L'efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi
19 settembre 2016
Descriviamo in dettaglio la metodologia seguita per confrontare l'efficacia protettiva e la risposta immunitaria polmonare indotta dall'immunizzazione intranasale e sottocutanea con BCG nel modello murino. I nostri risultati mostrano i benefici della vaccinazione polmonare e suggeriscono un ruolo della risposta mediata da IL17 nella protezione indotta dal vaccino.
L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le risposte immunitarie nei polmoni dopo la vaccinazione antitubercolare, inclusa l'efficacia protettiva del vaccino contro una sfida intranasale e la risposta immunitaria polmonare locale indotta dal vaccino. Questa metodologia può aiutare a rispondere alle nostre domande fondamentali nel campo del vaccino antitubercolare, inclusa l'identificazione delle risposte immunitarie polmonari difensive attivate dai vaccini polmonari per una protezione immunitaria ottimale a livello polmonare. Un vantaggio di questa metodologia è che la risposta immunitaria polmonare di ciascun animale viene valutata singolarmente in parallelo con l'efficacia protettiva.
consentendo l'identificazione dei parametri immunitari specifici che si correlano con la protezione. Per la somministrazione sottocutanea del vaccino BCG, riempire innanzitutto una siringa da un millilitro munita di un ago da 26 gauge con un millilitro della sospensione del vaccino BCG ed eliminare le bolle d'aria. Successivamente, posizionare un topo anestetizzato in posizione prona all'interno di una cappa a flusso laminare e inoculare l'animale per via sottocutanea con 100 microlitri di batteri in una coscia posteriore.
Per l'amministrazione intranasale, caricare una micropipetta con 20 microlitri di sospensione di BCG e posizionare il topo anestetizzato in posizione supina all'interno della cappa. Somministrare l'inoculo goccia a goccia tra le due narici fino a quando l'intero volume di 20 microlitri non è stato depositato, lasciando un intervallo tra le gocce per permettere al topo di inalare la sospensione. Successivamente, ricaricare la micropipetta con altri 20 microlitri di batteri e ripetere la somministrazione.
Per la sfida intranasale con il ceppo di Mycobacterium tuberculosis H37Rv, al tempo sperimentale appropriato successivo alla vaccinazione, inoculare gli animali mediante somministrazione intranasale di 40 microlitri della sospensione batterica di H37Rv come appena dimostrato. Per ottenere il lavaggio broncoalveolare o il campione ball, utilizzare prima pinze sterili e forbici per esporre la trachea. Successivamente, praticare una piccola incisione nella trachea, avendo cura di non escindere completamente il tessuto, e inserire una cannula collegata a una siringa sterile da 1 mL contenente 800 microlitri di PBS freddo ghiacciato.
Quando la cannula è in posizione, riempire con attenzione i polmoni con il PBS, quindi ritirare lentamente lo stantuffo per recuperare almeno da 500 a 600 microlitri di liquido di lavaggio. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL posta sul ghiaccio e verificare che la sospensione sia incolore, indicando l'assenza di contaminazione ematica. Conservare i campioni sul ghiaccio fino all'elaborazione del campione.
Per determinare il carico batterico e la risposta immunitaria nei polmoni, fissare il topo con aghi in posizione supina su una superficie piana e disinfettata all'interno della cappa a flusso laminare ed effettuare un'incisione nella pelle superiore del torace. Successivamente, sollevare la pelle per esporre la zona toracica ed aprire i polmoni. Utilizzare forbici e pinze sterili per prelevare i polmoni e il cuore, e posizionare gli organi su una superficie pulita.
Quindi, rimuovere il cuore, la trachea e il tessuto connettivo. Posizionare ciascun polmone in un tubo da 1,5 mL diverso contenente 1 mL di acqua deionizzata su ghiaccio per la successiva determinazione del carico batterico e delle risposte immunitarie cellulari. Rispetto alla via sottocutanea, la via di vaccinazione intranasale conferisce un'efficacia protettiva molto maggiore nei polmoni.
L'analisi di un numero rappresentativo di colonie appartenenti al gruppo vaccinato con BCG per via intranasale, mediante PCR specifica per la regione genomica RD9, dimostra che tutte le colonie producono un frammento di 0,4 chilo paia di basi corrispondente a H37Rv. Il BCG somministrato per via intranasale induce livelli più elevati di IL17 e di interferone gamma nei polmoni, rivelando una correlazione tra l'efficacia protettiva conferita dalla vaccinazione intranasale con BCG e la risposta immunitaria indotta dal vaccino nei polmoni prima della sfida, nonché una concentrazione più alta sia di IgA totale sia di IgA specifica per il derivato proteico purificato di H37Rv nei campioni di lavaggio osservata nei soggetti vaccinati per via intranasale. Un'ulteriore analisi delle cellule produttrici di citochine nei polmoni dopo la sfida con il tubercolosi ha rivelato che, sebbene cellule produttrici di interferone gamma fossero presenti in tutti i gruppi infetti, cellule CD4+ produttrici di IL17A erano presenti soltanto nel gruppo vaccinato con BCG per via intranasale, dimostrando una correlazione significativa tra la presenza di IL17 e la riduzione del carico batterico polmonare.
Seguendo questa procedura, è possibile confrontare le risposte immunitarie locali a livello polmonare nell'uso di vaccini antitubercolari biodiversi, nonché diverse vie di somministrazione e diversi tempi successivi alla sfida infettiva. Inoltre, questa metodologia può essere utilizzata per valutare l'immunità indotta dalla vaccinazione dopo la sfida, consentendo l'identificazione delle risposte immunitarie correlate alla protezione.
È importante sottolineare che il lavoro con Mycobacterium tuberculosis richiede strutture di laboratorio esenti da BCL, e le opportune precauzioni devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo studio analizza le risposte immunitarie nei polmoni dopo la vaccinazione antitubercolare, confrontando l'efficacia protettiva della vaccinazione BCG intranasale e sottocutanea in un modello murino. I risultati evidenziano i vantaggi della vaccinazione polmonare e il ruolo dell'IL17 nella protezione indotta dal vaccino.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Vaccinologia
- Salute respiratoria
Sfondo
- Comprendere le risposte immunitarie alla tubercolosi è fondamentale per lo sviluppo di vaccini.
- Il BCG è un vaccino ampiamente utilizzato, ma la via di somministrazione potrebbe influenzarne l'efficacia.
- La vaccinazione intranasale potrebbe potenziare le risposte immunitarie locali nei polmoni.
- L'IL17 è una citochina che potrebbe svolgere un ruolo nell'immunità protettiva.
Scopo dello studio
- Confrontare l'efficacia protettiva della vaccinazione BCG intranasale rispetto a quella sottocutanea.
- Valutare le risposte immunitarie locali indotte dalla vaccinazione polmonare.
- Identificare i parametri immunitari correlati alla protezione indotta dal vaccino.
Metodi Utilizzati
- Modello murino utilizzato per valutare le risposte immunitarie.
- Somministrazione intranasale e sottocutanea del vaccino BCG.
- Valutazione delle risposte immunitarie polmonari in parallelo con l'efficacia protettiva.
- Misurazione delle risposte mediate da IL17 dopo la vaccinazione.
Risultati principali
- La vaccinazione intranasale ha mostrato un'efficacia protettiva potenziata rispetto all'amministrazione sottocutanea.
- Sono state osservate significative risposte immunitarie mediate da IL17 nei polmoni.
- Sono stati identificati parametri immunitari specifici che si correlano con la protezione.
- La metodologia consente la valutazione individuale delle risposte immunitarie.
Conclusioni
- La vaccinazione polmonare potrebbe offrire una protezione superiore contro la tubercolosi.
- IL17 svolge un ruolo cruciale nella risposta immunitaria al vaccino BCG.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per ottimizzare le strategie vaccinali finalizzate all'immunità polmonare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo studio dimostra che le vie di vaccinazione polmonare possono potenziare l'efficacia protettiva contro i patogeni respiratori inducendo risposte immunitarie localizzate, tra cui Th1, Th17 e IgA mucosale, che sono fondamentali per lo sviluppo di vaccini contro la tubercolosi. La correlazione tra cellule produttrici di IL17 nei polmoni e la riduzione del carico batterico dopo la sfida fornisce un biomarcatore meccanicistico per prevedere l'efficacia del vaccino nei modelli preclinici. Questi risultati sostengono la valutazione di strategie di immunizzazione mucosale nelle fasi iniziali della scoperta, al fine di ridurre i rischi nella validazione del bersaglio e migliorare la continuità traslazionale per i candidati vaccini polmonari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche confrontando le vie di somministrazione del vaccino e il loro impatto sulla protezione immunitaria specifica del polmone.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato per valutare in parallelo l'efficacia protettiva e le risposte immunitarie, riducendo la variabilità negli studi di validazione degli obiettivi.
- Valore predittivo: Identifica le cellule CD4+ produttrici di IL17 nei polmoni come biomarcatore correlativo di protezione, supportando la riduzione del rischio meccanicistica dei candidati vaccino.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative come carica batterica nei polmoni, profili di citochine e concentrazioni di IgA nel lavaggio broncoalveolare per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Stabilisce procedure riproducibili per il profilo immunitario polmonare e modelli di sfida applicabili ad altri vaccini antitubercolari o sistemi di somministrazione polmonare.
- Riutilizzo della piattaforma: Favorisce la scalabilità su diversi candidati vaccinali mirati all'immunità mucosale mediante somministrazione intranasale, intratracheale o aerosol.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la continuità traslazionale collegando le risposte immunitarie polmonari (Th1, Th17, IgA) alla protezione contro la sfida con Mycobacterium tuberculosis.
- Valore operativo: Permette decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, correlando parametri immunitari locali con esiti di efficacia.
- Convalida predittiva: Supporta la valutazione dell'immunità indotta dal vaccino in diversi punti temporali e modelli di sfida, al fine di informare la continuità preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto leader fino alla valutazione preclinica, consentendo una valutazione dipendente dalla via di somministrazione dell'immunità polmonare indotta dal vaccino e della protezione conferita.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come la via di somministrazione influenzi le risposte immunitarie polmonari e l'efficacia protettiva contro la tubercolosi.
- Screening: Fornisce sistemi biologici pronti per il saggio con letture standardizzate per il carico batterico, la produzione di citochine e l'IgA mucosale per confrontare formulazioni vaccinali.
- Analisi: Offre misurazioni quantitative di IL-17, IFN-gamma e IgA specifica per l'antigene nel tessuto polmonare e nel lavaggio broncoalveolare, consentendo analisi comparative tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega le risposte immunitarie locali nei polmoni agli esiti di protezione, favorendo un avanzamento allineato ai biomarcatori dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di vaccini polmonari mirati a patogeni respiratori, adattabile ad altre vie di somministrazione oltre il BCG.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva identificando i correlati immunitari della protezione, riducendo l'ambiguità meccanicistica nello sviluppo dei vaccini.
- Valore operativo: Promuove la standardizzazione e la riproducibilità attraverso procedure definite per vaccinazione, sfida infettiva e caratterizzazione immunitaria polmonare.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento/cessazione collegando precoci biomarcatori immunitari all'efficacia, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi vaccinali contro la tubercolosi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sul rischio dei candidati vaccinali in base all'induzione di risposte immunitarie mucosali e ai profili di protezione polmonare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nei modelli murini di tubercolosi, nell'amministrazione di vaccini per via polmonare e nell'elaborazione dei tessuti polmonari.
- Dipende da infrastrutture BSL-3 per la manipolazione sicura di ceppi di Mycobacterium tuberculosis utilizzati nella sfida infettiva.
- Necessita di una formazione standardizzata per le tecniche di inoculazione intranasale e sottocutanea al fine di garantire l'accuratezza della dose.
- Richiede saggi validati per il rilevamento di citochine (ad esempio, IL17, IFN-gamma) e per la quantificazione di immunoglobuline nel lavaggio broncoalveolare.
- L'adattamento ad altre vie polmonari (intratracheale, aerosol) potrebbe richiedere un'ottimizzazione del volume di somministrazione e della posizione dell'animale.
