutazione della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto

La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Impara a valutare le prestazioni muscolari in Danio rerio utilizzando saggi di risposta al tocco e locomozione. Questo metodo automatizzato consente analisi ad alto rendimento per studiare funzioni neuro-muscolari.

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish (Video) | JoVE Journal

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

Esplora altri video