Infezione di apparato urinario in un modello animale piccolo: cateterizzazione transuretrale di topi maschi e femmine

L'obiettivo generale di questo approccio sperimentale è quello di studiare la risposta immunitaria all'infezione del tratto urinario e di prevenire il confronto diretto tra animali maschi e femmine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave dell'immunologia della mucosa relative al modo in cui maschi e femmine rispondono alle infezioni del tratto urinario. Il vantaggio principale è che l'infezione si stabilisce attraverso la radice naturale.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo dopo aver notato quanto spesso si afferma che l'installazione della vescica dei topi maschi è impossibile. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulle infezioni del tratto urinario, può essere applicato anche ad altri studi sulla malattia, come il cancro alla vescica. Per iniziare, preparare una cannula pediatrica per l'accesso endovenoso per ogni gruppo di topi da infettare.

Utilizzando il meccanismo a molla integrato, spogliare ogni cannula del suo ago come indicato dal produttore. Scartare gli aghi, conservando solo la cumula in plastica per via endovenosa. Sterilizzare i cateteri in una cappa a flusso laminare per un ciclo UV di circa 25-30 minuti.

Dopo essere passati in coltura notturna di e coli uropatogeni, o UPEC, secondo il protocollo di testo, centrifugare la sospensione batterica in una microcentrifuga da tavolo a 17.000 volte g per un minuto e risospendere il pellet batterico risultante a due volte 10 all'ottavo CFU per millilitro in PBS. Diluire in serie un'aliquota di sospensione e, se necessario, impiattare l'agar LB con antibiotici, per determinare l'inoculo esatto per ogni infezione. Aspirare l'inoculo batterico in una siringa da un millilitro e collegare il catetere all'estremità della siringa.

Picchiettare la siringa per rimuovere l'aria e premere lo stantuffo per riempire lo spazio d'aria morta nel catetere prima di iniziare l'instillazione. Dopo aver anestetizzato una femmina di topo secondo un protocollo approvato, posizionare l'animale supino e applicare una pressione media sul basso addome per svuotare la vescica dall'urina. Le vesciche piene si sentono come un pisello sotto la pelle, tra le creste iliache.

Quando la vescica è vuota, usando la mano non dominante, posizionare il pollice sulla coda e un dito della stessa mano sull'addome del topo e applicare una leggera pressione in direzioni opposte per tenere il mouse saldamente in posizione. Quindi, posizionare la punta del catetere perpendicolarmente al topo in corrispondenza dell'orifizio uretrale, quindi, con una leggera pressione, far scorrere il catetere nell'uretra fino a quando il mozzo incontra l'orifizio uretrale, abbassando contemporaneamente la siringa in modo che sia parallela alla superficie di lavoro. Una volta posizionato il catetere, utilizzare un dito della mano non dominante che è appoggiata sull'addome del topo per tirare molto delicatamente la pelle addominale verso la testa del topo.

Si noti che l'orifizio uretrale non si muove. Tuttavia, se il catetere si trova nella vagina, il tessuto si sposterà verso l'alto e si allontanerà dal catetere. Con il mozzo del catetere contro l'orifizio uretrale, erogare lentamente 15 microlitri di inoculo batterico.

Una velocità di installazione lenta riduce al minimo il reflusso vescico-ureterale nel rene. Rimuovere lentamente il catetere per evitare perdite. Quindi posizionare l'animale nella sua gabbia in posizione supina.

Per inoculare i topi maschi, posizionare due pinze per il pollice cranialmente e caudalmente ai genitali esterni dei topi. Ritrarre il prepuzio per esporre completamente il pene della ghiandola. Quindi, una volta posizionato esternamente il pene, rilasciare la pinza per il pollice.

Riposizionare la pinza per stabilizzare il pene sporgente perpendicolarmente all'animale, tenendo l'organo delicatamente ma teso. Quindi, attraverso la piccola apertura nella punta del meato uretrale, introdurre con cura il catetere e guidarlo delicatamente nel pene usando una pinza per mantenere delicatamente la tensione. Una volta che il mozzo dei cateteri incontra la punta del pene, erogare molto lentamente 50 microlitri di inoculo, mantenendo la posizione del pene.

Prendere nota della qualità dell'instillazione in base a un punteggio di qualità dell'instillazione predeterminato, come quello mostrato qui. Ritrarre lentamente il catetere per cinque secondi per evitare perdite dall'inoculo. Posiziona il mouse nella sua gabbia in posizione supina.

L'animale dovrebbe iniziare a riprendersi da 30 a 45 minuti dopo la somministrazione dell'anestetico. Dopo aver sacrificato i topi secondo un protocollo approvato, utilizzare il 70% di Epinal per inumidire accuratamente l'addome per ridurre al minimo la contaminazione da parte del pelo. Usando le forbici, praticare un'incisione di due centimetri attraverso il terzo inferiore dell'addome del topo e rimuovere asetticamente la vescica e qualsiasi altro organo desiderato.

Trasferire gli organi in provette da cinque millilitri in polipropilene con tappo a scatto, contenenti un millilitro di PBS sterile e tenere tutti i campioni in ghiaccio. Con un omogeneizzatore portatile, omogeneizzare gli organi fino a quando non rimane quasi più tessuto solido. Scartare il tessuto adiposo lucido, beige-bianco, che non si omogeneizza bene.

Quindi, utilizzare Epinal, seguito da PBS per lavare l'omogeneizzatore tra ogni gruppo sperimentale o di organi. Dopo aver preparato diluizioni seriali di sospensione d'organo omogeneizzata, diluizioni su piastre di agar LB, con antibiotici quando appropriato, e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Per eseguire la citometria a flusso sul tessuto vescicale, dopo aver isolato la vescica come dimostrato in precedenza in questo video, utilizzare le forbici per tritare bene il tessuto.

Aggiungere una vescica tritata per ogni provetta contenente il tampone di digestione. Quindi agitare il tubo per lavare il tessuto tritato nel tampone di digestione e tenerlo in ghiaccio fino a quando tutte le vesciche non sono state sezionate e tritate. Incubare le vesciche tritate a 37 gradi Celsius, per 60-75 minuti agitando vigorosamente a mano per cinque secondi, ogni 15 minuti.

Quando il fazzoletto ha un aspetto vetroso e trasparente, simile alla carta velina bagnata, la digestione è completa. Inattivare gli enzimi della digestione aggiungendo due o tre millilitri di tampone per citometria a flusso ghiacciato e mescolare delicatamente. Quindi posizionare i tubi sul ghiaccio.

Per garantire una sospensione unicellulare e per rimuovere l'eventuale tessuto connettivo, far passare il contenuto della provetta attraverso un filtro da 100 micrometri posto in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, con l'estremità di uno stantuffo della siringa, premere delicatamente il tessuto rimanente attraverso il filtro. Lavare il filtro con altri due millilitri di tampone per citometria a flusso e mantenere i campioni in ghiaccio.

Lavare i campioni mediante centrifugazione a 200 volte g e quattro gradi Celsius, per sette minuti. Risospendere i pellet in 100 microlitri di tampone per citometria a flusso contenente blocco Fc, diluito a cinque microgrammi per millilitro, e trasferirli in una piastra di fondo rotonda da 96 pozzetti. Dopo 10-15 minuti, aggiungere 100 microlitri del cocktail di anticorpi desiderato a ciascun campione.

Quindi incubare i campioni su ghiaccio al riparo dalla luce per 30-45 minuti. Lavare i campioni mediante centrifugazione a 200 volte g e quattro gradi Celsius per sette minuti. Infine, risospendere i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone per citometria a flusso e far passare i campioni attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri su una provetta di polistirene da cinque millilitri, appena prima dell'acquisizione su un citometro a flusso.

Questa figura mostra i dati rappresentativi dei topi infettati per 24 ore. La carica batterica era equivalente tra topi maschi e femmine a 24 ore dopo l'infezione. Per determinare se la perdita di inoculo al momento dell'infezione ha influito sull'instaurazione dell'infezione, ogni instillazione è stata valutata su una scala da uno a cinque, dove una è la più ottimale.

La colonizzazione batterica è stata determinata 24 ore dopo l'infezione. Non sono state riscontrate differenze statisticamente significative tra i CFU ottenuti da animali con punteggi di instillazione diversi, valutati mediante un test di Kruskal-Wallis non parametrico, confrontando il rango medio di ciascuna colonna con il rango medio di ogni altra colonna e correggendo per confronti multipli utilizzando un test di Dunn. Si può concludere che le instillazioni non ottimali, con conseguente perdita sostanziale di inoculo batterico durante l'infezione, non hanno un impatto significativo sulla colonizzazione batterica a 24 ore.

È importante sottolineare che la frequenza dell'instillazione non ottimale diminuirà con la pratica. Infine, mentre il numero di cellule immunitarie CD45 positive, presenti negli animali naïve non era diverso tra topi femmine e maschi, c'era un aumento statisticamente significativo dell'infiltrazione nelle vesciche dei topi femmine infette. Durante il tentativo di cateterismo, è importante utilizzare movimenti lenti e delicati.

Con il suo sviluppo, questa tecnica ci ha aiutato a esplorare le differenze basate sul sesso nell'immunità nella vescica di animali maschi e femmine.