Name: Lefficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Scopri la vaccinazione BCG intranasale nei topi per confrontare l'efficacia protettiva polmonare con la via sottocutanea. Questo metodo identifica i parametri immunitari correlati alla protezione contro la tubercolosi.

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Questo lavoro è stato supportato dal "Ministero spagnolo dell'Economia e della Competitività" [numero di sovvenzione BIO2014-5258P], dalla "Commissione Europea" dai programmi H2020 [numeri di sovvenzione TBVAC2020 643381].

Tutti i topi sono stati tenuti in condizioni controllate e osservati per qualsiasi segno di malattia. Il lavoro sperimentale è stato condotto in accordo con le direttive europee e nazionali per la protezione degli animali da esperimento e con l&#39;approvazione del competenti comitati etici locali. 1. Preparazione di quantificata glicerolo scorte di BCG danese e Mycobacterium tuberculosis H37Rv Nota: Tutti i protocolli descritti sono stati eseguiti in BSL3. <ol><li> Scongelare scorte glicerolo congelati di BCG danese ceppi H37Rv e inoculare 100 ml in 10 ml di 7H9 media 10 integrato con Tween-80 allo 0,05% (v / v) e ADC (albumina, destrosio, catalasi) 10% (v / v). </li><li> Incubare in condizioni statiche per una settimana a 37 ° C fino a quando la coltura è in fase di crescita logaritmica. </li><li> Scalare fino coltura batterica trasferendo la cultura da 10 ml a 200 ml di terreno fresco. Incubare per 20 aggiuntivogiorni in condizioni statiche. </li><li> Trasferimento a provette da centrifuga da 50 ml e centrifugare per 15 min a 2500 x g. </li><li> Eliminare sovranatante e risospendere pellet batterico nel volume residuo. Aggiungere ad ogni provetta perle di vetro sterili a 3 mm di diametro (10 - 15 per provetta). </li><li> Vortex vigorosamente per 1 minuto al fine di dissociare grumi batteriche. Risospendere ogni pellet in 10 ml di PBS con Tween-80 allo 0,05% (v / v). </li><li> Lasciare i tubi per 10 min permettendo i più grandi aggregati batterici e perle di vetro di stabilirsi. </li><li> Recupero 9,5 ml di surnatante da ciascuna delle 4 provette contenenti piccoli grumi e batteri singoli e volumi di trasferimento ad un singolo tubo da centrifuga da 50 ml fresca (volume finale recuperato 38 ml). Centrifugare per 10 min a 400 x g. </li><li> Recupero 35 ml di surnatante (contenenti batteri principalmente singoli) in una singola provetta da centrifuga da 50 ml fresca e aggiungere 15 ml di PBS con glicerolo 50% (v / v), ottenendo una concentrazione di glicerolo finale del 15% (v / v). </li><li> mescolare delicatamentee distribuire in aliquote da 1 ml in tubi appropriati per il congelamento. Conservare a -80 ° C (un lotto fornisce circa il 50 aliquote stock di glicerolo). </li><li> Per quantificare le scorte glicerolo, scongelare un glicerolo il giorno dopo il congelamento e di eseguire sette diluizioni seriali di dieci volte separati tubi da 1,5 ml contenente 900 ml di PBS. </li><li> Piatto 100 microlitri di ogni diluizione in 7H10 mezzo solido-agar addizionato con 10 ADC 10% (v / v) preparata in diametro piatti 55 mm Petri. </li><li> Aggiungere con cautela 3 mm di diametro perle di vetro (circa. 10 per piastra) e scuotere delicatamente piastra per distribuire equamente il volume su piastra di agar. Eliminare perline e sigillare piastra di agar con parafilm. </li><li> Incubare per 21 giorni a 37 ° C e determinare la concentrazione batterica contando unità formanti colonia (CFU) nelle diluizioni in cui singole colonie possono essere accuratamente distinti. </li></ol> 2. mouse Vaccinazione <ol><li> Scongelare un glicerolo pre-quantificato BCG e diluirlo in PBS a prepsono due sospensioni. Calcolare il volume finale considerando la dose per animale è di 100 ml per somministrazione sottocutanea (10 7 CFU per ml per la vaccinazione per via sottocutanea) e 40 ml per somministrazione intranasale (2,5 x 10 7 CFU per la vaccinazione intranasale). </li><li> Utilizzare una stazione di anestesia specializzato per roditori per anestetizzare topi con una miscela di isoflurano e ossigeno. Utilizzare isoflurano 5% per indurre anestesia e 2% per mantenere i topi nella camera di anestesia. (Altro metodo di anestesia accettato può essere utilizzato). </li><li> Per la somministrazione del vaccino sottocutanea riempire una siringa da 1 ml con un ago 26 G con 1 ml di sospensione batterica (10 7 CFU / ml). Rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Inserire un mouse anestetizzato su una superficie piana in posizione prona all&#39;interno di una cappa a flusso laminare e inoculare sottocutanea 100 microlitri (10 6 CFU / dose) di vaccino in un fianco della parte posteriore del mouse. Ritorna il mouse per la gabbia e monitorarlo per assicurare che properly recupera da anestesia. </li><li> Cambiare l&#39;ago della siringa tra ogni amministrazione mouse. Rimosso bolle d&#39;aria come descritto sopra. </li><li> Per la somministrazione intranasale, posizionare un mouse anestetizzato in posizione supina all&#39;interno della cappa. </li><li> Con una micropipetta prendere 20 ml di sospensione con 2,5 x 10 7 CFU / ml. Posizionare l&#39;inoculo goccia a goccia tra le due narici fino a quando l&#39;intero volume è stato depositato, lasciando tempo tra gocce per consentire il mouse respirare il volume. Nota: i topi possono soffrire di distress respiratorio durante questa procedura in modo che dovrebbe essere lasciato a assimilare ogni goccia prima amministrare quello successivo per evitare il più possibile. </li><li> Ri-riempire la micropipetta con un altro 20 ml e ripetere l&#39;operazione. Se il mouse comincia a svegliare dall&#39;anestesia dopo il primo inoculo, posizionarlo nella camera di anestesia prima alla seconda. Ritorna il mouse per la gabbia e garantire che recupera correttamentedall&#39;anestesia. </li></ol> 3. mouse intranasale sfida con H37Rv Strain <ol><li> Scongelare un glicerolo pre-quantificato H37Rv e diluire in PBS per preparare una sospensione batterica di 2.500 CFU per ml. Calcolare il volume finale considerando la dose per animale è di 40 ml. </li><li> H37Rv viene inoculato per via intranasale, come descritto nella 2,5-2,7. Dose sfida finale per il mouse è di 10 CFU 2/40 ml. </li></ol> 4. Analisi dei indotta risposta immunitaria nei polmoni <ol><li> Sospensione cellulare Lung NOTA: Valutazione della risposta immunitaria adattativa indotta dal vaccino nei polmoni richiede la generazione di sospensione cellulare singolo. A questo scopo, usiamo un dissociatore tessuto come gentleMACS. <ol><li> Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale (o altra metodologia umana accettato) e garantire il mouse è morto di toccare il bulbo oculare per confermare assenza di riflesso corneale. </li><li> All&#39;interno di una cappa a flusso laminare, estrarre lungs usando forbici e pinze sterili e collocarli su una superficie pulita. polmoni puliti rimozione della trachea e del tessuto connettivo, e trasferire i polmoni in una provetta da 1,5 ml con PBS (mantenere in ghiaccio fino al trattamento). </li><li> Per generare una sospensione cellulare, posizionare polmoni in un tubo adeguato per la dissociazione organo (tubo C-dissociatore) contenente 5 ml di 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 e 1.8 mM CaCl 2 buffer. </li><li> Aggiungere 100 ml di collagenasi D 100 mg / ml (2 mg / ml concentrazione finale) e 40 ml di DNAsi I 20.000 UI / ml (160 UI / ml concentrazione finale. NOTA: Soluzioni madre della collagenasi D o DNasiI sono preparati dissolvendo enzimi liofilizzati in PBS o glicerolo 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7.5 y MgCl 2 1 mM, rispettivamente. </li><li> Posizionare il tubo nella dissociatore tessuti e utilizzare il programma di m_lung_01 predefinito per la frammentazione del polmone. Incubare la provetta a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti. </li><li> ° postoe tubo nella dissociatore e utilizzare il m_lung_02 programma predefinito per l&#39;omogeneizzazione del polmone completo in un&#39;unica sospensione cellulare. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso un colino cella nylon 70 micron montato su un tubo da centrifuga da 50 ml. Lavare il filtro con 10 ml di RPMI 1640 medium. </li><li> celle di centrifugazione per 5 minuti a 400 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di eritrociti lisi tampone, mescolare nel vortex e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 10 ml di RPMI 1640 cellule medie e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. </li><li> Risospendere le cellule in 0,5 ml di RPMI completo 1640 supplementato con 10% inattivato al calore fetale Calf Serum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml streptomicina, 100 IU / ml penicillina e 50 mM 2-mercaptoetanolo. NOTA: FCS è inattivata tramite incubazione a 56 ° C per 30 minuti. </li><li> Contare le cellule e aggiungere completo RPMI 1640 medium per raggiungere densità finale cellulare di 10 7 cellule / ml. NOTA: Per il conteggio delle cellule, usiamo il contatore delle cellule automatizzato. </li><li> Distribuire 100 ml di sospensione cellulare in U-bottom piastra a 96 pozzetti sterili (10 6 cellule / pozzetto). </li><li> Aggiungere 50 ml / pozzetto di completo RPMI 1640 medium con 15 ug / ml di H37Rv commerciale purificata proteine ​​derivati ​​(PPD) (5 mg / ml concentrazione finale). </li></ol></li><li> Raccolta surnatante per la determinazione di citochine da parte ELISA <ol><li> Incubare la piastra da 4.1.14 per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Piastra centrifugare per 5 minuti a 400 xg e recuperare 100 ml di surnatante. </li><li> Conservare a -80 ° C. </li><li> Diluire surnatanti 1/10 e 1/2 nel tampone per IFNγ e determinazione IL17A, rispettivamente. Determinare le concentrazioni di citochine con kit commerciali ELISA, secondo le istruzioni del produttore (kit ELISA Sviluppo). </li></ol></li><li> Colorazione intracellulare per la determinazione delle citochine-produzione di cellule CD4 + mediante citometria di flusso <ol><li> Incubare la piastra da 4.1.14 per 18 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di brefeldina a 1 mg / ml (archivio disciolto in DMSO) a ciascuna (concentrazione finale 10 ug / ml) e incubare per sei ore aggiuntive. </li><li> Centrifugare la piastra da 4.3.2 per 1 min a 3200 xg e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 50 ml di anti-topo CD4-FITC diluito in RPMI 1640 con 10% FCS (1/500) e incubare per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare la piastra da 4.3.4 per 1 min a 3.200 xg, scartare il surnatante e aggiungere 100 ml / pozzetto di soluzione di fissaggio. Incubare a 4 ° C per 20 min. </li><li> Lavare le cellule due volte con 150 ml / lavaggio di soluzione di permeabilizzazione. NOTA: 10x magazzino concentrato viene diluito in acqua deionizzata per preparare la soluzione di lavoro 1x. </li><li> Risospendere le cellule in 50 ml di anti- topo IFNγ-APC e anti-topo-IL17A APC.Cy7 diluiti in permeabilsoluzione zione (1/250 entrambi gli anticorpi). </li><li> Incubare per 1 ora a RT. </li><li> Lavare le cellule due volte con 150 ml / lavaggio di soluzione di permeabilizzazione. </li><li> Risospendere le cellule in 200 ml di PBS per l&#39;acquisizione di citometria a flusso. </li></ol></li></ol> 5. Analisi delle immunoglobuline nel lavaggio broncoalveolare (BAL) <ol><li> Ottenimento di campioni BAL <ol><li> Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale (o altra metodologia umana accettato) e garantire il mouse è morto di toccare il bulbo oculare per confermare assenza di riflesso corneale. </li><li> Esporre la trachea utilizzando adeguata precisione pinza sterile e forbici ed eseguire un piccolo taglio nella trachea, facendo attenzione a non asportare completamente. Fare attenzione a non causare sanguinamento che potrebbe contaminare campione BAL. </li><li> Introdurre nella trachea una cannula collegata ad una siringa sterile da 1 ml con 800 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Seminare il PBS lentamente nei polmoni e poi recover volume di BAL tirando indietro il pistone della siringa molto lentamente per evitare il collasso del polmone. NOTA: Il recupero di 500 a 600 microlitri è soddisfacente. </li><li> Trasferire il volume BAL in un tubo da 1,5 ml e confermare BAL rimane incolore, che indica che non è contaminato con il sangue (mantenere in ghiaccio fino al trattamento). </li><li> centrifugare i campioni BAL per 5 minuti a 400 xg, e il trasferimento surnatante in una nuova provetta. </li><li> surnatanti conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Determinazione delle IgA nel BAL surnatanti NOTA: Tutti i reagenti utilizzati sono a temperatura ambiente. <ol><li> Coat-alto contenuto di proteine ​​di polistirolo legame a fondo piatto piastre a 96 pozzetti con 100 ml di PPD diluito in PBS (10 mg / ml) per M. tubercolosi determinazione IgA SPECIFICI, o con 100 ml di BAL surnatante diluiti 10 volte in PBS per la determinazione totale di IgA. </li><li> Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Gettare il surnatante e toccare la piastra su carta assorbente per dry. Lavare con 200 pl / pozzetto di PBS. </li><li> Blocco con 200 pl / pozzetto di una albumina sierica bovina (BSA) 1% (w / v) in PBS-Tween-80 allo 0,05% (v / v) (tampone di bloccaggio). </li><li> Incubare 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare una volta con 200 ml / pozzetto di PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampone di lavaggio). </li><li> Aggiungere 100 ml di diluito surnatante BAL nei pozzetti PPD-rivestiti. Incubare due ore a temperatura ambiente. NOTA: Se la determinazione totale IgA viene fatto in parallelo con il PPD-specifica IgA, lasciare pozzi totale di IgA con tampone di lavaggio 100 microlitri Durante questa incubazione. </li><li> Lavare tre volte con 200 pl / pozzetto di lavaggio buffer.0170004 </li><li> Aggiungere 100 ml di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-topo IgA diluito in tampone di bloccaggio (1 / 10.000). </li><li> Incubare 1 ora RT. </li><li> Lavare cinque volte con 200 pl / pozzetto di tampone di lavaggio. </li><li> Aggiungere 100 ml / pozzetto di 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetrametilbenzidina (TMB). Incubare 20 minuti a temperatura ambiente in tegli scuro. </li><li> Aggiungere 100 pl / pozzetto di H 2 SO 4 0.5N. Leggere la piastra in uno spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. determinazione carica batterica nei polmoni <ol><li> Omogeneizzazione del polmone e placcatura <ol><li> Quattro settimane dopo la sfida, sacrificare il mouse per dislocazione cervicale (o altra metodologia umana accettato) e garantire il mouse è morto di toccare il bulbo oculare per confermare assenza di riflesso corneale. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina fissa su una superficie piana e disinfettati all&#39;interno di una cappa a flusso laminare. </li><li> Fare un&#39;incisione e rimuovere la pelle da regione toracica lasciare visibile la zona toracica. </li><li> Tagliare le costole e raccogliere i polmoni e il cuore con le forbici e pinze sterili. Mettere organi su una superficie pulita. </li><li> Pulire polmoni rimuovendo cuore, trachea e tessuto connettivo e trasferire i polmoni in una provetta da 1,5 ml con 1 ml di acqua deionizzata(Mantenere in ghiaccio fino lavorazione). </li><li> Utilizzare pinze sterili per trasferire i polmoni di ciascun topo in una provetta adeguata per omogeneizzazione organo (M - tubo dissociatore), contenente 1 ml di acqua deionizzata. </li><li> Posizionare il tubo nella dissociatore tessuti e utilizzare il programma RNA_1 predefinito per omogeneizzare i polmoni. </li><li> Fare cinque diluizioni seriali dieci volte in tubi da 1,5 ml, a partire da 100 ml di omogenato polmone diluito in 900 ml. </li><li> diluizioni piastra come descritto in 1,11-1,14. </li></ol></li><li> La differenziazione tra BCG e H37Rv mediante PCR NOTA: In piastre dalla 6.1.6 corrispondenti al gruppo vaccinato con BCG per via intranasale, abbiamo analizzato un numero rappresentativo di colonie da una PCR discernere tra BCG e H37Rv per garantire che il CFU considerato per valutare l&#39;efficacia protettiva del vaccino-conferito corrispondeva unica per H37Rv. Questo target di amplificazione PCR di RD9, una regione genomica diversa in BCG e M. tutuberculosis, dando un frammento di 2618 bp per H37Rv, e 465 bp per BCG 11. <ol><li> Preparare uno stock master mix per tutti i campioni con volumi per campione come indicato, e quindi distribuire in provette da PCR (9 ml / campione). NOTA: Buffer 5x: 2 ml. Avanti di primer 25 micron (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 ml, Reverse Primer 25 micron (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 microlitri, Taq polimerasi 5 unità / mL: 0,04 ml, deionizzata H 2 O: 6.32 ml. </li><li> Toccare una colonia con uno stuzzicadenti sterile e immergere lo stuzzicadenti con il campione in un tubo di PCR contenente la master mix. </li><li> Eseguire il PCR con il seguente programma: 10 min 95 ° C (questo passaggio è per innescare interruzione batterica), 10 min a 95 ° C (questo passaggio è per innescare interruzione batterica), 35 cicli (30 secondi a 95 ° C, 1 min a 58 ° C e 4 minuti a 72 ° C). </li><li> Caricare i campioni di PCR in un 1% gel con i campioni di etidio bromuro e correre a visualizzare i frammenti. </li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sebbene l'attuale vaccino contro la tubercolosi, il BCG, sia il vaccino più somministrato nella storia, la tubercolosi rimane una delle principali cause di morte e morbilità da malattie infettive in tutto il mondo. Questo paradosso si spiega con la mancanza di protezione di questo vaccino contro la tubercolosi polmonare, la forma responsabile della trasmissione. Sono urgentemente necessari nuovi approcci vaccinali efficaci contro le forme polmonari della malattia, in quanto avrebbero il maggiore impatto sulla trasmission...

La tubercolosi (TB) è una delle principali malattie infettive che causano più morti associate di HIV nel mondo e combinato con l&#39;aumento della crescita di ceppi resistenti multiresistenti rende TB un allarmante problema di salute globale 1. I nuovi strumenti diagnostici, farmaci più efficaci e meno tossici, e nuovi vaccini TB sicuri ed efficaci sono una necessità urgente, soprattutto nel mondo in via di sviluppo. Vivo attenuato Bacille Calmette-Guerin (BCG) è attualmente l&#39;unico vaccino autorizzato contro la tubercolosi, che è stato somministrato per via intradermica alla nascita dal 1970 in tutto il mondo. BCG è considerata efficace nel prevenire le forme gravi della malattia (meningite e la tubercolosi miliare) nei bambini, ma ha dimostrato efficacia in contrasto contro la tubercolosi polmonare responsabile della trasmissione della malattia 2. la vaccinazione polmonare, che imita percorso naturale di infezione da TBC, rappresenta un approccio interessante per l&#39;innesco della risposta immunitaria host localeS. A questo proposito, varie opere preclinici in modelli animali TB pertinenti hanno dimostrato una maggiore efficacia del vaccino a seguito di immunizzazione polmonare rispetto alla via sottocutanea o intradermica 3-6. Tuttavia, i meccanismi di protezione innescati dalla vaccinazione polmonare non sono ben compresi. Negli ultimi anni, diversi lavori hanno puntato verso di risposta IL17-mediata come un importante fattore di mucosa risposta immunitaria specifica-TB, come nei modelli murini carenti per IL17 mucosa efficacia protettiva del vaccino-indotta è compromessa 7,8. Recentemente abbiamo dimostrato per la prima volta che intranasale amministrazione BCG protetto / 2 topi DBA, un ceppo di topi caratterizzata dalla mancanza di protezione dopo BCG sottocutaneo vaccinazione 9. Questi risultati suggeriscono che la vaccinazione respiratorio TB potrebbe essere più efficace nel ridurre il tasso di tubercolosi nei paesi endemici, in cui intradermica di BCG è considerato inefficace contro pulmonTB ary.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 brodo</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Arricchimento</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro diametro 3 mm</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml 26GA 0,45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Dissociatore GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per lisi di globuli rossi</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Integratore</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x soluzione concentrata</td></tr><tr><td>di penicillina-streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x siero</td></tr><tr><td>fetale di vitello</td><td>concentrato biologico Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Contatore di celle automatizzato portatile</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensori, 40 &; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tubercolina PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gamma; Kit di sviluppo ELISA&nbsp;</td>Kit di sviluppo ELISA per mouse <td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>IL17A.</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4"</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Utilizzato come cannula tracheale per</td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti in polistirene legante ad alto contenuto proteico BAL MAXISORP</td><td>NUNC</td><td></td> 430341 <td></td></tr><tr><td>Albumina, da siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>IgA anti-topo di capra (&alfa;-chain specific)&minus; Anticorpo perossidasi</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetrametilbenzidina (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polimerasi</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>Il kit include tampone 5x</td></tr></tbody></table>

l&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale bcg amministrazione nei topi

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Nonostante la copertura globale della vaccinazione intradermica con BCG, la tubercolosi rimane una delle malattie infettive più diffuse al mondo. I dati preclinici hanno incoraggiato i vaccini contro la tubercolosi polmonare come strategia promettente per prevenire la malattia polmonare, che è responsabile della trasmissione. In questo lavoro, descriviamo la metodologia utilizzata per dimostrare nel modello murino i benefici della vaccinazione BCG intranasale rispetto a quella sottocutanea. I nostri dati hanno rivelato una maggiore efficacia protettiva dopo la somministrazione intranasale di BCG. Inoltre, i nostri risultati indicano che la vaccinazione polmonare innesca una risposta immunitaria più elevata nei polmoni, comprese le risposte Th1 e Th17, nonché un aumento della concentrazione di immunoglobuline A (IgA) nelle vie respiratorie. I nostri dati mostrano una correlazione tra l'efficacia protettiva e la presenza di cellule produttrici di IL17 nei polmoni dopo la sfida da Mycobacterium tuberculosis, suggerendo un ruolo di questa citochina nella risposta protettiva conferita dalla vaccinazione polmonare. Infine, descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro globale che abbiamo sviluppato per studiare la vaccinazione respiratoria nel modello murino, che potrebbe essere estrapolato ad altri vaccini contro la tubercolosi, oltre al BCG, mirando alla risposta della mucosa o ad altre vie di somministrazione polmonare come l'intratracheale o l'aerosol.

Questo lavoro descrive il confronto delle due vie di somministrazione di BCG: sottocutaneo e intranasale. Via di somministrazione sottocutanea è paragonabile al intradermica, che è il percorso clinica corrente BCG mondo. Via intranasale della vaccinazione si propone di imitare la via naturale di infezione di M. tuberculosis, con l&#39;obiettivo di indurre risposta immunitaria direttamente nei polmoni, l&#39;organo bersaglio primario di questo patogeno. <p class="jove_content...

Descriviamo in dettaglio la metodologia seguita per confrontare l'efficacia protettiva e la risposta immunitaria polmonare indotta dall'immunizzazione intranasale e sottocutanea con BCG nel modello murino. I nostri risultati mostrano i benefici della vaccinazione polmonare e suggeriscono un ruolo della risposta mediata da IL17 nella protezione indotta dal vaccino.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le risposte immunitarie nei polmoni dopo la vaccinazione antitubercolare, inclusa l'efficacia protettiva del vaccino contro una sfida intranasale e la risposta immunitaria polmonare locale indotta dal vaccino. Questa metodologia può aiutare a rispondere alle nostre domande fondamentali nel campo del vaccino antitubercolare, inclusa l'identificazione delle risposte immunitarie polmonari difensive attivate dai vaccini polmonari per una protezione immunitaria ottimale a livello polmonare. Un vantaggio di questa metodologia è che la risposta immunitaria polmonare di ciascun animale viene valutata singolarmente in parallelo con l'efficacia protettiva.consentendo l'identificazione dei parametri immunitari specifici che si correlano con la protezione. Per la somministrazione sottocutanea del vaccino BCG, riempire innanzitutto una siringa da un millilitro munita di un ago da 26 gauge con un millilitro della sospensione del vaccino BCG ed eliminare le bolle d'aria. Successivamente, posizionare un topo anestetizzato in posizione prona all'interno di una cappa a flusso laminare e inoculare l'animale per via sottocutanea con 100 microlitri di batteri in una coscia posteriore.Per l'amministrazione intranasale, caricare una micropipetta con 20 microlitri di sospensione di BCG e posizionare il topo anestetizzato in posizione supina all'interno della cappa. Somministrare l'inoculo goccia a goccia tra le due narici fino a quando l'intero volume di 20 microlitri non è stato depositato, lasciando un intervallo tra le gocce per permettere al topo di inalare la sospensione. Successivamente, ricaricare la micropipetta con altri 20 microlitri di batteri e ripetere la somministrazione.Per la sfida intranasale con il ceppo di Mycobacterium tuberculosis H37Rv, al tempo sperimentale appropriato successivo alla vaccinazione, inoculare gli animali mediante somministrazione intranasale di 40 microlitri della sospensione batterica di H37Rv come appena dimostrato. Per ottenere il lavaggio broncoalveolare o il campione ball, utilizzare prima pinze sterili e forbici per esporre la trachea. Successivamente, praticare una piccola incisione nella trachea, avendo cura di non escindere completamente il tessuto, e inserire una cannula collegata a una siringa sterile da 1 mL contenente 800 microlitri di PBS freddo ghiacciato.Quando la cannula è in posizione, riempire con attenzione i polmoni con il PBS, quindi ritirare lentamente lo stantuffo per recuperare almeno da 500 a 600 microlitri di liquido di lavaggio. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL posta sul ghiaccio e verificare che la sospensione sia incolore, indicando l'assenza di contaminazione ematica. Conservare i campioni sul ghiaccio fino all'elaborazione del campione.Per determinare il carico batterico e la risposta immunitaria nei polmoni, fissare il topo con aghi in posizione supina su una superficie piana e disinfettata all'interno della cappa a flusso laminare ed effettuare un'incisione nella pelle superiore del torace. Successivamente, sollevare la pelle per esporre la zona toracica ed aprire i polmoni. Utilizzare forbici e pinze sterili per prelevare i polmoni e il cuore, e posizionare gli organi su una superficie pulita.Quindi, rimuovere il cuore, la trachea e il tessuto connettivo. Posizionare ciascun polmone in un tubo da 1,5 mL diverso contenente 1 mL di acqua deionizzata su ghiaccio per la successiva determinazione del carico batterico e delle risposte immunitarie cellulari. Rispetto alla via sottocutanea, la via di vaccinazione intranasale conferisce un'efficacia protettiva molto maggiore nei polmoni.L'analisi di un numero rappresentativo di colonie appartenenti al gruppo vaccinato con BCG per via intranasale, mediante PCR specifica per la regione genomica RD9, dimostra che tutte le colonie producono un frammento di 0,4 chilo paia di basi corrispondente a H37Rv. Il BCG somministrato per via intranasale induce livelli più elevati di IL17 e di interferone gamma nei polmoni, rivelando una correlazione tra l'efficacia protettiva conferita dalla vaccinazione intranasale con BCG e la risposta immunitaria indotta dal vaccino nei polmoni prima della sfida, nonché una concentrazione più alta sia di IgA totale sia di IgA specifica per il derivato proteico purificato di H37Rv nei campioni di lavaggio osservata nei soggetti vaccinati per via intranasale. Un'ulteriore analisi delle cellule produttrici di citochine nei polmoni dopo la sfida con il tubercolosi ha rivelato che, sebbene cellule produttrici di interferone gamma fossero presenti in tutti i gruppi infetti, cellule CD4+ produttrici di IL17A erano presenti soltanto nel gruppo vaccinato con BCG per via intranasale, dimostrando una correlazione significativa tra la presenza di IL17 e la riduzione del carico batterico polmonare.Seguendo questa procedura, è possibile confrontare le risposte immunitarie locali a livello polmonare nell'uso di vaccini antitubercolari biodiversi, nonché diverse vie di somministrazione e diversi tempi successivi alla sfida infettiva. Inoltre, questa metodologia può essere utilizzata per valutare l'immunità indotta dalla vaccinazione dopo la sfida, consentendo l'identificazione delle risposte immunitarie correlate alla protezione.È importante sottolineare che il lavoro con Mycobacterium tuberculosis richiede strutture di laboratorio esenti da BCL, e le opportune precauzioni devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, descriviamo un protocollo per testare l'efficacia di un vaccino acellulare contro la pertosse contro l'infezione da Bordetella pertosse nei topi. Dopo la vaccinazione, i topi sono stati sottoposti a infezione e il loro omogenato tissutale è stato coltivato per analizzare le colonie batteriche come lettura dell'immunità protettiva indotta dal vaccino.

Valutazione dell'immunità indotta da vaccino contro l'infezione batterica in un modello murino

Questo video dimostra l'immunizzazione BCG intranasale nei topi, attivando risposte immunitarie sia innate che adattative, portando allo sviluppo di cellule T di memoria residenti nei polmoni e cellule B effettrici, migliorando così la protezione contro le infezioni da Mycobacterium.

Immunizzazione intranasale con BCG in un modello murino

Vaccinazione profilattica e terapeutica spesso non riesce a stimolare forti risposte immunitarie dovuto settimana drenaggio del vaccino ai linfonodi e conseguente scarsa coinvolgimento delle cellule immunitarie. Mediante iniezione diretta di vaccino da linfonodi, cosiddetta iniezione endolinfatica, l'efficacia del vaccino può essere fortemente migliorata e dosi di vaccino può essere ridotta.

Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Il presente lavoro illustra la convenienza dell'uso dell'immunoterapia sublinguale per aumentare la risposta immunitaria innata nei polmoni e conferire protezione contro la polmonite pneumococcica acuta nel topo.

L&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Lo sviluppo del test ELISpot interferone per la cavia PBMCs permette la caratterizzazione delle risposte delle cellule T in questo modello altamente rilevante per lo studio delle malattie infettive. Abbiamo applicato il test per misurare le risposte delle cellule T associate intradermica consegna di vaccini a DNA.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Scopri la vaccinazione BCG intranasale nei topi per confrontare l'efficacia protettiva polmonare con la via sottocutanea. Questo metodo identifica i parametri immunitari correlati alla protezione contro la tubercolosi.

L'efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

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