Crescita differita Inibizione test per quantificare l'effetto di antimicrobici batteri derivati ​​sulla concorrenza

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di esaminare la competizione di un isolato batterico su un altro in modo sia quantitativo che qualitativo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti le indagini sull'esclusione competitiva all'interno delle comunità batteriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riflette ciò che avviene in una comunità batterica.

Gli isolati invasori devono essere in grado di sopravvivere agli effetti inibitori degli isolati stabiliti affinché l'invasione abbia successo. A dimostrare la procedura sarà Emma Crank, una studentessa laureata in biologia ospedaliera. Per iniziare, preparare l'infuso di cuore cerebrale o l'agar BHI secondo le istruzioni del produttore.

Autoclavare l'agar a 121 gradi Celsius a 15 psi per 20 minuti per sterilizzarlo. Versare 15 millilitri di aliquote di agar BHI sterilizzato in piastre di Petri sterili e lasciare che l'agar si solidifichi. Preparare il brodo BHI secondo le istruzioni del produttore e trasferire aliquote da 10 millilitri in bottiglie universali di vetro da 28 millilitri.

Quindi sterilizzare in autoclave il brodo BHI per 20 minuti. Per preparare le bottiglie del vaporizzatore, inizia smontando le bottiglie. Spruzzare un detergente tensioattivo al 5% attraverso il vaporizzatore per eliminare i contaminanti interni.

Quindi immergere il flacone del vaporizzatore, il coperchio e il vaporizzatore nel detergente per una notte. Il giorno seguente, asciuga il vaporizzatore, il coperchio e i flaconi sotto il cappuccio del flusso d'aria sterile. Quindi utilizzare il 70% di etanolo per riempire le bottiglie.

Successivamente, ricollega il vaporizzatore e spruzza un po' di etanolo attraverso il vaporizzatore. Posiziona il coperchio sul vaporizzatore e conservalo con l'etanolo all'interno fino al momento dell'uso. Prima dell'uso, utilizzare il brodo BHI sterile per sciacquare asetticamente il flacone e spruzzare il brodo attraverso il vaporizzatore.

Per preparare le colture batteriche durante la notte, strisciare i ceppi concorrenti e inibitori su una piastra di agar BHI sterile e incubare a 37 gradi Celsius in modo aerobico per circa 18 ore. In un flacone universale da 28 millilitri, inoculare 10 millilitri di brodo BHI sterile con una singola colonia del ceppo batterico concorrente richiesto. Incubare la coltura in un agitatore orbitale universale a 37 gradi Celsius e 250 giri/min durante la notte.

Il giorno seguente, assicurarsi che le piastre di agar siano completamente asciutte e prive di condensa sul coperchio, per evitare che l'inoculazione si diffonda sulla piastra. Pipettare 25 microlitri di coltura notturna al centro delle piastre di agar, evitando di premere completamente lo stantuffo della pipetta per evitare bolle d'aria che spruzzano la coltura sull'agar. Lasciare asciugare la coltura a temperatura ambiente per limitare la diffusione della coltura.

Quindi, incubare le piastre di agar a 37 gradi Celsius in modo aerobico durante la notte. Dopo aver coltivato una coltura durante la notte, mentre si lavora sotto un armadio di sicurezza di livello due rivestito con carta assorbente, utilizzare il brodo BHI per diluire la coltura dieci volte fino a produrre circa quattro volte dieci al sesto CFU per millilitro. Quindi, versa la coltura diluita in un flacone di vaporizzatore di profumo in plastica sterile.

Per eseguire un saggio di inibizione della crescita differita, spruzzare la coltura attraverso ciascuno dei flaconi del vaporizzatore per assicurarsi che la coltura sia caricata nel meccanismo di spruzzatura prima di spruzzare sull'agar. Da una distanza di circa 15 centimetri sopra l'agar, spruzzare circa 250 microlitri di coltura diluita su tutta la superficie dell'agar. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in modo aerobico durante la notte.

Per interpretare l'inibizione differita della crescita, misurare la zona di inibizione della crescita del ceppo concorrente irrorato in millimetri, sottraendo il diametro del punto centrale dell'inibitore-produttore. Infine, registra il punteggio di chiarezza per le zone di inibizione secondo il protocollo di testo. Come mostrato in questa figura, i risultati del test dovrebbero essere osservabili come una differenza nel ceppo concorrente sovrapposto vicino al ceppo produttore di inibitori localizzati centralmente.

Le differenze possono essere inibizione completa, inibizione parziale, nessuna inibizione o associazione positiva. Questo grafico confronta le zone di inibizione tra gli isolati produttori di inibitori, che possono essere il risultato della quantità di antimicrobico prodotto, della capacità dell'inibitore di diffondersi attraverso il mezzo, del tipo di inibitore prodotto o del livello di resistenza del ceppo concorrente agli inibitori. Questo esempio mostra che se la coltura del concorrente di prova è troppo diluita, la zona di inibizione apparirà più grande e con un bordo meno chiaramente definito di quanto si osservi tipicamente.

Se il punto del ceppo che produce l'inibitore non è stato completamente asciugato prima dell'incubazione durante la notte, il ceppo inibitore si diffonderà e non formerà un punto completamente definito. In alternativa, se il ceppo concorrente non viene spruzzato in modo uniforme, ciò può portare a una diffusione irregolare dei batteri. Infine, se il ceppo concorrente è troppo concentrato, può crescere sopra il ceppo inibitore e può in casi estremi portare all'inversione dei ruoli del ceppo inibitore concorrente.

Una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà un'ora suddivisa in quattro giorni per coppia di isolati testata. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di spruzzare in modo uniforme con una buona replicazione tra i saggi. Seguendo questa procedura, i dati di inibizione possono essere sovrapposti ai dati tassonomici sulla presenza o l'assenza di una specie batterica da una comunità.

È quindi possibile determinare se gli effetti inibitori influenzano la capacità di una specie di colonizzare in un ambiente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dei microbiomi comunitari di esplorare gli effetti della varianza dei tratti, come la previsione dei peptidi antimicrobici, nella struttura della comunità in condizioni di esclusione competitiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come confrontare la capacità di un isolato batterico di inibire in modo competitivo la crescita di un altro sia in modo qualitativo che quantitativo.

Non dimenticare che lavorare con i batteri aerosol può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare all'interno di un armadio di sicurezza di livello due e indossare DPI adeguati.