Crescita differita Inibizione test per quantificare l'effetto di antimicrobici batteri derivati ​​sulla concorrenza

L'obiettivo generale di questo protocollo è esaminare la competizione di un isolato batterico su un altro sia in maniera quantitativa che qualitativa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali relative allo studio dell'esclusione competitiva all'interno delle comunità batteriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rispecchia ciò che avviene in una comunità batterica.

Gli isolati invasori devono essere in grado di sopravvivere agli effetti inibitori degli isolati già stabiliti affinché l'invasione abbia successo. A illustrare il procedimento sarà Emma Crank, una studentessa laureata in biologia ospedaliera. Per iniziare, preparare l'agar brain heart infusion (BHI) secondo le istruzioni del produttore.

Autoclavare l'agar a 121 gradi Celsius a 15 psi per 20 minuti per sterilizzarlo. Versare aliquote da 15 millilitri di agar BHI sterilizzato in piastre di Petri sterili e lasciare solidificare l'agar. Preparare il brodo BHI seguendo le istruzioni del produttore e trasferire aliquote da 10 millilitri in bottiglie universali di vetro da 28 millilitri.

Quindi sterilizzare in autoclave il brodo BHI per 20 minuti. Per preparare le bottiglie del vaporizzatore, iniziare smontandole. Spruzzare un agente pulente al 5% con attività superficiale attraverso il vaporizzatore per eliminare i contaminanti interni.

Quindi immergere il flacone del vaporizzatore, il coperchio e il vaporizzatore nell'agente pulente per tutta la notte. Il giorno seguente, asciugare il vaporizzatore, il coperchio e i flaconi sotto una cappa a flusso laminare sterile. Successivamente, utilizzare etanolo al 70% per riempire i flaconi.

Successivamente, riattaccare il vaporizzatore e spruzzare una parte dell'etanolo attraverso di esso. Posizionare il coperchio sul vaporizzatore e conservarlo con l'etanolo all'interno fino al momento dell'uso. Prima dell'uso, utilizzare brodo BHI sterile per risciacquare asetticamente la bottiglia e spruzzare il brodo attraverso il vaporizzatore.

Per preparare colture batteriche notturne, effettuare un’isolazione su piastra di agar BHI sterile con i ceppi competitori e inibitori, quindi incubare a 37 gradi Celsius in condizioni aerobiche per circa 18 ore. In un flacone universale da 28 millilitri, inoculare 10 millilitri di brodo BHI sterile con una singola colonia del ceppo batterico competitore richiesto. Incubare la coltura in uno shaker orbitale universale a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto per tutta la notte.

Il giorno seguente, assicurarsi che le piastre di agar siano completamente asciutte e che non vi sia condensa sul coperchio, per evitare che l'inoculo si diffonda sulla piastra. Pipettare 25 microlitri della coltura da incubazione notturna al centro delle piastre di agar, evitando di premere completamente lo stantuffo della pipetta per prevenire bolle d'aria che potrebbero disperdere la coltura sull'agar. Lasciare asciugare la coltura a temperatura ambiente per limitarne la diffusione.

Quindi, incubare le piastre di agar a 37 gradi Celsius in condizioni aerobiche per tutta la notte. Dopo aver coltivato una coltura notturna, mentre si lavora all'interno di una cappa di sicurezza di livello due foderata con carta assorbente, utilizzare il brodo BHI per diluire la coltura di dieci volte, ottenendo circa quattro per dieci alla sesta UFC per millilitro. Successivamente, versare la coltura diluita in una bottiglia sterile per vaporizzatore di profumo in plastica.

Per eseguire un saggio di inibizione della crescita differita, nebulizzare la coltura attraverso ciascuna delle bottiglie del vaporizzatore per assicurarsi che la coltura sia caricata nel meccanismo di nebulizzazione prima di spruzzarla sull'agar. Da una distanza di circa 15 centimetri sopra l'agar, nebulizzare circa 250 microlitri di coltura diluita su tutta la superficie dell'agar. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in condizioni aerobiche per tutta la notte.

Per interpretare l'inibizione della crescita differita, misurare in millimetri la zona di inibizione della crescita della ceppa concorrente spruzzata, sottraendo il diametro del punto centrale della ceppa produttrice dell'inibitore. Infine, registrare il punteggio di chiarezza per le zone di inibizione secondo il protocollo descritto nel testo. Come mostrato in questa figura, i risultati del saggio dovrebbero essere osservabili come una differenza nella crescita della ceppa concorrente sovrapposta vicino alla ceppa produttrice dell'inibitore posizionata al centro.

Le differenze possono essere inibizione completa, inibizione parziale, assenza di inibizione o associazione positiva. Questo grafico confronta le zone di inibizione tra isolati produttori di inibitori, che possono dipendere dalla quantità di antimicrobico prodotta, dalla capacità dell'inibitore di diffondersi attraverso il mezzo, dal tipo di inibitore prodotto o dal livello di resistenza del ceppo concorrente agli inibitori. Questo esempio mostra che se la coltura del concorrente in prova è troppo diluita, la zona di inibizione apparirà più ampia e con un margine meno definito rispetto a quanto normalmente osservato.

Se la colonia del ceppo produttore di inibitore non è completamente asciutta prima dell'incubazione notturna, il ceppo inibitore si diffonderà e non formerà una colonia ben definita. In alternativa, se il ceppo concorrente non viene spruzzato in modo uniforme, ciò può portare a una diffusione irregolare dei batteri. Infine, se il ceppo concorrente è troppo concentrato, potrebbe crescere sopra il ceppo inibitore e, in casi estremi, può portare all'inversione dei ruoli tra ceppo concorrente e ceppo inibitore.

Una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà un'ora distribuita in quattro giorni per ogni coppia di isolati testata. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di nebulizzare in modo uniforme, garantendo una buona replicazione tra i saggi. Dopo aver seguito questa procedura, i dati di inibizione possono essere sovrapposti ai dati tassonomici riguardanti la presenza o l'assenza di una specie batterica all'interno di una comunità.

È quindi possibile determinare se gli effetti inibitori influenzano la capacità di una specie di colonizzare un ambiente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dei microbiomi comunitari di esplorare gli effetti della varianza dei tratti, come la previsione di peptidi antimicrobici, nella struttura della comunità in relazione all'esclusione competitiva. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come confrontare la capacità di un isolato batterico di inibire in modo competitivo la crescita di un altro, sia in maniera qualitativa che quantitativa.

Non dimenticare che lavorare con batteri aerosolizzati può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come operare all'interno di una cappa di sicurezza di livello due e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.