Metodi per la determinazione strutture UV-riflettenti e determinare la loro importanza nella Mate Preferenze utilizzando il Sailfin Molly Poecilia latipinna
14 settembre 2016
Questo protocollo descrive l'uso di spettrofotometria di rilevare strutture ultravioletti che riflette sugli organismi (in questo esempio, il sailfin Molly Poecilia latipinna) e descrive test a scelta dicotomiche per i pesci che permettono inferenze da apportare sul ruolo di spunti ultravioletti durante la selezione compagno.
L'obiettivo generale del rilevamento della riflettanza UV su pesci come la Poecilia latipinna è quello di capire come le strutture riflettenti i raggi UV potrebbero influenzare il comportamento di accoppiamento della specie. Questo metodo può aiutarci a capire le preferenze di accoppiamento, ad esempio se i segnali UV sono importanti e, in tal caso, se sono utilizzati da entrambi i sessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di rilevare segnali che potrebbero non essere visibili per noi, ma che potrebbero essere molto importanti per i pesci.
Per questo protocollo, calibrare prima uno spettrofotometro e una sorgente luminosa su uno standard di bianco noto. Le luci della stanza devono essere basse prima di tutte le calibrazioni. Calibrare lo strumento su tutte le lunghezze d'onda che verranno misurate che devono includere le lunghezze d'onda UV comprese tra 300 e 400 nanometri.
Ora, indossa i guanti e anestetizza il pesce in una soluzione al 5% di sale di acido etil-3-amminobenzoato metano solfonico, noto come MS222 tamponato con una quantità uguale di bicarbonato di sodio. Quando il pesce non risponde, trasferiscilo immediatamente su uno sfondo nero non riflettente. Prima di effettuare le misurazioni, abbassare nuovamente le luci della stanza.
Per registrare i dati di riflettanza, utilizzare un software di analisi. Per abbinare l'impostazione qui, impostare il tempo di integrazione su 2000 secondi. Impostare il numero medio di scansioni su due e impostare il valore di levigatura dei pixel su cinque.
Ora, misura la riflettanza del pesce usando una sonda a fibra ottica. Tenere la sonda per creare un angolo di 45 gradi tra la fibra ottica e il corpo. Eseguire una media di diverse scansioni per regione del corpo.
Controlla la riflettanza per diverse aree del corpo e cerca la variazione tra gli individui. Al termine, applicare facoltativamente un protettivo commerciale per ripristinare il rivestimento di muco e quindi riportare il pesce in una vasca di contenimento ben ossigenata. Una volta recuperato, il pesce mostrerà un normale battito dell'opercolo e il nuoto.
Questo test si avvale di un serbatoio a compartimenti scelti dotato di filtri UV e opachi. Quando le pareti divisorie in plexiglass vengono rimosse, un pesce nel compartimento neutro è in grado di visualizzare lo spettro completo o la luce non UV grazie ai filtri in diverse parti della vasca. Per la P.latipinna, utilizzare un acquario di prova da 75,7 litri.
Prima di ogni test, assicurarsi che le tre sezioni del serbatoio non condividano segnali acquatici o olfattivi. Utilizzare individui sessualmente ricettivi per il test. Per una femmina di P. latipinna, scegli il pesce entro 48 ore dopo il parto e usa maschi che sono stati isolati per almeno 24 ore.
Per eseguire il test, trasferire prima l'animale da esperimento nello scomparto neutro. Successivamente, scegli due potenziali partner di accoppiamento che si assomiglino il più possibile per dimensioni, colorazione e caratteristiche di visualizzazione. L'abbinamento dei colori può essere effettuato con precisione con gli strumenti o approssimativamente a occhio.
Ora, sotto l'illuminazione a spettro completo, posiziona uno dei due potenziali compagni in ciascuno dei due scomparti di scelta. I filtri opachi e UV e i divisori degli scomparti devono essere tutti in posizione. Lascia che gli animali si acclimatino a questa condizione per 15 minuti.
Per ogni prova, assegna in modo casuale quale scomparto ha il filtro UV. Quindi, rimuovere le coperture opache dai divisori. Dopo 15 minuti, inizia a registrare il tempo che l'individuo focale trascorre all'interno di specifiche zone di preferenza utilizzando un cronometro.
L'area all'interno di due lunghezze corporee di un compartimento scelto costituisce una zona di preferenza. In alternativa, utilizzare il software di registrazione degli eventi. Registra l'attività del pesce per 15 minuti.
Se il pesce non visita ogni zona di preferenza almeno una volta, consideralo come se non rispondesse ed escludilo dai dati dello studio. La misurazione della riflettanza UV di P. latipinna mostra che entrambi i sessi hanno caratteristiche UV che variano da individuo a individuo. I tratti sono più prominenti lungo i lati del corpo.
Una volta trovati i tratti UV, il test di discriminazione ha rivelato che le femmine, ma non i maschi, usavano queste caratteristiche nelle loro decisioni di accoppiamento. Poiché entrambi i sessi possiedono tratti UV, è possibile che siano coinvolti in altre interazioni sociali come il branco o il foraggiamento. Una volta padroneggiate, le tecniche di misurazione UV possono essere eseguite in meno di due ore.
Le prove di preferenza di accoppiamento possono essere completate in meno di un'ora per ogni pesce. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante assicurarsi che i pesci siano ricettivi dal punto di vista riproduttivo. Seguendo questa procedura, potrebbero essere testati ulteriori esperimenti per studiare il ruolo dei tratti UV nel riconoscimento di individui o specie.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della spettrofotometria per rilevare strutture riflettenti la luce ultravioletta negli organismi, in particolare nel pesce molly velato Poecilia latipinna. Vengono descritti test di scelta dicotomica per pesci che permettono di trarre conclusioni sul ruolo dei segnali ultravioletti durante la selezione del partner.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ecologia Comportamentale
- Comunicazione Animale
Sfondo
- Comprendere la riflettanza UV nei pesci può fornire informazioni sui comportamenti riproduttivi.
- I segnali UV possono svolgere un ruolo significativo nella scelta del partner.
- La rilevazione della riflettanza UV richiede tecniche specializzate.
- I pesci possono percepire segnali che sono invisibili agli esseri umani.
Scopo dello studio
- Studiare l'impatto delle strutture riflettenti l'UV sul comportamento riproduttivo.
- Stabilire se i segnali UV sono importanti per la scelta del partner in Poecilia latipinna.
- Valutare l'utilizzo dei segnali UV da parte di entrambi i sessi durante l'accoppiamento.
Metodi Utilizzati
- Calibrazione di uno spettrofotometro e di una sorgente luminosa su un bianco standard noto.
- Misurazione di lunghezze d'onda UV comprese tra 300 e 400 nanometri.
- Esecuzione di test a scelta dicotomica con pesci.
- Osservazione delle preferenze riproduttive in base a segnali UV.
Risultati principali
- Identificazione di strutture riflettenti l'UV in Poecilia latipinna.
- Evidenze che i segnali UV influenzano la selezione del compagno.
- I risultati suggeriscono che entrambi i sessi potrebbero utilizzare segnali UV.
- Dimostrazione dell'efficacia della spettrofotometria nella ricerca biologica.
Conclusioni
- La riflettanza UV svolge un ruolo cruciale nel comportamento riproduttivo di Poecilia latipinna.
- Comprendere questi segnali può migliorare la conoscenza della comunicazione nei pesci.
- I metodi descritti possono essere applicati ad altre specie per studi simili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
Comprendere i segnali sensoriali non visivi, come la riflettanza UV, amplia la validazione degli obiettivi nelle neuroscienze comportamentali, rivelando vie meccanicisticamente rilevanti nei processi decisionali sociali. Questo saggio consente lo screening fenotipico di comportamenti dipendenti da stimoli, supportando la riduzione del rischio meccanicistico in modelli preclinici in cui la percezione sensoriale influenza la risposta terapeutica. Il metodo fornisce output quantitativi e riproducibili che migliorano l'affidabilità predittiva negli studi di interazione con l'obiettivo che coinvolgono circuiti neurali che regolano la scelta del partner e l'affiliazione sociale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche riguardo ai comportamenti guidati dai sensi isolando la riflettanza UV come variabile biologica misurabile.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante la rilevazione standardizzata di strutture riflettenti l'UV tra individui e sessi diversi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio determinando se i segnali UV influenzano in modo significativo le decisioni riproduttive nelle femmine di molly dorata.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi confermando la presenza e la variabilità del tratto UV lungo le regioni del corpo.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione del saggio mediante la calibrazione dello spettrofotometro alle lunghezze d'onda UV (300–400 nm) e un posizionamento costante della sonda a fibra ottica a 45 gradi.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma, con la misurazione UV completata in meno di due ore per pesce.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza per le malattie collegando la scelta del compagno mediata da UV a interazioni sociali più ampie, come il nuotare in gruppo o la ricerca di cibo, indicando possibili ruoli nel riconoscimento delle specie.
- Avanzamento Corretto per il Rischio: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mostrando che i tratti UV sono presenti in entrambi i sessi ma rilevanti dal punto di vista comportamentale solo nelle femmine, fornendo informazioni per modelli di risposta specifici per sesso.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo di de-risking dimostrando come la manipolazione di stimoli sensoriali (filtri bloccanti UV) alteri l'output comportamentale in test di scelta dicotomica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posiziona il metodo all'interno del continuum della scoperta, dall'Early Discovery all'Identificazione del Lead, sostenendo la verifica delle ipotesi sui percorsi sensoriali e il fenotipaggio comportamentale prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi quantificando la variazione della riflettanza UV e collegandola alle zone di preferenza nell'accoppiamento definite come entro due lunghezze corporee di un compartimento di scelta.
- Screening: Descrive la preparazione del saggio attraverso la progettazione di un test a scelta dicotomica che utilizza filtri UV e opachi in un acquario da 75,7 litri, consentendo una valutazione affidabile di agenti modulatori sensoriali.
- Analisi: Evidenzia misurazioni come il tempo trascorso nelle zone di preferenza registrato mediante cronometro o software per la registrazione degli eventi, fornendo letture quantitative per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica dimostrando che i tratti UV potrebbero essere alla base del riconoscimento individuale o specifico, suggerendo un potenziale allineamento con biomarcatori nei modelli di comportamento sociale.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, applicabile a diverse specie di pesci per il rilevamento di segnali UV e la standardizzazione dei saggi comportamentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei comportamenti guidati dai sensi.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della misurazione della riflettanza UV e dei test di preferenza del compagno.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate, identificando precocemente l'utilizzo di segnali specifici per sesso.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate sulla rilevanza delle influenze dei segnali UV nella selezione del compagno nelle popolazioni bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in spettrofotometria, manipolazione dei pesci e protocolli di osservazione del comportamento.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi spettrofotometro calibrato su 300–400 nm, sonda a fibra ottica, anestetico MS222 e serbatoio a compartimenti con filtri UV/opachi.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi per i protocolli di anestesia (MS222 al 5% tamponato con bicarbonato di sodio), le condizioni di illuminazione e le definizioni delle zone di preferenza.
- Considerazioni adattative tra sistemi modello, inclusa la localizzazione dei tratti UV specifica per specie e la selezione di individui sessualmente recettivi (femmine entro 48 ore dal parto, maschi isolati per 24 ore).
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura: i pesci devono mostrare risposta riproduttiva; il mancato accesso a ciascuna zona di preferenza almeno una volta comporta l'esclusione dai dati dell'esperimento.
