Name: Murino tendine flessore Lesioni e Chirurgia riparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Impara la chirurgia di riparazione del tendine flessore murino per studiare la formazione di tessuto cicatriziale e identificare bersagli terapeutici nel processo di guarigione cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla Società Americana di Chirurgia della Mano Pilot Award e NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (a AEL) e NIAMS / NIH P30AR061307.

Il Comitato Università per la ricerca degli animali presso l&#39;Università di Rochester ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali. Dieci-12 settimane vecchio C57BL femmina / 6J sono stati utilizzati. 1. Preparazione degli animali per la chirurgia del tendine flessore (~ 15 min) <ol><li> strumenti chirurgici autoclave per sterilizzare, indossare guanti sterili in tutto, e mantenere un campo operatorio sterile. </li><li> Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (ip) con un volume di ketamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) corrispondenti al peso corporeo. Confermare la profondità della sedazione via dell&#39;assenza di toe-pinch reflex. </li><li> Somministrare l&#39;analgesia preventiva (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg) per via sottocutanea. Applicare una pomata oftalmica per evitare che gli occhi si secchi. </li><li> Preparare il sito chirurgico dal ritaglio della pelliccia sull&#39;intero arto posteriore. Sterilizzare la pelle con il lavaggio in sequenza con povidone iodio, seguito dal 70% di etanolo, e di nuovo con povidone iodio. </li></ol><ol><li> Trova il tendine flessore lungo delle dita (FDL), visto superficialmente nella parte mediale del polpaccio. Usando un bisturi, fare una piccola 0,5-1 cm incisione nella pelle con micro-forbici per esporre il tendine. </li><li> Utilizzare pinze per separare il tendine FDL dal tessuto circostante e risalire fino al bivio miotendinea. Tagliare il tendine a questo incrocio con le forbici a molla per rilasciarlo, avendo cura di evitare l&#39;arteria tibiale posteriore. </li><li> Chiudere la pelle con 5-0 punti di sutura in nylon. Nota: La transezione e riparazione (punti 2,4) FDL devono essere eseguiti utilizzando uno stereomicroscopio. </li><li> Eseguire un&#39;incisione 3 millimetri sopra l&#39;aspetto postero della zampa posteriore con molle micro-forbici. ritrarre delicatamente il tessuto molle circostante e muscolare con una pinza, facendo in modo di ridurre al minimo i danni ai tessuti, e identificare il tendine FDL. <ol><li> Delicatamente sollevare il tendine FDL e completamente transetto utilizzando micro-forbici. Suturare le estremità del tendine FDL insieme in un modello Kessler modificato con 8-0 suture, evitando l&#39;essiccazione del tendine bagnando periodicamente con soluzione salina. </li><li> Sostituire tessuti molli e muscoli sopra il tendine, quindi chiudere l&#39;incisione con 5-0 punti di sutura in nylon. </li></ol></li><li> Posizionare topi su un vetrino più caldo insieme a 37 ° C, per mantenere la temperatura corporea fino recuperato da anestesia. </li><li> Monitorare topi post-operatoria per i segni di deterioramento o infezione tra cui una maggiore vocalizzi e pelliccia arruffata. Iniettare buprenorfina (50 ml / mouse) come analgesico ogni 12 ore fino a quando i topi mostrano più segni di dolore o disagio. </li><li> Consentire topi per guarire per un periodo di 10 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico prima di proseguire per i prossimi passi. Nota: Le celle possono essere raccolte in qualsiasi momento-punto di post-intervento chirurgico. Qui, 10 giorni sono scelti per questi esperimenti rappresentativi indicati relativamente elevata cellularità del tessuto in questo momento. </li></ol> 3. Labeling di cellule proliferanti (~ 10 min) <ol><li> Preparare EdU (5-etinil-2&#39;deoxyuridine) soluzione (10 mg / ml in soluzione salina tamponata sterile fosfato [PBS] + 1% Dimetilsolfossido [DMSO] per aumentare la solubilità). </li><li> Iniettare topi con 100 microlitri EdU (50 mg / kg) mediante iniezione ip 24 ore prima del sacrificio. </li></ol> 4. Celle di raccolta per citologia centrifugazione (2,5 ore, ~ 30 minuti Hands-on Time) <ol><li> Preparare 3 mg / ml di collagenasi I in PBS. </li><li> Euthanize mouse mediante anidride carbonica asfissia con una portata non superiore 3 L / min, ed eseguire dislocazione cervicale come misura secondaria. </li><li> Individuare il tendine riparato con passo 2.4, e isolare tessuto tendineo tagliando circa 2 mm su entrambi i lati del sito della lesione con micro-forbici. <ol><li> tessuto Mince con bisturi in una capsula di Petri con 1 ml di 3 mg / ml di collagenasi, quindi passare la miscela attraverso un 18 ago G più volte per rompere il tessuto. Raccogliere composto in una provetta da 1,5 ml centrifuga. </li&gt; <li> Digest tessuto tendineo per 1 ora a 37 ° C con agitazione. </li><li> Spin tessuto verso il basso (300 xg per 5 min), aspirare collagenasi, quindi risospendere le cellule / tessuti con albumina 500 microlitri 3% di siero bovino (BSA) in PBS pipettando su e giù diverse volte. </li><li> sospensione cellulare filtro attraverso un colino cella di 70 micron per rimuovere i detriti e grossi pezzi di tendine, e mettere da parte in un incubatore a 37 °. </li><li> Mettere tessuto tendineo in un&#39;altra provetta da centrifuga da 1,5 ml, e aggiornare con 1 ml di soluzione di collagenasi, pipettando su e giù per mescolare. </li><li> Incubare tessuto un&#39;altra ora a 37 ° C con agitazione. </li><li> Spin down tessuto tendineo digerito (300 xg per 5 min), poi risospendere in 500 microlitri 3% BSA in PBS pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Filtrare sospensione cellulare attraverso un colino cella di 70 micron, si combinano con sospensioni isolato in 4.3.3, poi contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Lavare le cellule ancora una volta con 3% BSA in PBS, poi risospendere per 3-6x 10 4/100 microlitri. </li></ol></li><li> Fissare un imbuto citologia a una diapositiva carica positiva e bloccare nel supporto scorrevole. Inserire l&#39;intero apparato in una centrifuga citologico e aggiungere sospensione cellulare 100 microlitri all&#39;imbuto. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti per disperdere le cellule al vetrino. </li></ol> 5. Immunocitochimica per rilevare EdU (2 ore, ~ 45 min Hands-on Time) Nota: Tutte le fasi di incubazione devono essere eseguiti al buio per limitare photobleaching di fluorofori. <ol><li> cellule di cerchio con una penna barriera idrofobica per minimizzare soluzione necessaria per i seguenti passaggi, quindi fissare immediatamente con 150 microlitri 3% paraformaldeide in PBS 15 min a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Lavare due volte per 5 minuti con 150 microlitri 3% BSA in PBS. </li><li> cellule permeabilize con 0,5% Triton-X 100 in PBS 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio come al punto 5.1.1. </li></ol></li><li> Preparare EdU cockt reazioneail secondo le istruzioni del kit non più di 30 minuti prima dell&#39;uso. <ol><li> Aggiungere cocktail 150 microlitri per ogni diapositiva, incubare 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio come al punto 5.1.1. </li></ol></li><li> Incubare con 150 ml di contrasto nucleare Hoechst33342 diluito 1: 2000 in PBS 30 minuti a temperatura ambiente. <ol><li> Lavare due volte per 5 minuti con 150 ml PBS 1X. </li></ol></li><li> Aggiungere 1-2 gocce medie a celle di montaggio anti-sbiadimento, poi lentamente vetrino inferiore per evitare bolle. <ol><li> Lasciare mezzo di montaggio per curare una notte al buio a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare smalto trasparente per sigillare il coprioggetto alla diapositiva. </li></ol></li><li> Le diapositive di immagini a 40X con lo zoom utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri di eccitazione / emissione in grado di rilevare DAPI (Hoeschst33342) e Texas Red (Alexa Fluor 594). </li></ol>

<ol><li>Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+tendon+inury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of tendon inury and repair.</a> J Biomech. 37, 865-877 (2004).</li>
<li>Strickland, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+flexor+tendon+surgery%3A+twenty-five+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+%5BAm%5D%22%5BJournal%5D)">Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress.</a> J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).</li>
<li>Bunnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+tendons+in+the+fingers+and+description+of+two+new+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments.</a> Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).</li>
<li>Aydin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stage+flexor+tendoplasty+in+the+treatment+of+flexor+tendon+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop+Traumatol+Turc%22%5BJournal%5D)">Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries.</a> Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).</li>
<li>Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+chemotaxis+after+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Fibroblast chemotaxis after tendon repair.</a> J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).</li>
<li>Lundborg, G., Rank, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+intrinsic+healing+of+flexor+tendons+based+upon+synovial+fluid+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition.</a> J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).</li>
<li>Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+histologic+characteristics+of+canine+flexor+tendon+repair+using+early+postoperative+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization.</a> J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+and+biological+modifications+for+enhanced+flexor+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair.</a> J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).</li>
<li>Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+of+flexion+after+flexor+tendon+repair+according+to+the+placement+of+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures.</a> Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Award+for+Outstanding+Orthopaedic+Research%3A+Engineering+flexor+tendon+repair+with+lubricant%2C+cells%2C+and+cytokines+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model.</a> Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).</li>
<li>Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+and+histological+examination+of+the+mouse+hindpaw+digit+and+flexor+tendon+arrangement+with+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction.</a> J Anat. 209, 533-545 (2006).</li>
<li>Katzel, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Smad3+loss+of+function+on+scarring+and+adhesion+formation+during+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing.</a> J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).</li>
<li>Loiselle, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+matrix+metalloproteinase-9+is+associated+with+fibrous+adhesion+formation+after+murine+flexor+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury.</a> PloS one. 7, e40602(2012).</li>
<li>Lee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+hormone+1-34+enhances+extracellular+matrix+deposition+and+organization+during+flexor+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair.</a> J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).</li>
<li>Geary, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+EP4+Inhibition+Increases+Adhesion+Formation+in+a+Murine+Model+of+Flexor+Tendon+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair.</a> PloS one. 10, e0136351(2015).</li>
<li>Loiselle, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+antisense+oligonucleotide+%28ASO%29+technology+against+Tgf-beta+signaling+to+prevent+scarring+during+flexor+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair.</a> J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).</li>
<li>Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrner%2C+CA+%22Plast+Reconstr+Surg%22">Plast Reconstr Surg</a>. , (2016).</li>
<li>Loiselle, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+murine+intrasynovial+tendon+adhesions+following+injury%3A+MMP+and+neotendon+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression.</a> J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).</li>
<li>Tsubone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+TGF-beta+inducible+early+gene+deficiency+on+flexor+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing.</a> J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).</li>
<li>Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+multiple+tendon+injury+models+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse.</a> J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).</li>
<li>David, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+repair+is+compromised+in+a+high+fat+diet-induced+mouse+model+of+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes.</a> PloS one. 9, e91234(2014).</li>
<li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+biology+of+flexor+tendon+adhesion+formation%3A+an+old+problem+in+a+new+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm.</a> Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti

La procedura chirurgica per un modello murino di completo transection e riparazione del flessore lungo delle dita tendine è presentato in questo studio. Inoltre è dimostrato una nuova applicazione di concentrare piccole popolazioni cellulari con citologia centrifuga, per consentire analisi immunocitochimica quantitativa dell&#39;ambiente cellulare durante tendine flessore guarigione. Questo modello di riparazione tendine flessore dimostra una risposta di guarigione riproducibile, che può essere usato per valutare i camb...

tendini flessori del lavoro manuale di concerto con i muscoli flessori dell&#39;avambraccio e guaine digitali per consentire la flessione delle cifre e afferrando funzione della mano. tendini flessori corrono lungo il lato palmare della mano; questa posizione relativamente superficiale si traduce spesso in lesioni ai tendini flessori durante un trauma alla mano. I tendini guarire attraverso una risposta tessuto cicatriziale piuttosto che rigenerazione dei tessuti normali tendine 1. Mentre questo tessuto cicatriziale fornisce continuità al tendine, funzione viene drasticamente diminuita rispetto al tendine sano. Compositi tessuto tendineo-cicatrice sono caratterizzati da proprietà meccaniche deteriorate 1, rendendo i tendini riparati più probabilità di rottura. Inoltre, il tessuto cicatriziale manca l&#39;organizzazione della struttura nativa fibre collagene tendine, causando un aumento della dimensione del tendine e bulk. Dati i vincoli anatomiche dell&#39;unità tendine-guaina, anche un modesto aumento delle dimensioni del tendine può drasticamente rossouce la funzione scivolante del tendine, e quindi gamma cifre di movimento e funzione della mano. Prima di lesioni del 1960 ai tendini flessori, in particolare quelli nella zona II della mano, non sono stati regolarmente riparato a causa delle gravi complicanze nella guarigione sorte con queste riparazioni 2. Questa zona della mano è stato indicato come &#39;terra di nessuno&#39; 3. Tuttavia, i miglioramenti delle tecniche chirurgiche, i modelli di sutura e protocolli di riabilitazione di terapia fisica sono notevolmente migliorato i risultati del tendine flessore riparazioni 2. Nonostante questi progressi, fino al 40% delle riparazioni provocare la formazione di aderenze sufficiente a impedire la funzione della mano 4. Di conseguenza, un approccio biologico è necessario per migliorare la guarigione. Purtroppo, molto poco si sa circa il processo di guarigione del tendine a livello cellulare e molecolare. Così, l&#39;obiettivo era quello di sviluppare un modello murino che potrebbe essere utilizzato per migliorare la understandin fondamentaleg dei componenti cellulari e molecolari del tendine flessore guarigione e la risposta formazione di cicatrici, come un mezzo per identificare nuovi bersagli terapeutici per migliorare la guarigione. modelli animali più grandi hanno svolto un ruolo fondamentale nel favorire la comprensione del processo di guarigione del tendine flessore. Canine e coniglio studi hanno dimostrato sia la capacità di guarigione intrinseca ed estrinseca dei tendini flessori 5,6, l&#39;importanza del movimento passivo anticipato controllato per minimizzare la formazione di aderenze relativa immobilizzazione 7, nonché gli effetti di diversi modelli di sutura sul processo di guarigione 8 , 9. Inoltre, il modello canino è stato utile in fase di test traslazionali approcci di ingegneria tissutale per migliorare la guarigione 10. Tuttavia, ci sono diversi importanti vantaggi nell&#39;uso di un modello murino rispetto ad un grande modello animale, compreso il relativo costo, disponibilità di reagenti specifici murine, e la facilità di generare Knoc globalek-out o costrutti cancellazione / iperespressione tessuto-specifici. Inoltre, le somiglianze funzionali tra umano e topi rispetto ai tendini flessori 11 indicano la potenziale utilità nello sviluppo di un modello murino. Sviluppo di un modello murino di tendine flessore transezione e riparazione imita molti aspetti della guarigione clinica, tra cui la formazione di abbondante tessuto cicatriziale e deteriorate proprietà meccaniche. Il modello qui descritto non è un vero ricapitolazione della pratica clinica a causa transezione del FDL all&#39;incrocio miotendinea per proteggere il sito di riparazione. Inoltre, questo modello non tiene conto del contributo delle cellule sinoviali guaina alla risposta di guarigione, in quanto non vi è alcuna guaina sinoviale che copre la porzione centrale del tendine dove avviene la riparazione. Nonostante queste limitazioni, questo modello ha il vantaggio di gamma generatrice di aderenze movimento limitativo, che deve ancora essere dimostrata in modelli murini che più closely approssimare la situazione clinica. Questo modello è stato utilizzato per valutare knock-out modelli di topo 12,13, e per testare diversi approcci farmacologici per migliorare la guarigione 14-17. Istologica analisi di questo modello, utilizzando immunoistochimica e ibridazione in situ, in grado di fornire spunti importanti per la localizzazione dei geni chiave e proteine ​​durante la guarigione. Tuttavia, l&#39;istologia fornisce solo una analisi spaziale trasversale e non consente la quantificazione durante tutto il tessuto. Citometria a flusso rappresenta un approccio più quantitativo, ma solo un numero molto limitato di cellule può essere isolato dal tessuto guarigione tendine nel modello murino, e questo numero è ulteriormente diminuito durante fasi di fissazione, permeabilizzazione, e lavaggio. Prendendo questo in considerazione, citometria a flusso diventa un approccio impraticabile a causa del numero di animali che sarebbe necessaria. Un metodo alternativo è necessario per preservare la maggior parte di questa piccola popolazione di cellule in ordineper caratterizzare ulteriormente l&#39;ambiente di guarigione. Il metodo utilizzato per ottenere questo, qui illustrato, coinvolge la concentrazione delle cellule isolate mediante citologia centrifugazione su un vetrino, seguito da immunocitochimica. Nel presente studio EdU (5-etinil-2&#39;deoxyuridine, un analogo della timidina) l&#39;inserimento e la successiva etichettatura è stato utilizzato per determinare lo stato proliferativo delle cellule relativa al luogo di guarigione. Questo approccio può essere applicato per testare l&#39;efficacia dei trattamenti farmacologici sulla proliferazione cellulare, gene knock-out o sovraespressione, o per identificare e quantificare diverse popolazioni cellulari.

<table><tbody><tr><td>Preparazione chirurgica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J topi&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira</td><td>NDC# 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NDC# 61311-482-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Par Pharmaceutical Inc.</td><td>NDC# 42023-179-10</td><td></td></tr><tr><td>Irrigazione con cloruro di sodio allo 0,9%</td><td>Hospira</td><td>NDC# 0409-6138-03</td><td>Per la preparazione di soluzioni di ketamina/xilazina e buprenorfina</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30 G</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di iodio povidone</td><td>Aplicare</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico veterinario Puralube</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NDC# 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia portatile 200 g</td><td>Ohaus</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Portaaghi</td><td>Fine Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro portaaghi</td><td>Fine Science Tools</td><td>12061-02</td><td></td></tr><tr><td>Suture in nylon 5-0</td><td>Suture</td> in nylon per microchirurgia Ethicon <td>668G</td><td></td></tr><tr><td>8-0</td><td>Ethicon</td><td>2808G</td><td></td></tr><tr><td>Scaldavetrini per istologia Lab-Line</td><td>Barnstead International</td><td>26025</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Metodo Cytospin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo I, liofilizzato</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>1700-017</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie di segnalazione cellulare</td><td>dell'albumina sierica bovina</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Imbuti citologici</td><td>Fisher HealthCare</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio HistoBond+ VWR</td><td></td><td>16005-110</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>SH-CYTO2</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per colorazione per vetrini con coperchio nero</td><td>IHC World</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Imaging Kit</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>C10639</td><td>include EdU e&nbsp; Hoeschst 33342</td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica Immedge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond media di montaggio</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24 x 50 mm #1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smalto</td><td></td><td></td><td></td> trasparente</tr></tbody></table>

murino tendine flessore lesioni e chirurgia riparazione

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Tendine collega muscolo scheletrico e ossa, facilitando il movimento di quasi tutto il corpo. Nella mano, tendini flessori (FTS) consentono la flessione delle dita e funzione generale mano. Lesioni ai FTS sono comuni, e la guarigione soddisfacente è spesso compromessa a causa di tessuto cicatriziale in eccesso e aderenze tra il tendine e il tessuto circostante. Tuttavia, poco si sa circa le componenti molecolari e cellulari del FT riparazione. A tal fine, un modello murino di FT di riparazione che riassume molti aspetti della guarigione negli esseri umani, tra cui gamma ridotta di movimento e una diminuzione delle proprietà meccaniche, è stato sviluppato e descritto in precedenza. Qui è prevista una dimostrazione approfondita di questa procedura chirurgica, che coinvolge transezione e successiva riparazione del tendine flessore lungo delle dita (FDL) nella zampa posteriore murino. Questa tecnica può essere utilizzata per condurre analisi lineage di tipi cellulari, valutare gli effetti di aumento di gene o perdita di funzione, e per testare l&#39;efficacia di interventi farmacologici nel processo di guarigione. Tuttavia, ci sono due limitazioni principali per questo modello: i) il tendine FDL nella porzione centrale della zampa posteriore murino, dove la transezione e riparazione verificano, non è circondato da una guaina sinoviale. Pertanto questo modello non tiene conto per il potenziale contributo della guaina al processo di formazione della cicatrice. ii) per proteggere l&#39;integrità del sito di riparazione, il FT viene rilasciata a livello della giunzione miotendinea, diminuendo le forze meccaniche del tendine, probabilmente contribuire ad una maggiore formazione di cicatrici. Isolamento di cellule sufficiente dal tessuto di granulazione del FT durante il processo di guarigione per analisi citofluorimetrica ha dimostrato impegnativo; citologia centrifugazione concentrare queste cellule è un metodo usato in alternativa, e permette di generazione di preparazioni di cellule in cui può essere eseguita l&#39;etichettatura immunofluorescenza. Con questo metodo, la quantificazione di cellule o proteine ​​di interesse durante FT guarigione diventa possibile.

Il flessore lungo delle dita (FDL) del muscolo, che si trova al polpaccio, agisce a flettere le cifre della zampa del mouse posteriori tramite il tendine flessore (evidenziato in blu nella figura 1A, e mostrato istologicamente in figura 2A), che si estende prossimalmente dal miotendinea giunzione e termina in falangi distali. In questo modello di tendine flessore guarigione, il tendine FDL viene sezionato e riparato a metà piede, prossimale alla biforcaz...

tendini flessori della mano sono comunemente feriti, portando a mano la funzione compromessa. Tuttavia, la risposta di guarigione tessuto cicatriziale non è ben caratterizzato. Un modello murino di tendine flessore guarigione è dimostrata qui. Questo modello può migliorare la comprensione globale del processo di guarigione e valutare approcci terapeutici per migliorare la guarigione.

Murino tendine flessore Lesioni e Chirurgia riparazione

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è migliorare la comprensione dei processi cellulari e molecolari alla base della formazione di cicatrici e aderenze durante la guarigione del tendine flessore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul processo di guarigione del tendine flessore, ad esempio quali tipi cellulari partecipano alla formazione della cicatrice e alla riparazione del tessuto. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'utilizzo di topi transgenici e knock-out per approfondire la conoscenza del processo di guarigione.Questa tecnica può identificare potenziali bersagli biologici per migliorare i risultati della guarigione dei tendini flessori, poiché facilita l'indagine di queste popolazioni cellulari scarsamente definite che contribuiscono alla formazione di cicatrici. Dopo aver confermato l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi, applicare un unguento oftalmico agli occhi degli animali e rasare il pelo da tutto l'arto posteriore. Sterilizzare la sede chirurgica con detergenti sequenziali a base di povidone-iodio ed etanolo al 70%, quindi individuare il tendine del flessore lungo delle dita, o tendine FDL, nella faccia mediale del polpaccio.Successivamente, effettuare un'incisione di 0,5 fino a 1 centimetro nel tessuto cutaneo per esporre il tendine. Utilizzare la pinzetta per separare il tendine del muscolo flessore delle dita lungo (FDL) dai tessuti circostanti e seguirne il decorso fino alla giunzione miotendinea. Usando forbici a molla, staccare il tendine a livello della giunzione, avendo cura di evitare l'arteria tibiale posteriore.Quindi chiudere la cute con punti di sutura in nylon 5-0. Ora trasferire il topo sotto un microscopio stereoscopico e utilizzare forbici microchirurgiche a molla per effettuare un'incisione di tre millimetri sulla faccia posterolaterale della zampa posteriore. Utilizzare la pinzetta per ritrarre delicatamente i tessuti molli e il muscolo circostanti, avendo cura di minimizzare i danni ai tessuti, e identificare il tendine del flessore delle dita lungo (FDL).Sollevare delicatamente il tendine e utilizzare forbici microchirurgiche per sezionare completamente il tessuto. Utilizzando suture 8.0 in un modello di Kessler modificato, legare le estremità del tendine FDL. Idratare periodicamente il tendine con soluzione fisiologica durante l'intervento, se necessario.Una volta suturate le estremità, riposizionare il tessuto molle e il muscolo sopra il tendine e utilizzare suture in nylon 5.0 per chiudere l'incisione. Successivamente, posizionare il topo su un riscaldatore per vetrini a 37 gradi Celsius con monitoraggio fino al completo recupero. 24 ore prima del punto finale dell'esperimento, iniettare nei topi 100 micro litri di EDU.Il giorno successivo, localizzare il tendine riparato come appena illustrato ed espiantare il tessuto trasversale. L'isolamento del tessuto granulato circostante il tendine in via di guarigione rappresenta una fase fondamentale per consentire l'analisi aminocitochimica successiva. È necessario prestare attenzione a minimizzare l'inclusione di tessuti periferici.Posizionare il tendine in una piastra di Petri contenente un millilitro di collaghenasi. Quindi, tritare i tessuti con il bisturi, seguito da triturazione dei frammenti mediante passaggi ripetuti attraverso un ago da 18 gauge. Trasferire la sospensione in provette da centrifuga da 1,5 millilitri e digerire i pezzi di tendine per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione.Al termine della digestione, centrifugare le sospensioni di tessuto e risospendere i pellet in 500 µL di BSA al tre percento in PBS. Successivamente, filtrare le cellule attraverso un filtro da 70 µm per rimuovere i detriti e i grandi frammenti di tendine non digeriti. Quindi, collocare le cellule in un incubatore a 37 °C.Trasferire i pezzi di tendine non digeriti in nuovi tubi da centrifuga microcentrifuga da 1,5 millilitro contenenti un millilitro di collaghenasi fresca, e mescolare i pezzi mediante pipettaggio. Dopo un’ulteriore ora di digestione con agitazione, centrifugare nuovamente i pezzi di tessuto e risospendere i pellet in 500 microlitri di PBS integrato con BSA. Quindi filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro cellulare da 70 micron e raccoglierla nel tubo contenente le cellule ottenute dopo la prima digestione.Contare le cellule e centrifugarle. Quindi risospendere il pellet a una concentrazione da tre a sei volte 10 alla quarta cellule per 100 microlitri di PBS integrato con BSA. Per rilevare l'incorporazione di EDU mediante immunocitochimica, utilizzare innanzitutto una penna con barriera idrofoba per delimitare le cellule sui vetrini e fissare immediatamente i campioni con 150 microlitri di paraformaldeide al tre percento in PBS a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, risciacquare le cellule con due lavaggi di cinque minuti ciascuno in 150 microlitri di PBS integrato con BSA. Successivamente, permeabilizzare i campioni con 0,5% di Triton X-100 in PBS per 20 minuti. Dopo il lavaggio come appena descritto, aggiungere 150 microlitri di cocktail di reazione EDU appena preparato alle cellule e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi lavare nuovamente le cellule e controcolorare i campioni con 150 microlitri di Hoechst. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, aggiungere una o due gocce di mezzo di montaggio antifade sulle cellule e coprire con attenzione ciascun campione con un coprioggetto, avendo cura di evitare bolle d'aria. Lasciare polimerizzare il mezzo di montaggio tutta la notte al buio a temperatura ambiente.Quindi sigillare i vetrini con smalto trasparente per unghie. Infine, acquisire le immagini dei preparati al microscopio fluorescente utilizzando un ingrandimento di 40X. In caso di riparazione riuscita, il tessuto di granulazione mostra una cellularità notevolmente aumentata rispetto al tendine non lesionato.In questa immagine, viene mostrato un esempio istologico di riparazione di un tendine flessore rotto. L'etichettatura con EDU evidenzia soltanto le cellule che proliferano attivamente durante le 24 ore successive all'amministrazione di EDU in topi vivi. Ciò consente una valutazione quantitativa della proliferazione all'interno del tessuto di granulazione del tendine in fase di guarigione.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'intervento chirurgico per l'infortunio e la riparazione del tendine flessore nei topi, al fine di comprendere meglio le popolazioni cellulari che contribuiscono alla formazione della cicatrice nel tendine flessore durante il processo di guarigione.

murine-flexor-tendon-injury-and-repair-surgery

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Dalkin, W., et al. Il metodo della lesione del nervo peroneale: un test affidabile per identificare e testare i fattori che riparano le giunzioni neuromuscolari. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una procedura chirurgica per indurre una lesione del nervo peroneale in un topo per studiare la rigenerazione della giunzione neuromuscolare (NMJ). La procedura prevede l'esposizione del nervo peroneale, l'applicazione di una pressione controllata per indurre la lesione e la garanzia che...

Induzione di lesioni del nervo peroneale in un topo per studiare la rigenerazione della giunzione neuromuscolare

Questo protocollo descrive un modello murino di chirurgia ortopedica che è stato usato per lo studio dei meccanismi di neuroinflammation postoperatoria e cambiamenti comportamentali e quando combinato con Parabiosi, per studiare la rigenerazione dei tessuti durante l'invecchiamento.

Un modello murino di chirurgia ortopedica per studiare la disfunzione cognitiva postoperatoria e rigenerazione tissutale

In questo articolo, presentiamo un protocollo in vitro e in situ per riparare uno spazio tendineo fino a 1,5 cm riempiendolo con innesto di collagene ingegnerizzato. Questo è stato eseguito sviluppando una tecnica di sutura modificata per prendere il carico meccanico fino a quando l'innesto matura nel tessuto ospite.

Una nuova tecnica di sutura Tenorrhaphy con innesto di collagene ingegnerizzato per riparare grandi difetti tendinei

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica minimamente invasiva per l'immobilizzazione dell'articolazione del ginocchio in un modello di ratto. Questo protocollo riproducibile, basato sul modus di separazione muscolo-gap e sull'abilità mini-incisione, è adatto per studiare il meccanismo molecolare sottostante della contrattura articolare acquisita.

Una tecnica di fissazione interna mini-invasiva per studiare la contrattura di flessione del ginocchio indotta dall'immobilizzazione nei ratti

Qui, presentiamo una tecnica di sutura "Q" che può essere eseguita nella riparazione del tendine e dei suoi effetti sulla formazione del gap e sulla forza della tensione dei tendini riparati. Q sutura è dimostrato di essere efficiente nel migliorare la resistenza alla tensione e la resistenza di riparazione tendini.

Utilizzo della sutura Q per migliorare la resistenza alla formazione del gap e la resistenza della tensione dei tendini Flexor riparati

Il presente protocollo illustra un metodo per valutare ex vivo le proprietà biofisiche delle riparazioni tendinee. Un materiale di sutura in politetrafluoroetilene (PTFE) è stato valutato con questo metodo e confrontato con altri materiali in condizioni diverse.

Politetrafluoroetilene (PTFE) come materiale di sutura nella chirurgia dei tendini

L'articolazione complessa caviglia-sottoastragalica (ASCJ) è il nucleo del piede e svolge un ruolo chiave nel controllo dell'equilibrio nelle attività quotidiane. Gli infortuni sportivi spesso portano all'instabilità di questa articolazione. Qui, descriviamo un modello murino di instabilità indotta dalla transezione legamentosa dell'ASCJ.

Un modello murino di instabilità articolare del complesso caviglia-sottoastragalico

Questo studio descrive in dettaglio le procedure per stabilire una lesione cronica della cuffia dei rotatori di coniglio (RC). In particolare, la lesione viene creata nell'unità muscolo-tendinea/miotendinea sottoscapolare (SSC) per imitare l'anatomia e la fisiopatologia della RC umana, compresa la grave degenerazione grassa muscolare (FD). Questo protocollo può essere applicato per studiare le lesioni RC e valutare le terapie rigenerative.

Sviluppo di un modello di lesione della cuffia dei rotatori di tipo cronico di coniglio per lo studio della fibrosi e della degenerazione grassa muscolare

Presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata e un protocollo di coltura tissutale che ricrea il cambiamento fibrocartilagineo guidato dall'impingement dell'inserzione del tendine d'Achille in espianti murini dell'arto posteriore con vitalità cellulare sostenuta, fornendo un modello adatto per esplorare la meccanobiologia dell'impingement tendineo.

Modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine d'Achille

Descriviamo due metodi di test sensoriali tattili per periodi acuti o cronici di lesioni del midollo spinale nei ratti. Queste procedure validate in grado di rilevare lo sviluppo e la manutenzione di allodinia simili sensazioni.

Acuta e Cronica test sensoriale tattile dopo lesione del midollo spinale in ratti

Impara la chirurgia di riparazione del tendine flessore murino per studiare la formazione di tessuto cicatriziale e identificare bersagli terapeutici nel processo di guarigione cellulare.

Murino tendine flessore Lesioni e Chirurgia riparazione

Esplora altri video