Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita
13 settembre 2016
Una valutazione accurata degli effetti antinfiammatori è della massima importanza per la valutazione di potenziali nuovi farmaci per il trattamento della malattia infiammatoria intestinale. La microscopia olografica digitale fornisce la valutazione dell'infiammazione in campioni di tessuto del colon murino e umano, nonché la valutazione multimodale automatizzata della guarigione delle ferite epiteliali in vitro.
L'obiettivo generale di questo studio è utilizzare la microscopia olografica digitale o DHM per fornire un imaging quantitativo automatizzato a contrasto di fase senza macchie di campioni di tessuto del colon dell'infiammazione intestinale per la valutazione multimodale della guarigione delle ferite epiteliali in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione gastrointestinale e della guarigione delle ferite sull'attività della malattia infiammata umana e marina Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente il rilevamento e la quantificazione di cellule e tessuti in base a parametri fisici in modo oggettivo e privo di macchie. A dimostrare le procedure sarà Fittest Ketelhut, un tecnico, del Biomedical Technology Center.
Impostare la coltura cellulare, incubare quattro volte dieci al quinto, Caco due cellule per centimetro quadrate in piastre di Petri da 35 millimetri dotate di inserti ad alta coltura in terreno RPMI integrati con FBS e antibiotici a 37 gradi Celsius in 95% di umidità e cinque per cento di anidride carbonica. Dopo due giorni, trattare le cellule con l'agente di interesse e rimettere le colture nell'incubatore per altre 24 ore. Il giorno successivo, aspirare il surnatante e utilizzare una pinzetta per rimuovere gli inserti.
Lavare la coltura una o due volte con un millilitro di terreno di coltura cellulare tamponato HEPES per rimuovere eventuali cellule morte e qualsiasi componente cellulare rimanente dall'area della ferita. Quindi, aggiungere due millilitri di terreno tamponato HEPES fresco e chiudere il piatto. Ora posiziona la capsula di Petri nel microscopio olografico digitale e seleziona l'obiettivo 10x.
Aprire il software di acquisizione delle immagini e selezionare la modalità di imaging in campo chiaro. Impostare la camera di riscaldamento a 37 gradi Celsius e posizionare la coltura nella camera di riscaldamento. Quindi, spostare il campo di osservazione fino a quando nella finestra di monitoraggio in tempo reale è possibile visualizzare una ferita adatta con un singolo strato di cellule enormi e bordi dritti su entrambi i lati senza cellule morte o siero.
Acquisire un'immagine a luce bianca dell'area iniziale della ferita. Quindi, spegnere l'illuminazione a luce bianca e selezionare la modalità di microscopia olografica digitale. Accendere l'illuminazione laser e selezionare un tempo di esposizione inferiore a tre millisecondi per la registrazione dell'ologramma.
Se le frange di interferenza olografiche fuori accesso appaiono con un contrasto adeguato, acquisire un ologramma campione e ricostruire un'immagine di fase quantitativa con il software di ricostruzione per verificare la qualità dell'immagine. Quindi, avviare un'osservazione DHM in tempo trascorso della ferita interrompendo la registrazione al punto finale appropriato e ottenere un'immagine finale del campione sotto illuminazione a luce bianca. Per il destrano acuto solfato di sodio, o induzione della colite DSS, fornire tre grammi di DSS disciolti in 100 millilitri di acqua autoclavata ai topi ablibidim.
Dopo sette giorni, prelevare sezioni spesse sette micrometri di campioni di colon arrotolati svizzeri dagli animali di controllo e trattati. Immergere ogni sezione in 50-100 microlitri di PBS e coprire i campioni con vetrini di copertura individuali. Verificare che il fondo dei vetrini sia privo di polvere e altre contaminazioni.
Quindi, posizionare il primo vetrino sul tavolino del microscopio e regolare il campo visivo fino a quando l'area di interesse del tessuto non è visibile. Metti a fuoco il campione e acquisisci un'immagine in campo chiaro nel software di acquisizione delle immagini. Quindi, selezionare la modalità di imaging DHM e passare all'illuminazione a luce laser.
Impostare un tempo di esposizione inferiore a tre millisecondi e verificare che le frange di interferenza olografiche fuori accesso appaiano con un contrasto adeguato nella finestra di imaging in tempo reale. Quindi, acquisisci un ologramma digitale del tessuto. Endoscopicamente, l'evidenza di colite da moderata a grave comprende l'ispessimento della parete del colon, le alterazioni del pattern vascolare, le nedudazioni delle fibre e la granularità della superficie della mucosa.
La valutazione istologica convenzionale delle sezioni del colon rivela un marcato edema nella parete del colon dei DSS trattati rispetto agli animali di controllo prevalentemente localizzati nella sottomucosa. Le corrispondenti immagini quantitative a contrasto di fase DHM e le relative mappe dell'indice di rifrazione dimostrano inoltre che queste alterazioni tissutali senza differenze visibili nelle densità del menstroma epiteliale sono particolarmente evidenti nei campioni di tessuto nativo non colorato. L'indice di rifrazione è significativamente ridotto nell'epitelio, nella sottomucosa e nello stroma dei topi colitici rispetto ai controlli sani con una correlazione significativa tra la perdita relativa di peso corporeo e l'indice di rifrazione negli animali da esperimento.
Qui viene mostrato il monitoraggio continuo rappresentativo di un test di guarigione delle ferite mediante microscopia olografica digitale per 45 ore. Consente di calcolare la superficie coperta della cellula, lo spessore medio della cellula e la massa secca cellulare nel corso del processo di guarigione. Abbiamo dimostrato che il DHM consente il monitoraggio continuo della guarigione delle ferite epiteliali e contemporaneamente fornisce informazioni bio core sulle alterazioni cellulari indotte dalle citochine.
Inoltre, dimostriamo l'accurata valutazione del danno istologico in modelli di colite e campioni di tessuto del colon umano mediante DHM attraverso la misurazione delle variazioni dell'indice di rifrazione. Poiché la DHM si basa sul rilevamento del ritardo della lunghezza del percorso ottico, i parametri biofisici assoluti, come la densità dei tessuti, la massa secca o lo spessore cellulare, possono essere analizzati mediante imaging quantitativo a contrasto di fase senza macchie. Il culmine del DHM con i comuni microscopi da ricerca e la robustezza della tecnica aprono la strada alle applicazioni di routine di questo metodo nella biologia cellulare e nella patologia digitale.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia olografica digitale per l'analisi di tessuti di colture cellulari viventi nell'ambiente del laboratorio biomedico. In conclusione, il DHM crea uno strumento prezioso, innovativo e quantitativo per la valutazione dei parametri assoluti dell'infiammazione, nonché per la quantificazione semplificata dell'epitelio volontario in vitro con un alto potenziale per l'uso diagnostico traslazionale.
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Panoramica
Questo studio utilizza la microscopia olografica digitale (DHM) per l'analisi quantitativa automatizzata e senza colorazione dell'infiammazione intestinale in campioni di tessuto colonico. Il metodo mira a migliorare la valutazione della riparazione della ferita epiteliale in vitro, fornendo informazioni sull'infiammazione gastrointestinale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Gastroenterologia
Sfondo
- La malattia infiammatoria intestinale richiede una valutazione accurata degli effetti antinfiammatori.
- La DHM consente un'analisi oggettiva mediante imaging, senza necessità di colorazione.
- La tecnica può quantificare efficacemente parametri cellulari e tissutali.
- Comprendere l'infiammazione e la guarigione delle ferite è fondamentale nella ricerca gastrointestinale.
Scopo dello studio
- Valutare l'infiammazione intestinale in campioni di tessuto colonico.
- Valutare la guarigione delle ferite epiteliali in vitro mediante DHM.
- Fornire un approccio multimodale allo studio dell'infiammazione gastrointestinale.
Metodi Utilizzati
- Microscopia olografica digitale per l'acquisizione di immagini.
- Coltura cellulare di cellule Caco-2 in un ambiente controllato.
- Trattamento delle cellule con agenti di interesse dopo l'incubazione.
- Analisi automatizzata dell'infiammazione e della guarigione delle ferite.
Risultati principali
- La DHM quantifica efficacemente l'infiammazione in tessuti murini e umani.
- L'imaging automatizzato fornisce dati oggettivi sulla riparazione della ferita epiteliale.
- Il metodo dimostra un potenziale per la valutazione di farmaci nella malattia infiammatoria intestinale.
- I risultati supportano l'utilizzo della DHM nella ricerca gastrointestinale.
Conclusioni
- La microscopia olografica digitale è uno strumento prezioso per la valutazione dell'infiammazione intestinale.
- Questa tecnica migliora la comprensione del processo di guarigione delle ferite epiteliali.
- La DHM può contribuire allo sviluppo di nuovi trattamenti per le malattie infiammatorie intestinali.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia olografica digitale (DHM) fornisce un'immagine quantitativa in contrasto di fase senza l'uso di coloranti, che consente una valutazione oggettiva dell'infiammazione intestinale e della riparazione della ferita epiteliale senza alterare l'integrità del campione. Questa capacità supporta la validazione precoce degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci per le malattie infiammatorie intestinali (IBD), fornendo parametri biofisici assoluti come densità del tessuto, massa secca e spessore dello strato. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici riducendo la variabilità associata alla colorazione e all'interpretazione istologica soggettiva, migliorando così la continuità traslazionale dalla scoperta allo sviluppo preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le variazioni dell'indice di rifrazione come diretta correlazione delle alterazioni della densità tissutale nel tessuto colonico infiammato.
- Valore operativo: Fornisce una quantificazione oggettiva e senza marcatori delle alterazioni infiammatorie attraverso i diversi strati del tessuto, riducendo la dipendenza dalla valutazione istologica basata sull'esperienza dell'esperto.
- Valore predittivo: Consente una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi grazie alla significativa correlazione tra le variazioni dell'indice di rifrazione e i marcatori dell'attività della malattia, come la perdita di peso corporeo nei modelli di colite.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, consentendo un monitoraggio continuo e automatizzato della guarigione delle ferite epiteliali in vitro.
- Valore operativo: Permette la determinazione simultanea dell'area ferita, della massa secca cellulare e dello spessore dello strato, fornendo letture multiparametriche per lo screening di composti.
- Prontezza del saggio: Consente una quantificazione scalabile e riproducibile della dinamica di guarigione nel tempo, supportando il riutilizzo della piattaforma nella valutazione di composti anti-infiammatori e di riparazione tissutale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Dimostra l'applicabilità sia a campioni di tessuto colonico murino che umano, rafforzando la rilevanza per la patofisiologia umana.
- De-risking meccanicistico: Quantifica le alterazioni stromali ed epiteliali nei modelli di colite senza l'uso di colorazioni, consentendo un'analisi meccanicistica degli effetti del farmaco a livello tissutale.
- Allineamento preclinico: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sul rischio fornendo endpoint quantitativi e riproducibili per i processi di danno istologico e riparazione della ferita.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La DHM si integra nel percorso della scoperta, dalla validazione iniziale del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, in particolare per le vie infiammatorie gastrointestinali e di riparazione della mucosa.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici quantificando le variazioni biofisiche senza etichetta nella densità tissutale e nella morfologia cellulare durante l'infiammazione e la guarigione.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante immagini automatizzate a intervalli di tempo fissi sulla chiusura della ferita e misurazione simultanea della massa secca e dello spessore, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Produce dati quantitativi, inclusi mappe dell'indice di rifrazione, densità tissutale, massa secca e spessore degli strati, facilitando il confronto oggettivo tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica attraverso la dimostrata applicabilità sia nei modelli murini di colite che nei campioni di tessuto umano.
- Riutilizzo aziendale: Posiziona la DHM come capacità riutilizzabile e compatibile con piattaforme per l'imaging quantitativo senza etichetta in diversi modelli di malattia e tipi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile attraverso la quantificazione assoluta e priva di colorazioni di parametri biofisici, riducendo l'ambiguità meccanicistica nei saggi di infiammazione e guarigione delle ferite.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante acquisizione e analisi automatica delle immagini, minimizzando la variabilità dipendente dall'operatore.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati oggettivi e multiparametrici che riducono il rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di terapie per le malattie infiammatorie intestinali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base a un livello di rischio aggiustato, utilizzando endpoint quantitativi di tipo istologico e funzionale relativi alla guarigione delle ferite.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging di fase quantitativo e nella ricostruzione olografica digitale per un'interpretazione accurata dei dati.
- È dipendente da strumentazione in grado di acquisire ologrammi a base laser e di software per la ricostruzione di fase con controllo ambientale (ad esempio, camera riscaldata).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di imaging e delle procedure di analisi, al fine di garantire coerenza tra i team di ricerca e preclinici.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare la tecnica su diversi sistemi modello (ad esempio, monoculti a 2D vs. sezioni tissutali a 3D), mantenendo al contempo la fedeltà quantitativa.
- È limitato dall'area del campo visivo e dalle restrizioni di risoluzione nell'analisi di ampie aree tissutali, sebbene risulti adatto ad analisi istologiche e cellulari mirate, come dimostrato negli esami su tessuto colonico e nei saggi di guarigione delle ferite.
