Misurazione quantitativa dei livelli relativi dell'acido retinoico nelle E8.5 embrioni e neurosfere Culture Utilizzando il F9 RARE-LacZ cellulare a base di Reporter Assay

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare quantitativamente i livelli relativi di acido retinoico in preparati di tessuto, come embrioni di topo a 8,5 giorni (E8.5) o colture di neurosfere adulte, utilizzando un saggio con cellule reporter. Sebbene la via di segnalazione dell'acido retinoico sia ben caratterizzata, la misurazione istologica diretta dell'acido retinoico è tecnicamente impraticabile. Questo saggio può contribuire a rispondere a domande fondamentali su come le mutazioni genetiche possano influenzare i livelli di acido retinoico.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che è altamente sensibile e versatile, con la capacità di misurare un'ampia gamma di concentrazioni di acido retinoico (RA) in diversi tipi di campioni tissutali. Sebbene questo metodo possa fornire un'informazione diretta per determinare i livelli di RA in vari campioni tissutali, può essere applicato anche ad altri studi, come la determinazione della presenza o assenza di enzimi metabolici del RA monitorando le variazioni dei livelli di RA. Prima di iniziare qualsiasi esperimento, verificare la risposta delle cellule F9 RARE-LacZ all'RA. Aggiungere un nanomolare di RA all-trans a cellule F9 RARE-LacZ seminate in una piastra a 96 pozzetti.

Quindi, incubare la piastra e coltivare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, eseguire la colorazione con LacZ e verificare la presenza di un precipitato blu nelle cellule. Se il colore non è uniforme in tutte le cellule, procedere al subclonaggio delle cellule.

Dividere le colture selezionate in piatti da 10 centimetri a 100.000 cellule per 10 millilitri. Dopo due giorni di coltura, preparare una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di gelatina 0,2% per pozzetto e lasciare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, rimuovere la gelatina e risciacquare i pozzetti due volte con 500 microlitri di acqua distillata.

Ora, aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura F9 RARE-LacZ nei pozzetti. Successivamente, selezionare le colonie di cellule F9 utilizzando una punta sterile per pipetta P10 e trasferirne ciascuna in un pozzetto. Dopo tre o quattro giorni di coltura, suddividere le colonie in due piastre da 24 pozzetti rivestite con gelatina, una per i test e l'altra per l'espansione.

Dopo altri due giorni di coltura, aggiungere un nanomolare di RA in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e coltivare durante la notte. Il giorno successivo, eseguire una colorazione con LacZ per verificare i risponditori elevati ed espandere la coltura corrispondente. Un giorno prima del prelievo degli embrioni E8.5 o della dissociazione dei neurosfere, rivestire una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di gelatina allo 0,2% per pozzetto e lasciare la piastra in posa per 30 minuti.

Quindi, aspirare il gelatina e risciacquare i pozzetti due volte con 200 microlitri di acqua distillata. Successivamente, trattare con tripsina le cellule F9 RARE-LacZ selezionate mantenute in piastre da 10 centimetri. Quindi, seminare 100.000 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando mezzo di coltura senza G418.

Caricare un numero sufficiente di pozzetti per coltivare in co-coltura ciascun embrione, oppure preparare tre pozzetti per genotipo se si lavora con neurosfere. Preparare inoltre 24 pozzetti per la curva standard. Incubare quindi la piastra per 24 ore.

Per la coltura cellulare di cellule embrionali, iniziare la dissezione di embrioni E8,5. Successivamente, caricare un nuovo tubo da 1,5 millilitri con 10 microlitri di tripsina e, utilizzando una punta allargata per pipetta P20, trasferire l'intero embrione nel tubo, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio. Dopo aver isolato tutti gli embrioni, incubare tutti i tubi a 37 gradi Celsius per cinque minuti per dissociare i tessuti.

Dopo cinque minuti, triturare delicatamente il contenuto di ogni tubo utilizzando una punta pipetta P20 e trasferire 10 microlitri in una pozzetta della piastra a 96 pozzetti preparata con cellule F9 RARE-LacZ. Colture la piastra durante la notte. Per le colture co-colturali di neurosfere, iniziare trasferendo una coltura di neurosfere in tubi da 15 millilitri.

Centrifugare i tubi a 200 g per 10 minuti ed eliminare tutto il soprannatante tranne un millilitro. Quindi, triturare il contenuto con una pipetta P1000. Ora, utilizzare un piccolo volume per determinare la densità delle cellule dissociate.

Quindi, piastrare 100.000 cellule di neurosfera dissociate sopra le cellule F9 RARE-LacZ. Caricare tre pozzetti per ogni tipo di coltura di neurosfera. A questo punto, assicurarsi di preparare i pozzetti per la curva standard.

In triplice copia, aggiungere 100 microlitri di soluzioni di acido retinoico tutto-trans preparate mediante diluizione seriale a sette concentrazioni diverse nel mezzo di coltura F9 RARE-LacZ. Includere controlli negativi di cellule non trattate. Infine, coltivare la piastra a 96 pozzetti completamente caricata durante la notte.

Il giorno successivo, rimuovere il mezzo e fissare le colture utilizzando 100 microlitri di glutaraldeide al 2,5% per pozzetto. Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, rimuovere il fissativo e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS per 10 minuti per ogni lavaggio.

Successivamente, lavare i pozzetti tre volte con 200 microlitri di soluzione di lavaggio LacZ per 10 minuti per ogni lavaggio. Durante il terzo lavaggio, preparare la soluzione di colorazione X-gal in un tubo da 15 millilitri avvolto nella pellicola d'alluminio. Inoltre, preparare una camera umidificata per la piastra a 96 pozzetti.

Ora, aggiungere 200 microlitri della soluzione di colorazione X-gal in ogni pozzetto. Posizionare la piastra all'interno della camera umidificata e incubare a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di colorazione LacZ e sostituirla con 200 microlitri di PBS.

Quindi, misurare l'assorbanza a 610 nanometri e acquisire un'immagine della piastra. La linea cellulare reporter F9 RARE-LacZ è composta da cellule di carcinoma embrionale aderenti che rispondono in modo quantitativo all'acido retinoico con un'induzione proporzionale della beta-galattosidasi. Presentano inoltre una morfologia epiteliale.

Nonostante la coltura con selezione mediante G418, la risposta di queste cellule all'acido retinoico si indebolirà dopo diverse passaggi. Pertanto, è necessario effettuare un subclonaggio periodico per garantire cellule risponditrici forti e uniformi all'acido retinoico. Ci si aspetta che embrioni E8.5 omozigoti per la mutazione vl in Gpr161 mostrino una riduzione del segnale di acido retinoico nell'embrione. Utilizzando il saggio di co-coltura qui descritto, in cui embrioni dissociati vengono coltivati insieme a cellule F9 RARE-LacZ, questa previsione è stata confermata.

La coltura condivisa di neurosfere derivate da adulti di tipo selvaggio con cellule F9 RARE-LacZ è stata utilizzata anche per verificare la presenza di RA nelle colture di neurosfere. L'aumento della colorazione, rispetto alle cellule allo stadio E8.5, potrebbe essere dovuto all'omogeneità delle colture di neurosfere. Generando una curva standard per i livelli di RA, il livello di RA è stato quantificato nelle colture di neurosfere di tipo selvaggio e negli embrioni E8.5.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, ricordarsi di mantenere, mediante subclonazione periodica, cellule F9 RARE-LacZ che rispondono in modo marcato all'RA. Inoltre, assicurarsi di dissociare accuratamente il campione per favorire una distribuzione omogenea e una misurazione costante dell'RA. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile studiare gli effetti delle mutazioni genetiche sui livelli di RA e successivamente eseguire altri metodi per determinare quali componenti della via di segnalazione dell'RA sono direttamente coinvolti.