Name: Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Scopri come creare impalcature cardiache neonatali da tessuto murino per studi rigenerativi. Questa tecnica permette di analizzare le interazioni cella-matrice e le proprietà uniche della matrice extracellulare neonatale.

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Gli autori ringraziano la signora Cynthia DeKay per la preparazione delle figure.

Tutti gli esperimenti di topo sono stati eseguiti in conformità con Animal Welfare Act degli Stati Uniti e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l&#39;Università del Minnesota. 1. Metodo per l&#39;isolamento Cuore mouse <ol><li> Euthanize un mouse neonatale per decapitazione con una sola lama utilizzo. </li><li> Tampone torace con il 70% di etanolo. </li><li> Sezionare la pelle dal petto tagliando via dalla parete toracica con le forbici standard, tirando la pelle lateralmente una coppia di pinze # 5. </li><li> Perforare l&#39;addome appena inferiore allo sterno con le forbici tagliando attraverso la parete addominale. Afferrando il processo xifoideo con # 5 pinze, ritrarre lo sterno rostralmente dal corpo durante il taglio se le costole su entrambi i lati del torace con le forbici. La gabbia toracica si riflette superiormente con la pinza per rivelare il cuore. </li><li> Senza mezzi termini sezionare i due lobi principali del timo tirando lateralmente # 5 pinze, esponendol&#39;arco dell&#39;aorta, nonché le vene cavali e polmonari. </li><li> Transetto le principali arterie dall&#39;arco aortico e l&#39;aorta in sé, con le forbici a molla 10 cm. Conservare l&#39;aorta tra la base del cuore e l&#39;arteria anonima. Afferrare le estremità dei vasi mozzate con il # 5 pinze per riflettere cuore avanti, separandolo dalla trachea e dell&#39;esofago. </li><li> Transect vascolare polmonare e altre grandi vene, tagliando tra i polmoni e il cuore su entrambi i lati del cuore con le forbici a molla 10 cm. Le vene rimangono aperti per fornire il drenaggio. </li><li> Rimuovere il cuore dal mediastino con il # 5 pinze, afferrare le estremità mozzate dei grandi vasi. Mettere il cuore in un piatto di cultura 60 millimetri contenente sterile tampone fosfato salino (PBS) per cateterizzazione. </li></ol> 2. Metodo per Decellularization da Langendorff perfusione <ol><li> Preparare il complesso di catetere in anticipo. Disegnare una sezione di quattro centimetriPE 50 tubi in una piccola fiamma alcool per creare un più piccolo, più sottile catetere. Tagliare le estremità con una lama per soddisfare le dimensioni (circa. 300 um OD diametro esterno di una flangia di circa. OD 500 micron) di figura 1. Ciò fornirà due cateteri simmetriche da ciascun lato del tiro. </li><li> Puntare l&#39;estremità tagliata del tubo nella fiamma brevemente, per fondere una flangia sulla apertura all&#39;estremità sottile. </li><li> Riempire la siringa 12 ml con PBS e assemblare il catetere inserendo un rubinetto a 3 vie sulla siringa. Aggiungere un 22 G x 1 ago per il rubinetto e guidare l&#39;ago attraverso il setto. Far scorrere il tubo del catetere PE disegnato sul dell&#39;ago (Fig. 1). </li><li> Lavare le parti assemblate con PBS, assicurando che tutte le bolle d&#39;aria sono stati rimossi. </li><li> Inserire il catetere, preparato come descritto sopra, in aorta del cuore isolato, che non si estende oltre la valvola aortica e legare con un tirante di 7-0 sutura. Appoggiare la flangia di tegli catetere prossimale contro la cravatta, facendo una perfetta tenuta e prevenire il cuore di venire fuori il catetere. </li><li> Osservare la cateterizzazione sotto ingrandimento, mentre delicatamente perfusione cuore utilizzando la siringa contenente PBS. Assicurarsi che non vi siano perdite nel sistema e il tessuto blanches omogeneo come il sangue latente viene rimosso. </li><li> Posizionare il setto nel collo dell&#39;adattatore ingresso e sigillarlo ripiegando i lati sopra il vetro. </li><li> Fissare il serbatoio riempito con 60 ml di 1% solfato di sodio dodecil (SDS) in acqua distillata (DH 2 O) tramite una linea di lunghezza sufficiente a produrre una colonna che genera 20 millimetri Hg di pressione, come mostrato in Fig. 1. Calcolare la pressione dall&#39;alto colonna di liquido in base al rapporto di 1 mm Hg è pari a 1,3595 centimetri H 2 O. Attenzione: SDS è una polvere altamente flocculante con proprietà irritanti. Contatto dovrebbe essere evitato. Maneggiare la polvere utilizzando appropriati indumenti protettivi. </li><li> Profumato cuore con 1% SDS per 14 ore. Il cuore sarà traslucido in apparenza senza tessuto rimanente osservabile. </li><li> Lavare il sistema fino al rubinetto della soluzione rimanente SDS e sostituirla con 10 ml dH 2 O. Profumato cuore con 10 ml di 1% Triton X-100 (diluito in acqua distillata), seguita da 10 ml dH 2 O, seguiti da 60 ml di PBS contenenti 1x streptomicina penicillina (Pen-Strep). </li><li> Conservare il cuore in PBS con 1x Pen-Strep a 4 ° C. Se l&#39;applicazione palo decellularization destinato richiede perfusione quindi il catetere in aorta deve essere mantenuto, altrimenti tagliare il legame di sutura e rimuovere il catetere. </li></ol> Determinazione 3. DNA <ol><li> Preparare un digest del decellularized ECM o il controllo cardiaco utilizzando 200 mg / ml proteinasi K in 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 0,45% di Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3). </li><li> Incubare il tessuto a 55 ° C con agitazione fino a quando il tessuto è dissolto,in genere 4-5 ore. </li><li> Quantificare il contenuto di DNA della omogenato con un DNA test di 4,11 vincolante. </li></ol> 4. Fissazione e il sezionamento di tessuto <ol><li> Fix decellularized, cuori recellularized o controllo P3 in 4% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il tessuto in PBS 3x. </li><li> Posizionare il tessuto in una soluzione di 7,5% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M a 4 ° C fino affonda. </li><li> Cambiare la soluzione al 15% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M a 4 ° C, ancora, fino affonda. </li><li> Riscaldare il tessuto a 37 ° C, sostituire la metà del volume con soluzione di gelatina nel 15% di saccarosio e 0,1 M tampone fosfato ed equilibrare la notte. Le concentrazioni di gelatina sono aumentati graduale attraverso 1%, 2,5%, 5% e infine 7,5% due volte. </li><li> Mettere i campioni in cryomolds utilizzando fresco 7,5% di gelatina. Per ripristinare la forma dei campioni decellularized, liquido gelatina può essere perfuso nelle camere come tlui cuori sono modellati. Congelare galleggiando i cryomolds in azoto liquido. Conservare a -80 ° C. </li><li> CUT (10 micron di spessore) sezioni con un criostato. Portare la slitta vicino alla superficie della sezione e osservare la sezione spostarsi fuori dal coltello sulla superficie dovuta alla carica sui vetrini trattati elettrostaticamente. Asciugare le diapositive durante la notte e conservare a -80 ° C per le analisi future. </li><li> Rimuovere i vetrini dal congelatore, equilibrare a temperatura ambiente e poi posto in una vaschetta Coplin contenente PBS per 20 minuti a 37 ° C per sciogliere la gelatina. </li><li> Macchiare le sezioni tagliate dal punto 4.7 con ematossilina eosina. Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin. Esporre le diapositive idratato al punto 4.8 per ematossilina per 45 secondi, l&#39;acqua del rubinetto per 1,5 minuti, tampone per 3 minuti, l&#39;acqua del rubinetto per 1 minuto, agente azzurrante per 1,5 min, 80% di etanolo per 1 min, alcolica Eosina Y per 8 secondi, 80% di etanolo per 1 minuto, 100% di etanolo per 1 min 2x, stanza di compensazione (sostituto di xilene) per 1 min 3x, coprioggetto con resinaMezzo di montaggio basato. Esaminare le diapositive al microscopio. </li><li> Per confermare il mantenimento di ECM proteine ​​reattività del ECM cuore, macchia per proteine ​​strutturali ECM come il collagene IV, ponendo le diapositive idratati in una camera umidificata e trattare con il 10% normale asino siero (NDS) in tampone fosfato con 0,1% Triton -X100 (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Utilizzare un volume sufficiente a coprire le sezioni di tessuto. </li><li> Sostituire la soluzione con l&#39;anticorpo primario di scelta ad una diluizione empiricamente determinato 5% NDS / PBST. Per esempio, l&#39;anticorpo collagene IV è stato diluito a 1: 150. Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini con PBST 3x e applicare un anticorpo secondario di scelta coniugato con un colorante fluorescente. Diluire l&#39;anticorpo di una quantità determinata empiricamente. Incubare per 1 ora a RT. Lavare con PBS 3x. </li><li> Colorare i vetrini con un colorante legame al DNA come DAPI per verificare l&#39;assenza di nuclei delle cellule utilizzando un mounti DAPI contenenteng media quando il coperchio scivolare le diapositive. </li><li> Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza da 50 a 400X. </li></ol> 5. P1 neonatale murino ventricolare cardiomiociti per Recellularization <ol><li> Spruzzare ogni cucciolo con il 70% di etanolo e decapitarlo con una lama singola uso. </li><li> Tenere ogni pup tra il pollice e l&#39;indice, mentre il torace è diviso sulla linea mediana con piccole forbici sterili per esporre la cavità toracica. Applicare pressione per consentire cuore di sporgere liberamente dal petto mentre è tagliato libera dei grandi vasi e gli atri lasciando solo il tessuto ventricolare. </li><li> Mettere ogni cuore direttamente in un tubo da 50 ml contenente 20 ml ghiacciata di calcio, soluzione salina tamponata Bicarbonato libero di Hank con 20 mM 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) fino a quando tutti i cuori sono raccolti. </li><li> Aspirare il CBFHH e aggiungere 10-15 ml di CBFHH fresco (ghiacciata) al tubo. Lavare il tessuto agitando il tessuto in tegli provetta diverse volte. </li><li> Decantare la soluzione contenente il cuore in una plastica Petri piastre da 60 mm. </li><li> Sezionare qualsiasi tessuto atriale latente dal cuore sotto ingrandimento sul ghiaccio da tagliare via dal cuore con le forbici a molla. Tritare i ventricoli in piccoli pezzi in modo omogeneo dimensioni. Rimuovere qualsiasi tessuto non-ventricolare separato dal piatto con # 5 pinze. </li><li> Pipettare tanto della soluzione CBFHH come è necessario per trasferire i frammenti di tessuto in una piccola fiala sterile contenente una sterile bar micro mescolare. </li><li> Lasciare il tessuto sedimentare sul fondo della fiala e rimuovere la soluzione CBFHH. </li><li> Portare 50 ml di una soluzione enzimatica 1,75 mg / ml di tripsina, 20 ug / ml DNasi II in CBFHH. Dispensare 5 ml di questa soluzione enzimatica e aggiungerlo a una provetta contenente il tessuto ventricolare tritato e posto su un agitatore magnetico. Mescolare ad un tasso costante (340 rpm) a temperatura ambiente per 8 min. NOTA: L&#39;azione di agitazione deve essere dolce e tuttavia consentireper la sospensione della sospensione. </li><li> Rimuovere la fiala dalla piastra mescolare e lasciare l&#39;impasto per sedimentare per 3 min. Pipetta e scartare il surnatante iniziale di digerire, in quanto contiene principalmente le cellule del sangue e detriti dei tessuti. </li><li> Pipettare un secondo 5 ml aliquota della soluzione enzimatica e aggiungerlo al ventricolo digerire. Mescolare per 8 minuti e lasciare sedimentare per altri 3 minuti. Prima di iniziare i digest, preparare due provette da 50 ml (etichettati 1 e 2) ciascuna contenente 12 ml di ghiacciata siero fetale bovino (FBS). Mettere un filtro cella di 40 micron in cima a ciascun tubo. Pipettare questo surnatante attraverso il filtro sul tubo 1. </li><li> Ripetere il processo di digestione ulteriori 8 volte, alternando il posizionamento del surnatante digest tra i due tubi contenenti FBS. Dividere l&#39;ultimo surnatante in parti uguali tra i tubi 1 e 2 per garantire volumi uguali in ogni tubo. NOTA: Ogni tubo di raccolta conterrà ora 32,5 ml di volume totale di sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare le provette contengonoing XG surnatante 150 per 6 minuti a 4 ° C. </li><li> Mentre la raccolta delle aliquote di digestione, preparare cinque 100 piastre di coltura dei tessuti mm con 6 ml di media (Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) con il 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutammina) per piastra. Incubare le aliquote a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 minuti per equilibrare la media. </li><li> Aspirare la miscela di enzimi CBFHH e risospendere le cellule in 30 ml di terreni di coltura preparato in precedenza, che unisce le cellule da entrambi i tubi di raccolta. </li><li> Ritorno 6 ml di sospensione cellulare per ciascuna delle piastre 100 mm e incubare per 45 min a 37 ° C. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, trasferire le cellule non aderenti a 5 piatti nuovi e ri-incubare per 45 min (la frazione fibroblasti avrà iniziato ad aderire ai piatti e può essere coltivata separatamente se desiderato). </li><li> Al termine del secondo turno di pre-placcatura, raccogliere i media e le cellule non aderenti dai piatti e far girare i mezzi di comunicazione a 150xg per 6 min. </li><li> Aspirare supporti in eccesso per portare le cellule alla concentrazione desiderata approssimativa, (4.0 x 10 5 cellule per costrutto in 100 ml di perfusato). Rimuovere una aliquota per il conteggio e la vitalità o il test di 14. </li></ol> 6. bioreattore Recellularization di P3 Cuore Matrix <ol><li> Pretrattare la matrice cuore isolato con terreni di coltura (vedi punto 5.15) per una notte prima di aggiungere le cellule. </li><li> Assemblare gli elementi di un sistema di Langendorff come mostrato in Fig. 2. Autoclave le parti in vetro e ossido di etilene sterilizzare le parti in plastica per assicurare la sterilità. Varie unità secondarie del sistema possono essere assemblati in una cappa a flusso laminare prima di essere montato sul supporto. Di circolazione bagno di acqua e riscaldata percorso del flusso d&#39;acqua è stato omesso per chiarezza. </li><li> Riempire il sistema assemblato con 120 ml di terreni di coltura tissutale (vedere il punto 5.15). </li><li> Posizionare la matrice cuore cateterismo dal punto 2.14 in un cul 60 millimetripiatto tura sotto ingrandimento e collegare una siringa da 1 ml con 22 G x 1 ago caricato con sospensione cellulare dal punto 5.20 al catetere. Assicurarsi che questa assemblea è privo di bolle d&#39;aria per evitare embolizzazione cuore. </li><li> profumato delicatamente i 100 ml di sospensione cellulare nella matrice cuore attraverso le arterie coronarie. Una volta completato, staccare la combinazione della siringa / ago. NOTA: Un lento perfusione di circa mq. 20 ml per min è necessaria per evitare che le cellule di fluire fuori dalle vene, in transito cuore. </li><li> Con un 22g stub smussato fissato al raccordo Luer sul lato inferiore del coperchio vaso cuore bioreattore, spingere il catetere sul perno. </li><li> Avviare la pompa peristaltica e osservare che il flusso procede come illustrato in figura 2. Flusso procede dal serbatoio tramite la pompa attraverso il gorgogliatore al catetere posizionato in aorta nel passo 2.5 (percorso rosso in Fig. 2). Osservare il flusso della circolazione cardiaco della venas e gocciolare dall&#39;apice, ricircolo al serbatoio media. NOTA: La portata perfusione dipende da fattori individuali quali la resistenza vascolare del costrutto, e la dimensione del cuore, ma un tasso di 50 a 100 microlitri / min è un buon punto di partenza. In momenti intermedi, le valutazioni funzionali possono essere eseguiti. La scala dimensione del cuore recellularized neonatale limita le valutazioni, che possono essere eseguite, ma abbiamo stabilito che i sistemi basati otticamente possono essere utilizzati per quantificare battere comportamento così come sono stati utilizzati in cuori di ratto adulto. 4 Il costrutto può essere perfusi per esteso periodi di tempo (fino a 23 ore). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La dipendenza di questa tecnica su ripetuto perfusione del cuore fa evitare un&#39;embolia una componente critica di un esito positivo. Dal cateterizzazione iniziale del cuore nei passaggi 2.2-2.6, ai cambiamenti di soluzione tra Piazza 2.8-2.14, ci sono manipolazioni che possono permettere l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria che compromettono il flusso di perfusato nel miocardio. A causa del peso ridotto cuore neonatale, anche bolle minute vascolarizzazione possono causare un infarto tecnica, rendendo il decellulari...

L&#39;insufficienza cardiaca è comune e mortale. È una malattia progressiva che si traduce in una riduzione della contrattilità del cuore, che ostacola il flusso di sangue agli organi e lascia le richieste metaboliche del corpo insoddisfatte. Si stima che 5,7 milioni di americani hanno l&#39;insufficienza cardiaca ed è la causa primaria di ospedalizzazione negli Stati Uniti 9. Il costo collettivo di trattamento di pazienti in insufficienza cardiaca negli Stati Uniti supera i $ 300 miliardi di dollari l&#39;anno 9-10. L&#39;unica terapia definitiva per l&#39;insufficienza cardiaca allo stadio terminale è il trapianto di cuore ortotopico. Ogni anno, si stima che più di 100.000 cuori dei donatori sono necessari per le procedure di trapianto cardiaco negli Stati Uniti 1-2. A causa del limitato numero di donatori, solo circa 2.400 trapianti vengono effettuati ogni anno negli Stati Uniti 2. Chiaramente, questa carenza di organi deve essere affrontato come altre strategie sono tenuti a produrre organi aggiuntivi per il trapiantozione e, idealmente, questi organi sarebbe autologo in modo da evitare le complicazioni associate con il rifiuto e la durata immunosoppressione. Cardiomiociti adulti mammiferi dimostrano una limitata capacità di rigenerazione su di infortunio, ma recenti evidenze suggeriscono che mammiferi cuori neonatali mantengono una notevole capacità rigenerativa dopo un trauma 5-8. In particolare, dopo la resezione chirurgica parziale, una finestra rigenerativa è stato scoperto tra la nascita e postnatale giorno 7. Questo periodo rigenerativa è caratterizzata da una mancanza di cicatrice fibrotica, formazione di neovascolarizzazione, rilascio di fattori angiogenici dalla epicardio e cardiomiociti proliferazione 5-8 , 11. Questa finestra rigenerativo di tempo fornisce il potenziale di utilizzo cuore neonatale quale nuovo fonte di materiale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale. La matrice extracellulare è nota per fornire spunti importanti per promuovere cardiomyocyte la proliferazione e la crescita. Chiare differenze nella disponibilità di molecole nelle matrici neonatali e adulti 12 e la loro capacità di promuovere la rigenerazione sono state esplorate 13. matrici adulti decellularized sono stati utilizzati in diversi studi per fornire un ponteggio ECM per ripopolazione cellulare e la generazione di un cuore bioartificiale. Mentre questi studi, e le nuove scoperte nel campo delle tecnologie di cellule staminali, stanno avanzando rapidamente, diversi ostacoli devono ancora essere soddisfatte. Ad esempio, limitazioni nella preservando la struttura originaria della matrice, l&#39;integrazione cellulare nella parete della matrice, e la capacità di sostenere la proliferazione e la crescita tutti i limiti del successo di questo approccio. Mentre gli attributi rigenerativa superiori sono state attribuite al cuore neonatale, gli aspetti pratici di utilizzo di un tessuto così hanno limitato la sua esplorazione. Sulla base della capacità rigenerativa dimostrata del cuore neonatale, abbiamo sviluppato nuovi matrici sviluppando unatecnica di decellularization per il cuore P3 mouse. Il cuore P3 è stato scelto per questi studi in quanto è all&#39;interno della finestra di rigenerazione cardiaca come precedentemente determinato 6 ma il cuore è grande abbastanza per il raccolto, decellularize e recellularize. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di dimostrare la fattibilità della creazione di una matrice da un cuore neonatale del mouse. I nostri studi forniscono prove per la fattibilità di decellularizing un minuto, cuore neonatale pur mantenendo l&#39;integrità strutturale e proteica della ECM. Dimostriamo anche la capacità di recellularize questo ECM cardiaco con mCherry cardiomiociti che esprimono e abbiamo esaminato questi cardiomiociti per l&#39;espressione di diversi marcatori cardiaci seguenti Recellularization. Questa tecnologia permetterà per la prova della superiorità di una matrice neonatale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Materiali per l'isolamento del cuore di topo</forte></td></tr><tr><td>P1 cuccioli di topo (come mostrato; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>60 mm Piastra di coltura</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4 (sterile)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256,01</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Lama monouso</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Forbici standard</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Forbici a molla 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>#5 Forcipe</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td colspan="4">2. Materiali per decellularizzazione</forte></td></tr><tr><td>Adattatore di ingresso</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>autoclavabile</td></tr><tr><td>Setto</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>autoclavabile</td></tr><tr><td>1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubo</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>autoclavabile</td></tr><tr><td>Luer maschio a 1/8" adattatore portagomma</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>autoclavabile</td></tr><tr><td>Luer femmina a 1/8" adattatore portagomma</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>sutura chirurgica autoclavabile</td></tr><tr><td>Prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Supporto ad anello</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Morsetto</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Morsetto normale supporto</td><td>Fisher</td><td>Scientific 05-754Q</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente 60 cc serbatoio siringa</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>22 G x 1 Ago per siringa</td><td>BD</td><td>305155</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Siringa da 12 cc</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Rubinetto di arresto a 3 vie</td><td>Smith</td><td>Medical MX5311L</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Tubo PE50</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Deve essere formabile con il calore. Polietilene consigliato.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Grado ultrapuro consigliato. Preparare la soluzione fresca e filtrare sterilizzare prima dell'uso.</td></tr><tr><td>1% Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Preparare una soluzione fresca da un magazzino al 10% e sterilizzare il filtro prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Acqua purificata sterile dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>o sistema MilliQ.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>o equivalente &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3. Materiali per la quantificazione del DNA</forte></td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U/mg attività</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Tris base/cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Pico-Green dsDNA assay kit</td> Life <td>Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td><td>richiede che il fluorimetro legga</td></tr> <tr><td colspan="4">4. Metodo per la fissazione e il sezionamento di tessuto</forte></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>o equivalente Gelatina</td></tr><tr><td>di tipo A da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>deve essere 300 bloom o superiore</td></tr><tr><td colspan="4">5. Metodo per istologia tissutale</td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>o vetrini per</td></tr><tr><td>microscopio equivalenti&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Hematoxylin 560&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech</td><td>3801570</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Buffer blu&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech</td><td>3802915</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Alcolico Eosina Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech</td><td>3801615</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Formula 83 Sostituto dello xilene&nbsp;</td><td>CBG Biotech&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Supporto di montaggio Permount&nbsp;</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>o anticorpo Collagen</td></tr><tr><td>IV</td> equivalente <td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>o anticorpo equivalente</td></tr><tr><td>&alfa;-actinina</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>o anticorpo</td></tr><tr><td>mCherry</td><td>Abcam</td><td>equivalente AB205402</td><td>o anticorpo</td></tr><tr><td>NKX2.5</td> equivalente <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>o anti-topo asino equivalente</td></tr><tr><td>AF488 Anticorpo</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Asino anti-pollo AF594 Anticorpo</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Asino anticorpo CY5</td> capra <td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant con DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td colspan="4">6. Isolamento di cardiomiociti ventricolari neonatali mediante pre-placcatura</td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>o HEPES equivalente</td></tr><tr><td>(1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente provetta da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm piastre</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>La superficie di Primeria migliora l'attacco dei fibroblasti promuovendo una maggiore purezza dei miociti</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>o</td></tr><tr><td>DNasi II</td> equivalente <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>o DMEM (</td></tr><tr><td>Delbecco's Minimal Essential Media)</td> equivalente <td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>o piastre rivestite di</td></tr><tr><td>fibronectina equivalente&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Vetreria per bioreattore cardiaco</td><td>Tecnologia del vetro Radnoti</td><td>120101BEZ</td><td>Deve essere sterilizzabile in autoclave o a gas.</td></tr></tbody></table>

neonatale cardiaco impalcature: matrici innovativi per gli studi rigenerativi

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

L'unica terapia definitiva per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale è il trapianto di cuore ortotopico. Ogni anno, si stima che negli Stati Uniti siano necessari più di 100.000 cuori di donatori per le procedure di trapianto cardiaco1-2. A causa del numero limitato di donatori, ogni anno negli Stati Uniti vengono eseguiti solo circa 2.400 trapianti2. Numerosi approcci, dagli studi di terapia cellulare all'impianto di dispositivi di assistenza meccanica, sono stati intrapresi, da soli o in combinazione, nel tentativo di indurre il cuore a ripararsi o a far riposare il cuore in insufficienza3. Nonostante questi sforzi, i dispositivi di assistenza ventricolare sono ancora ampiamente utilizzati allo scopo di fare da ponte verso il trapianto e l'utilità delle terapie cellulari, sebbene abbiano qualche promessa curativa, è ancora limitata agli studi clinici. Inoltre, è stato tentato lo xenotrapianto diretto, ma il successo è stato limitato a causa del rigetto immunitario. Chiaramente, è necessaria un'altra strategia per produrre ulteriori organi per il trapianto e, idealmente, questi organi sarebbero autologhi in modo da evitare le complicazioni associate al rigetto e all'immunosoppressione a vita. La decellularizzazione è un processo di rimozione delle cellule residenti dai tessuti per esporre la matrice extracellulare nativa (ECM) o lo scaffold. La decellularizzazione per perfusione offre la completa conservazione della struttura tridimensionale del tessuto, lasciando intatta la maggior parte delle proprietà meccaniche del tessuto4. Questi scaffold possono essere utilizzati per il ripopolamento con cellule sane per generare modelli di ricerca e, possibilmente, organi necessari per il trapianto. Abbiamo esposto gli scaffold di topi neonatali (P3), noti per mantenere notevoli capacità rigenerative cardiache,5-8 alla decellularizzazione mediata da detergenti e abbiamo ripopolato questi scaffold con cellule cardiache murine. Questi studi supportano la fattibilità dell'ingegnerizzazione di un costrutto cardiaco neonatale. Consentono inoltre di indagare se la MEC dei cuori postnatali precoci possa contenere indizi che si tradurranno in migliori strategie di ricellularizzazione.

decellularization In media, il tempo di decellularization di un cuore P3 utilizzando questo protocollo è di circa 14 ore. dato un peso medio di 23 mg di cuore per il neonato P3. Acellularity Figura 3a mostra un cuore neonatale completamente intatto P3 (tutto il monte). La figura 3b mostra lo stesso cuore seguente decellularization. Figure 4a e 4b...

In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l&#39;uso in studi rigenerative.

Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è generare nuovi scaffold a partire da tessuto cardiaco miriano neonatale per il loro utilizzo in studi di rigenerazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in cardiologia rigenerativa. Fornisce un modello innovativo per lo studio delle interazioni cellula-matrice, poiché la matrice extracellulare deriva da tessuto cardiaco dotato di capacità proliferativa.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la scoperta di nuove caratteristiche della matrice extracellulare neonatale. A dimostrare la procedura sarà Stefan Kren, un tecnico del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, passare una sezione di tubo PE 50 lunga quattro centimetri su una piccola fiamma alcolica per creare un catetere più piccolo e sottile.Tagliare le estremit&agrave; alle dimensioni appropriate per ottenere due cateteri simmetrici da ciascun lato del PO e immergere brevemente un'estremit&agrave; tagliata del tubo nella fiamma per fondere una falange sull'apertura dell'estremit&agrave; sottile. Successivamente, riempire una siringa da 12 millilitri con PBS e applicare un rubinetto a tre vie sulla siringa. Fissare un ago da 22 gauge al rubinetto e inserire l'ago attraverso il setto.Quindi, far scorrere il catetere in tubo PE sull'ago e irrorare l'insieme con PBS. Quando l'insieme del catetere è pronto, detergere il torace del neonato con etanolo al 70%. Poi utilizzare forbici standard per tagliare la cute dal torace, tirando lateralmente il tessuto con una pinza numero cinque.Successivamente, perforare la parete addominale appena al di sotto dello sterno e afferrare il processo xifode con la pinza. Sollevare lo sterno in direzione rostrale rispetto al corpo mentre si tagliano le costole su entrambi i lati del torace, quindi ribaltare la gabbia toracica in senso superiore. Quando il cuore è visibile, tirare lateralmente sul timo per dissezionare i due lobi principali, esponendo l'arco dell'aorta e le vene cave e polmonari.Utilizzando forbici a molla di 10 centimetri, recidere le arterie principali dall'arco aortico, nonché l'aorta stessa. Afferrare i monconi dei vasi recisi per riflettere il cuore in avanti, separandolo dalla trachea e dall'esofago, e tagliare tra i polmoni e il cuore e su entrambi i lati del cuore per recidere il circolo polmonare e le altre vene principali. Successivamente, afferrare i monconi dei vasi principali recisi ed estrarre il cuore dal mediastino, posizionando il cuore in una piastra di coltura da 60 millimetri contenente PBS sterile.Per decellularizzare il cuore, posizionare la piastra di coltura sotto un microscopio stereoscopico e inserire l'ago dell'assemblaggio del catetere nell'aorta fino, ma senza oltrepassare, la valvola aortica. Fissare l'ago con un punto di sutura 7-0, appoggiando la falange del catetere in prossimità del punto di legatura e creando una chiusura ermetica, quindi perfondere delicatamente il cuore con PBS. Se non ci sono perdite, il tessuto diventerà omogeneamente pallido man mano che il sangue residuo viene rimosso.Inserire il setto nel collo dell'adattatore di ingresso e ripiegare i lati del setto sul vetro. Successivamente, collegare un serbatoio riempito con 60 millilitri di sodio dodecilsolfato allo 1% in acqua distillata tramite una tubazione di lunghezza sufficiente da generare una colonna in grado di produrre una pressione di 20 millimetri di mercurio, e perfondere il cuore con SDS per 14 ore. Al termine della perfusione, il cuore sarà traslucido e non si osserverà alcun tessuto residuo.Sciacquare il sistema fino al rubinetto con la soluzione di SDS rimanente e riempire il serbatoio con 10 millilitri di acqua deionizzata. Successivamente, sciacquare il cuore con perfusioni consecutive di 10 millilitri di 1% Triton X-100, 10 millilitri di acqua deionizzata e 60 millilitri di PBS contenente penicillina e streptomicina. Dopo l'ultima perfusione, conservare il cuore in PBS con antibiotici a quattro gradi Celsius.Per ricellularizzare il tessuto, trasferire la matrice cardiaca con catetere in una piastra di coltura da 60 millimetri sotto un microscopio stereoscopico e collegare una siringa da un millilitro dotata di un ago da 22 gauge caricata con le cellule appropriate di interesse al catetere. Verificare che l'assemblaggio sia privo di bolle ed eseguire una perfusione delicata di 20 microlitri di sospensione cellulare al minuto nella matrice cardiaca attraverso le arterie coronariche. Dopo aver somministrato 100 microlitri di cellule, staccare la siringa e inserire il catetere in un ago ottuso da 22 gauge fissato al raccordo a baionetta situato sulla parte inferiore del coperchio del barattolo cardiaco del bioreattore.Ora, avviare la pompa peristaltica e verificare che il flusso proceda dal serbatoio, passando attraverso la pompa e la trappola per bolle, fino al catetere, e che la circolazione cardiaca fuoriesca dalle vene e goccioli dall'apice, ricircolando nel serbatoio del mezzo. In queste immagini, è mostrata la colorazione con ematossilina ed eosina di cuori integri e decellularizzati. Si noti l'assenza di nuclei positivi all'emmatossilina e la riduzione delle strutture eosinofile nel cuore decellularizzato.Per valutare il contenuto della matrice extracellulare nei cuori neonatali integri e descelularizzati, la colorazione immunoistochimica dimostra che il collagene IV è fortemente espresso sia nel cuore integro che in quello descelularizzato e che la localizzazione di questa proteina viene mantenuta dopo la rimozione delle cellule, mentre i nuclei positivi al DAPI vengono efficacemente rimossi. Il contenuto di DNA è inoltre ridotto nei cuori neonatali dopo la descelularizzazione basata su detergenti, in accordo con quanto riportato per la descelularizzazione mediata da detergenti in altri tessuti. In queste immagini, possono essere osservati cardiomiociti recellularizzati che hanno migrato nella parete del ventricolo sinistro.Fino a 23 giorni dopo la perfusione, queste cellule migrate possono risultare positive per marcatori di cellule progenitrici cardiache, mCherry, marcatori di cardiomiociti differenziati o DAPI, con la maggior parte delle cellule che esprime tutti e quattro i marcatori. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 34 ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di evitare l'embolia cardiaca causata dall'introduzione di aria attraverso l'apparato di perfusione.Seguendo questa procedura, la produzione di gel e la stampa 3D possono essere utilizzate per creare innesti proliferativi o persino cuori 3D in vitro. Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori per promuovere la rigenerazione cardiaca. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come decellularizzare e ricellularizzare un cuore di topo neonato.Ricordare che lavorare con il dodecilsolfato di sodio può essere pericoloso e che durante la manipolazione del reagente in polvere devono essere sempre adottate precauzioni come l'uso di una maschera N-95 o di una cappa aspirante.

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