Name: Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Impara a utilizzare la microscopia olografica digitale per valutare l'infiammazione intestinale e la guarigione delle ferite epiteliali in vitro con campioni di tessuto colico. Questo metodo senza colorazione fornisce parametri biologici quantitativi.

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Ringraziamo Faekah Gohar per aver corretto le bozze del manoscritto. Ringraziamo Sonja Dufentester e Elke Weber per l'assistenza tecnica esperta.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato regionale di etica (il Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Germania) in base alla legge tedesca sulla protezione degli animali. Il comitato etico locale dell&#39;Università di Münster ha approvato l&#39;uso di tessuti umani per l&#39;analisi istologica e microscopio. 1. Gli animali e materiali <ol><li> Utilizzare femminile o topi maschi del ceppo DSS-sensibili richiesto che pesano da 20 a 25 g, e la casa in base alla legislazione cura degli animali locale. Fornire chow speciale per i roditori e autoclavato bere acqua ad libitum. </li><li> Indurre la colite DSS acuta con la somministrazione di 3% w / v destrano solfato di sodio (DSS, peso molecolare: 36,000-50,000 Da) in acqua di rubinetto in autoclave per 5 giorni. NOTA: La potenza del DSS è molto variabile a seconda del produttore e batch. Metti alla prova la tua DSS fornitore-ha fornito prima per l&#39;induzione dell&#39;attività della malattia, per la quale dail peso corporeo glia è un indicatore affidabile e oggettivo. </li><li> Per la valutazione istologica di campioni di tessuto del colon, eutanasia topi di CO 2 insufflazione (o come specificato dalle direttive nazionali ed istituzionali) alla fine dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Setup sperimentale per DSS-colite e in vitro la guarigione della ferita Assays <ol><li> Colture cellulari e la creazione di test di guarigione delle ferite. <ol><li> Grow cellule Caco-2 in una umidità del 95% e 5% CO 2 ambiente a 37 ° C. Utilizzare media RPMI con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Seme cellule Caco-2 con una densità di 4 x 10 5 cellule / cm 2 a 35 mm Petri con alta cultura Inserisci (Figura 4A). NOTA: L&#39;inserto genera due aree di celle coperte che sono separati con uno spazio libero cellulare definito che rappresenta l&#39;area ferito da analizzare. </li><li> Cambiare media due giorni dopo seeding. Eseguire per prima aspirazione di media residua con detriti cellulari utilizzando una pipetta automatica, sciacquare con 100 ml di tampone fosfato (PBS) e aggiungere media RPMI fresco o medio di siero-privato. </li><li> celle di coltura per 24 ore in media di siero-privati ​​(0,1% FBS) integrata con 20 ng EGF / siero ml o 2 mg mitomicina c / ml di siero di rilevare alterazioni nel comportamento delle ferite guarigione. Aggiungere normale media RPMI per controllare le cellule per 24 ore. </li><li> Dopo 24 ore di cultura, rimuovere ed eliminare gli inserti cultura come descritto al punto 3.4 ed eseguire DHM. </li></ol></li><li> Induzione della colite acuta DSS <ol><li> Sciogliere 3 g di DSS in 100 ml di acqua in autoclave per ottenere un 3% (w / v) DSS. Fornire questa soluzione al posto di acqua potabile per i topi ad libitum per 7 giorni. Calcolare 5 ml di DSS-soluzione per topo / giorno. Fornire acqua autoclavato senza DSS per topi di controllo ad libitum. </li></ol></li><li> Preparazione delle sezioni criostatiche di murine e colon umano<ol><li> Euthanize topi di CO 2 insufflazione alla fine dell&#39;esperimento. </li><li> Sezionare addome agli animali, laparotomia 23. Rimuovere l&#39;intero colon accuratamente con una pinzetta e tagliare l&#39;estremità ileale e del retto con le forbici chirurgiche. Tagliare il colon con una forbice longitudinalmente dalla cecale al fine rettale e aprire il colon. Rimuovere tutte le feci dal campione con una pinzetta seguita da lavaggio con PBS 24. </li><li> Preparare rotoli svizzeri arrotolando l&#39;intero colon con un cotone gemma longitudinalmente dalla cecale alla fine del retto con la mucosa curvato verso l&#39;interno. Incorpora campioni del colon in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto e tenere congelato a -80 ° C fino a nuovo uso. </li><li> Incorpora tessuti del colon umano dal pezzo operatorio in ottimali di taglio di temperatura ottobre composto e tenere congelato a -80 ° C fino a nuovo uso. </li><li> sezioni tagliate di 7 micron di spessore dei campioni OCT-composti-embedded con l&#39;aiuto di un cryotome solo prima dell&#39;esame. NOTA: Lo spessore del campione ottimale dipende dalla proprietà di diffusione del tipo di tessuto in esame persistenza e. Per gli esperimenti descritti utilizzando tessuti del colon, spessore della fetta&gt; 10 micron causa importante aumento del rumore a causa di dispersione della luce in immagini quantitativi contrasto di fase DHM, mentre i campioni di spessore &lt;5 micron mostrano un più alto rischio di danno indotto manufatti dal processo di taglio crio. </li><li> Trasferimento sezioni su di un vetrino oggetto vettore. </li></ol></li></ol> 3. Attrezzatura tecnica, software e le procedure per l&#39;acquisizione e la valutazione di ologrammi digitali <ol><li> Microscopio olografico digitale per cellulare quantitativa e imaging dei tessuti <ol><li> Utilizzare un sistema di microscopia fuori asse Mach-Zehnder digitale olografica per l&#39;imaging cellulare dal vivo 25, come mostrato in Figura 1. Assicurarsi che il microscopio è dotato di un10X microscopio lente, un palco microscopio con un supporto per diapositive carrier oggetti in vetro e piastre di Petri con diametro di 35 mm, una camera di riscaldamento per preservare temperatura fisiologica a 37 ° C e software per l&#39;imaging fase quantitativa 25. NOTA: per esempio, come descritto in Kemper et al 26 e Langehanenberg et al 27... NOTA: In alternativa, utilizzare un sistema simile che è in grado di eseguire luminoso microscopia campo dell&#39;imaging fase quantitativa delle cellule viventi e diapositive tessuto sezionato. </li><li> Pulire la lente del microscopio e condensatore con carta di pulizia lente e un detergente (ad esempio, etanolo) come raccomandato dal produttore del microscopio per rimuovere polvere o altre contaminazioni. </li><li> Avviare il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM, selezionare &quot;campo chiaro&quot; modalità di imaging e l&#39;interruttore &quot;on&quot; illuminazione luce bianca. Garantire Köhler-illuminzione del campione come raccomandato dal produttore del microscopio osservando il campione nella finestra di imaging in tempo reale del software di acquisizione immagini (in alternativa un software di acquisizione immagini standard può essere utilizzato in questa fase). NOTA: L&#39;intensità dell&#39;immagine deve essere distribuito omogeneamente nel campo di vista e la posizione del campione non deve muoversi durante rifocalizzazione ottica con l&#39;unità di messa a fuoco del microscopio. </li><li> Selezionare la modalità &quot;DHM&quot; delle immagini, ruotare &quot;off&quot; illuminazione a luce bianca e l&#39;interruttore &quot;on&quot; la luce laser. Verificare che l&#39;illuminazione con luce laser è omogenea (cioè che l&#39;intensità della luce è omogeneamente distribuito nella finestra di imaging in tempo reale del software di acquisizione di immagini del microscopio DHM) e osservare che il vettore modello frangia di interferenza fuori asse appare con sufficiente contrasto nel immagini catturate (ologrammi digitali). </li></ol></li><li> Preparazione di sezioni al criostato per l&#39;imagingcon DHM <ol><li> Prendere (sezione criostato su un vettore oggetto di vetro, spessore: 7 micron, come descritto al punto 2.3) del campione dal congelatore. Scongelare il campione per circa 5 minuti a temperatura ambiente e l&#39;atmosfera normale. </li><li> Aggiungere 50 - 100 microlitri tampone fosfato salino (PBS) come mezzo di inclusione sulla sezione di tessuto usando una pipetta finché non è completamente coperto con tampone. Coprire il campione con una copertura di slittamento di vetro pulito (spessore del vetro 170 micron). NOTA: Over-essiccazione può indurre cambiamenti significativi dell&#39;indice di rifrazione e proprietà dispersive del campione. </li><li> Assicurarsi che la parte inferiore del supporto di vetro e il vetrino vengono puliti da polvere e altri contaminanti che possono indurre la dispersione della luce. Il campione è pronto per le indagini con campo chiaro microscopia e DHM. </li></ol></li><li> l&#39;imaging fase quantitativa delle sezioni di tessuto con DHM <ol><li> Accendere il microscopio olografico digitale, scegliere la lente del microscopio 10X per l&#39;imaging. Avviare l&#39;isoftware di acquisizione mago del microscopio DHM e selezionare la modalità di imaging di file luminosi. </li><li> Posizionare il vetrino tessuto come descritto in 2) nel supporto microscopio, con lo slittamento coperchio rivolto l&#39;obiettivo del microscopio. </li><li> Switch &quot;sul&quot; campo dell&#39;illuminazione luminosa del microscopio DHM. Posizionare il campione con la fase di microscopio e verificare che l&#39;area tessuto di interesse è visibile nella finestra di monitoraggio in tempo reale. Migliorare la nitidezza dell&#39;immagine utilizzando l&#39;unità di messa a fuoco del microscopio. NOTA: Oltre alla zona di interesse, una superficie di scorrimento senza tessuto dovrebbero essere presenti nel campo visivo. </li><li> Catturare un&#39;immagine campo chiaro del campione fortemente focalizzato utilizzando il software di acquisizione delle immagini. </li><li> Selezionare &quot;DHM&quot; modalità di imaging, girare &quot;off&quot; la luce di illuminazione bianca e girare &quot;on&quot; l&#39;illuminazione luce laser. Selezionare il &quot;tempo di esposizione&quot; per la registrazione ologramma di sotto del 3 ms, osservare che holographic fuori asse frange di interferenza appaiono con un adeguato contrasto nella finestra di imaging dal vivo del software di acquisizione delle immagini e catturare un ologramma digitale. </li><li> Ripetere i punti 3.3.3 - 3.3.5 fino a quando sono stati registrati un numero sufficiente di immagini in campo chiaro e ologrammi digitali di diverse aree campione. acquisizione Ologramma è ora completa. </li></ol></li><li> Preparazione del test guarigione della ferita per l&#39;imaging DHM <ol><li> Accendere il Petri camera di riscaldamento piatto del microscopio DHM circa 1 - 3 ore prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento di assicurare condizioni di temperatura stabili durante le misure DHM. </li><li> Preparare banco di lavoro con le attrezzature necessarie (piastra Petri per ferita saggio guarigione è descritto al punto 2.3): pipette, pinzette, coperchio in vetro per la capsula di Petri, 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tamponata terreno di coltura cellulare con fisiologica temperatura (37 ° C) per la preparazione del campione in ambiente sterile. NOTA: </strong&gt; Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) è composto da 10% di siero fetale calve (FCS), 20 mM HEPES (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), e 850 mg / L NaHCO 3. </li><li> Rimuovere il coperchio di plastica dalla piastra di Petri e rimuovere il mezzo di coltura cellulare con una pipetta. Rimuovere l&#39;inserto dal fondo piatto Petri usando pinzette. </li><li> Lavare il campione 1 - 2 volte con 1 ml tamponata con HEPES terreno di coltura delle cellule per rimuovere le cellule morte e restanti componenti cellulari (per esempio, siero) nell&#39;area della ferita. Aggiungere 2 ml di HEPES tamponato mezzo di coltura cellulare e tappare la piastra di Petri con il coperchio in vetro. </li><li> Assicurarsi che il coperchio in vetro e il piatto fondo di Petri sono state pulite da polvere e altre contaminazioni. Campione è pronto per l&#39;osservazione lasso di tempo con DHM. </li></ol></li><li> Monitoraggio multimodale continuo di guarigione della ferita in vitro con DHM <ol><li> Accendere il Petri camera di riscaldamento piatto del microscopio DHM circa 1 - 3 ore primaall&#39;inizio dell&#39;esperimento di assicurare condizioni di temperatura stabili durante le misure DHM. </li><li> Switch &quot;a&quot; microscopio olografico digitale, selezionare la lente del microscopio 10X per l&#39;imaging. Avviare il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM e selezionare &quot;campo chiaro&quot; modalità di imaging. Assicurarsi che la camera di riscaldamento per il piatto Petri opera una temperatura fisiologica (37 ° C). </li><li> Porre la capsula di Petri con la guarigione della ferita test, preparato come descritto in 4), nella camera di riscaldamento del microscopio DHM. </li><li> Selezionare la modalità di imaging campo luminoso e posizionare il campione con palco microscopio osservando nella finestra di monitoraggio dal vivo del software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. Si osservi che l&#39;area desiderata del campione appare fortemente concentrata sotto illuminazione luce bianca. </li><li> Cattura immagini luminose di campo di diverse aree del campione (zona della ferita e le zone circostanti con le cellule confluenti) sotto biancoilluminazione a luce con il software di acquisizione immagini e l&#39;aspetto del documento, densità cellulare e omogeneità. </li><li> Selezionare &quot;campo chiaro&quot; modalità di imaging del microscopio DHM. Scegliere la zona della ferita sotto la luce di illuminazione bianca nella finestra di sorveglianza in tempo reale con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. Assicurarsi che la zona della ferita è libera da cellule morte e non resti siero, e assicurarsi che entrambe le parti comprendono un singolo strato di cellule omogenee, preferibilmente con i bordi dritti. </li><li> Catturare un&#39;immagine luce bianca della ferita iniziale in modalità campo dell&#39;imaging luminoso con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. </li><li> Turn &quot;off&quot; illuminazione a luce bianca, selezionare la modalità &quot;DHM&quot; e l&#39;interruttore &quot;on&quot; illuminazione laser. Selezionare un tempo di esposizione di sotto di 3 ms per la registrazione di ologramma (osservare che olografica fuori asse frange di interferenza appaiono con un adeguato contrasto nella finestra di imaging dal vivo del software di acquisizione immagini di tegli DHM microscopio) e catturare un ologramma digitale. </li><li> Cattura un ologramma campione in modalità DHM con il software di acquisizione immagini e ricostruire un&#39;immagine quantitativa fase con il software di ricostruzione del microscopio DHM per controllare la qualità dell&#39;immagine. </li><li> Selezionare un adeguato intervallo di tempo (ad esempio, 3-5 min) per l&#39;acquisizione ologramma time-lapse con il software di acquisizione delle immagini del microscopio DHM. </li><li> Selezionare la modalità di acquisizione time-lapse del software di acquisizione delle immagini in cui il campione è illuminato solo con la luce laser durante l&#39;acquisizione ologramma. </li><li> Avviare l&#39;osservazione DHM time-lapse del test guarigione delle ferite. </li><li> Fermare l&#39;acquisizione time-lapse dopo il tempo previsto, selezionare la modalità di imaging campo luminoso e documentare l&#39;aspetto finale del campione in immagini luce bianca. </li></ol></li><li> Ricostruire ologrammi digitali dei tessuti sezionati e determinare l&#39;indice medio di rifrazione come parametro per quantificaredensità dei tessuti <ol><li> Ricostruire immagini fase quantitativa dai ologrammi digitali dei tessuti sezionati con il software del microscopio DHM, ad esempio, come descritto in Kemper et al. 26 e Langehanenberg et al. 27. </li><li> Determinare il contrasto di fase Δφ media in diversi strati di tessuto (epitelio, sottomucosa, stroma) nelle regioni opportunamente scelti di interesse (ROI) 19. </li><li> Determinare l&#39;indice di rifrazione del mezzo di inclusione utilizzando un rifrattometro oppure utilizzando un valore appropriato dalla letteratura. (valori di indice di rifrazione per tipico dei media incorporamento: n acqua = 1.334 28, n tampone fosfato (PBS) = 1.337 29, n mezzo di coltura cellulare = 1,337-1,339 29,30). </li><li> Calcolare gli indici di rifrazione diversi strati di tessuto da valori del contrasto di fase media 19 <img alt="Equazione 1"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54460 / 54460eq1.jpg&quot; /&gt; (1) NOTA: In Eq. 1 λ è la lunghezza d&#39;onda della luce laser (qui: λ = 532 nm), D lo spessore dei tessuti sezionati (qui: 7 micron) e n media è l&#39;indice di rifrazione del mezzo di inclusione (qui: n medium = n PBS = 1.337, determinato da un Abbe-Rifrattometro). </li></ol></li><li> Ricostruire e valutare ologrammi digitali dal time-lapse la guarigione della ferita osservazione serie <ol><li> Ricostruire immagini fase quantitativa della serie lasso ologramma tempo ottenuto durante l&#39;osservazione guarigione della ferita con il software microscopio DHM 26,27. </li><li> Normalizzare ogni serie di immagini fase quantitativa per l&#39;immagine con il massimo contrasto di fase. </li><li> Determinare l&#39;area S c che è coperto dalle cellule nelle immagini fase quantitativa DHM di segmentazione delle immagini, che può essere performato usando la cella di profiler del software libero (www.cellprofiler.org 31). </li><li> Calcolare il contrasto di fase media della cellule cellule Δφ nella zona S c. </li><li> Recuperare il DM massa secca cellulare dalla media contrasto di fase Δφ cella nella zona S c 15 <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" /> (2) NOTA: In Equazione 2 DM indica la massa secca cellulare, S c presenta l&#39;area che è occupato dalle cellule e α = 0,002 m 2 / kg. </li><li> Determinare il cellulare rifrazione cellule indice n integrale e l&#39;indice di rifrazione del mezzo n mezzo di coltura cellulare. Determinare cella n separatamente sperimentalmente da cellule in sospensione come descritto nel 30 e misurare media n con un rifrattometro. Alternavamente utilizzare i valori di letteratura per la cella n 30 e n media 29,30. </li><li> Calcolare il d cellulare medio spessore cellulare da λ, cellule Δφ, n cellulare e n media 26,32 <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" /> (3) NOTA: In Eq. 3 la cella parametro d è lo spessore medio delle cellule, λ denota la luce di lunghezza d&#39;onda della luce laser, cellule Δφ indica il contrasto di fase media, e n cellulare e n medie sono l&#39;indice di rifrazione cellulare integrato e l&#39;indice di rifrazione del mezzo circostante. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo dimostrato che DHM fornisce una valutazione accurata del danno istologico in modelli murini colite e campioni ex vivo di tessuto del colon umano. Inoltre, abbiamo mostrato DHM può monitorare continuamente epiteliale guarigione della ferita mentre fornendo allo stesso tempo informazioni multimodale su alterazioni cellulari. In DHM, la ricostruzione di ologrammi catturate digitalmente viene eseguita numerico 32. Pertanto, in confronto al campo chiaro microscopia, contrasto di fase Zern...

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), vale a dire, la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD) sono malattie infiammatorie idiopatiche del tratto gastrointestinale 1. La ricerca sulla fisiopatologia delle IBD e la valutazione dei potenziali nuovi farmaci o nuovi approcci diagnostici è particolarmente importante. Sia nella ricerca di base e la gestione clinica dei pazienti IBD, la mucosa intestinale è diventato un centro dell&#39;attenzione 2,3. La mucosa rappresenta un contorno anatomico, in cui l&#39;interazione tra batteri commensali, cellule epiteliali e vari componenti cellulari del sistema immunitario intestinale orchestrare budello omeostasi 4,5. Tuttavia, nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale, infiammazione intestinale incontrollata e persistente conduce alla mucosa danni, rilevabile come ulcerazioni o stenosi, che possono finalmente culminare nella composizione della funzione di barriera epiteliale, che a sua volta aggrava infiammazione locale 6. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; epiteliale la guarigione della ferita è quindi fondamentale per la rigenerazione epiteliale dopo l&#39;infiammazione, ma è anche un requisito fondamentale per la guarigione delle ulcere gastrointestinali o perdite anastomotica dopo la chirurgia gastrointestinale 7. Epiteliale guarigione della ferita può essere simulato in vitro ferita healing in vitro e in modelli murini di infiammazione intestinale 8,9. Sia in vitro e in vivo approcci hanno inconvenienti, che limitano la precisione della valutazione sperimentale. Saggi in vitro, come saggi scratch classici, richiedono procedure di colorazione prolungata o trasfezione con cromofori fluorescenti. Essi sono spesso limitati dalla loro monitoraggio discontinuo di proliferazione e migrazione cellulare che non può essere automatizzato 10. In vivo modelli, come destrano solfato sodico (DSS) colite indotta, spesso mancano robusti read-out, in parte dovuta alla variazione significativa visto in marker di laboratorio, mare tali marcatori inadeguati per valutare la colite gravità 11,12. L&#39;analisi istologica della mucosa infiammata è attualmente ancora l&#39;approccio più valido per determinare la gravità colite ma questo, come saggi di guarigione della ferita epiteliali in vitro, richiede colorazione e dipende dalla perizia del ricercatore 13. Recentemente digitale microscopio olografico (DHM), una variante della fase di microscopia quantitativa 14, è stato identificato come strumento utile per la valutazione dei epiteliale la guarigione delle ferite in vitro e in vivo 15. DHM permette valutazione della densità del tessuto misurando cammino ottico ritardo di lunghezza (OPD) , che la diagnosi di cancro prospettive romanzo 16-18 e la quantificazione dei relativi infiammazione alterazioni dei tessuti 19. Inoltre, DHM consente il monitoraggio delle dinamiche morfologia delle cellule per determinare lo spessore delle cellule, cellule superficie coperta e intracellulare (proteine) la quantità di contenuti <sup&gt; 15,20. In saggi in vitro, DHM consente anche l&#39;analisi dei processi fisiologici, ad esempio, permeabilità cellulare valutando variazioni di volume delle cellule e spessore 21,22. Inoltre, le misure DHM possono essere automatizzate che impedisce pregiudizi campione investigatore associato. Qui, dimostriamo l&#39;uso di DHM in un modello murino di infiammazione intestinale, e applichiamo anche DHM per l&#39;analisi dei campioni di tessuti umani per il monitoraggio quantitativo di guarigione della ferita come un test in vitro senza etichetta. In primo luogo, valutiamo le alterazioni infiammatorie delle diverse pareti del colon-strati nei topi colitici e sezioni di tessuto da esseri umani con IBD. Dopo aver descritto la procedura di imaging fase quantitativa DHM, forniamo istruzioni dettagliate per l&#39;uso dei componenti del microscopio, la preparazione di sezioni di tessuto e anche descrivere la valutazione delle immagini acquisite fase quantitativa. Successivamente, dimostriamo che DHM può essere utizato per il monitoraggio continuo multimodale di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, e descrivere l&#39;analisi delle caratteristiche cellulari come spessore dello strato di cellule, massa secca e volume cellulare dare visione indotta da farmaci e cellule fisiologica alterazioni.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxymethane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Destrano solfato di sodio (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Svezia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgio</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-metilbutano)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Germania</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composto O.C.T. Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Paesi Bassi</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Streptop/Amfotericina B</td><td>Lonza, Verviers, Belgio</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgio</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgio</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Germania</td><td>12211095/05/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta standard</td><td>Altromin, Lage, Germania</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Paesi Bassi</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgio</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro - ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Germania</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &micro;-Piatto 35 mm con inserto di coltura, high</td><td>ibidi GmbH, Monaco di Baviera, Germania</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Coperchio per &micro;-Piatti, con inserto in vetro</td><td>ibidi GmbH, Monaco di Baviera, Germania</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio olografico digitale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Component</td><td>Model</td><td>Azienda</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Lubecca, Germania</td><td></td></tr><tr><td>Lente</td><td>per microscopio Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Germania</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Brema, Germania</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodale quantitative phase imaging con digital olografico microscopia valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

L&#39;incidenza della malattia infiammatoria intestinale, cioè, la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, è notevolmente aumentato negli ultimi dieci anni. L&#39;eziologia della IBD rimane sconosciuta e strategie terapeutiche attuali si basano sulla soppressione aspecifica del sistema immunitario. Lo sviluppo di trattamenti che colpiscono specificamente l&#39;infiammazione intestinale e epiteliale guarigione della ferita potrebbe migliorare in modo significativo la gestione di IBD, ma questo richiede un rilevamento accurato di alterazioni infiammatorie. Attualmente, i potenziali candidati di droga sono solitamente valutati utilizzando modelli animali in vivo o con tecniche basate su colture cellulari in vitro. L&#39;esame istologico di solito richiede le cellule oi tessuti di interesse per essere macchiati, che possono alterare le caratteristiche del campione e, inoltre, l&#39;interpretazione dei risultati può variare dalla competenza investigatore. microscopio olografico digitale (DHM), basato sul rilevamento di ottica percorso ritardo di lunghezza, permette-Macchia libera di imaging a contrasto di fase quantitativa. In questo modo i risultati di essere direttamente correlati con i parametri biofisici assoluti. Si dimostra come la misurazione delle variazioni di densità dei tessuti con DHM, basato sulla misurazione dell&#39;indice di rifrazione, in grado di quantificare le alterazioni infiammatorie, senza colorazione, in diversi strati di campioni di tessuto del colon da topi e nell&#39;uomo con colite. Inoltre, abbiamo dimostrato il monitoraggio senza etichetta multimodale continuo di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, possibile utilizzando DHM attraverso la semplice determinazione automatica della zona ferita e la determinazione simultanea di parametri morfologici come la massa secca e spessore dello strato di cellule che migrano. In conclusione, DHM rappresenta un prezioso, romanzo e strumento quantitativo per la valutazione di infiammazione intestinale con valori assoluti per i parametri possibili, la quantificazione semplificata di epiteliale guarigione delle ferite in vitro e quindi ha un elevato potenziale di u diagnostica traslazionaleSE.

Configurazione tipica per DHM Imaging per Digital olografico microscopia (DHM) Per eseguire l&#39;imaging campo chiaro e imaging quantitativo contrasto di fase DHM, abbiamo applicato un microscopio rovesciato come illustrato in Figura 1 B. Il sistema è stato modificato collegando un modulo DHM, come descritto in precedenza 25. Ologrammi digitali son...

Una valutazione accurata degli effetti antinfiammatori è della massima importanza per la valutazione di potenziali nuovi farmaci per il trattamento della malattia infiammatoria intestinale. La microscopia olografica digitale fornisce la valutazione dell'infiammazione in campioni di tessuto del colon murino e umano, nonché la valutazione multimodale automatizzata della guarigione delle ferite epiteliali in vitro.

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

L'obiettivo generale di questo studio è utilizzare la microscopia olografica digitale o DHM per fornire un imaging quantitativo automatizzato a contrasto di fase senza macchie di campioni di tessuto del colon dell'infiammazione intestinale per la valutazione multimodale della guarigione delle ferite epiteliali in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione gastrointestinale e della guarigione delle ferite sull'attività della malattia infiammata umana e marina Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente il rilevamento e la quantificazione di cellule e tessuti in base a parametri fisici in modo oggettivo e privo di macchie. A dimostrare le procedure sarà Fittest Ketelhut, un tecnico, del Biomedical Technology Center.Impostare la coltura cellulare, incubare quattro volte dieci al quinto, Caco due cellule per centimetro quadrate in piastre di Petri da 35 millimetri dotate di inserti ad alta coltura in terreno RPMI integrati con FBS e antibiotici a 37 gradi Celsius in 95% di umidità e cinque per cento di anidride carbonica. Dopo due giorni, trattare le cellule con l'agente di interesse e rimettere le colture nell'incubatore per altre 24 ore. Il giorno successivo, aspirare il surnatante e utilizzare una pinzetta per rimuovere gli inserti.Lavare la coltura una o due volte con un millilitro di terreno di coltura cellulare tamponato HEPES per rimuovere eventuali cellule morte e qualsiasi componente cellulare rimanente dall'area della ferita. Quindi, aggiungere due millilitri di terreno tamponato HEPES fresco e chiudere il piatto. Ora posiziona la capsula di Petri nel microscopio olografico digitale e seleziona l'obiettivo 10x.Aprire il software di acquisizione delle immagini e selezionare la modalità di imaging in campo chiaro. Impostare la camera di riscaldamento a 37 gradi Celsius e posizionare la coltura nella camera di riscaldamento. Quindi, spostare il campo di osservazione fino a quando nella finestra di monitoraggio in tempo reale è possibile visualizzare una ferita adatta con un singolo strato di cellule enormi e bordi dritti su entrambi i lati senza cellule morte o siero.Acquisire un'immagine a luce bianca dell'area iniziale della ferita. Quindi, spegnere l'illuminazione a luce bianca e selezionare la modalità di microscopia olografica digitale. Accendere l'illuminazione laser e selezionare un tempo di esposizione inferiore a tre millisecondi per la registrazione dell'ologramma.Se le frange di interferenza olografiche fuori accesso appaiono con un contrasto adeguato, acquisire un ologramma campione e ricostruire un'immagine di fase quantitativa con il software di ricostruzione per verificare la qualità dell'immagine. Quindi, avviare un'osservazione DHM in tempo trascorso della ferita interrompendo la registrazione al punto finale appropriato e ottenere un'immagine finale del campione sotto illuminazione a luce bianca. Per il destrano acuto solfato di sodio, o induzione della colite DSS, fornire tre grammi di DSS disciolti in 100 millilitri di acqua autoclavata ai topi ablibidim.Dopo sette giorni, prelevare sezioni spesse sette micrometri di campioni di colon arrotolati svizzeri dagli animali di controllo e trattati. Immergere ogni sezione in 50-100 microlitri di PBS e coprire i campioni con vetrini di copertura individuali. Verificare che il fondo dei vetrini sia privo di polvere e altre contaminazioni.Quindi, posizionare il primo vetrino sul tavolino del microscopio e regolare il campo visivo fino a quando l'area di interesse del tessuto non è visibile. Metti a fuoco il campione e acquisisci un'immagine in campo chiaro nel software di acquisizione delle immagini. Quindi, selezionare la modalità di imaging DHM e passare all'illuminazione a luce laser.Impostare un tempo di esposizione inferiore a tre millisecondi e verificare che le frange di interferenza olografiche fuori accesso appaiano con un contrasto adeguato nella finestra di imaging in tempo reale. Quindi, acquisisci un ologramma digitale del tessuto. Endoscopicamente, l'evidenza di colite da moderata a grave comprende l'ispessimento della parete del colon, le alterazioni del pattern vascolare, le nedudazioni delle fibre e la granularità della superficie della mucosa.La valutazione istologica convenzionale delle sezioni del colon rivela un marcato edema nella parete del colon dei DSS trattati rispetto agli animali di controllo prevalentemente localizzati nella sottomucosa. Le corrispondenti immagini quantitative a contrasto di fase DHM e le relative mappe dell'indice di rifrazione dimostrano inoltre che queste alterazioni tissutali senza differenze visibili nelle densità del menstroma epiteliale sono particolarmente evidenti nei campioni di tessuto nativo non colorato. L'indice di rifrazione è significativamente ridotto nell'epitelio, nella sottomucosa e nello stroma dei topi colitici rispetto ai controlli sani con una correlazione significativa tra la perdita relativa di peso corporeo e l'indice di rifrazione negli animali da esperimento.Qui viene mostrato il monitoraggio continuo rappresentativo di un test di guarigione delle ferite mediante microscopia olografica digitale per 45 ore. Consente di calcolare la superficie coperta della cellula, lo spessore medio della cellula e la massa secca cellulare nel corso del processo di guarigione. Abbiamo dimostrato che il DHM consente il monitoraggio continuo della guarigione delle ferite epiteliali e contemporaneamente fornisce informazioni bio core sulle alterazioni cellulari indotte dalle citochine.Inoltre, dimostriamo l'accurata valutazione del danno istologico in modelli di colite e campioni di tessuto del colon umano mediante DHM attraverso la misurazione delle variazioni dell'indice di rifrazione. Poiché la DHM si basa sul rilevamento del ritardo della lunghezza del percorso ottico, i parametri biofisici assoluti, come la densità dei tessuti, la massa secca o lo spessore cellulare, possono essere analizzati mediante imaging quantitativo a contrasto di fase senza macchie. Il culmine del DHM con i comuni microscopi da ricerca e la robustezza della tecnica aprono la strada alle applicazioni di routine di questo metodo nella biologia cellulare e nella patologia digitale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia olografica digitale per l'analisi di tessuti di colture cellulari viventi nell'ambiente del laboratorio biomedico. In conclusione, il DHM crea uno strumento prezioso, innovativo e quantitativo per la valutazione dei parametri assoluti dell'infiammazione, nonché per la quantificazione semplificata dell'epitelio volontario in vitro con un alto potenziale per l'uso diagnostico traslazionale.

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Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.

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Descriviamo l'uso di un microscopio ottico standard per eseguire misurazioni quantitative della massa, del volume e della densità cellulare attraverso una combinazione di immagini in campo chiaro e contrasto interferenziale differenziale.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

Piccole tecniche di imaging consentono di animali esami diagnostici seriali e interventi terapeutici in vivo. Recentemente, l'ambito di applicazione è notevolmente ampliato e comprende attualmente la valutazione dello sviluppo del tumore del colon, la guarigione delle ferite e il monitoraggio di infiammazione. Questo protocollo illustra le diverse potenziali applicazioni di endoscopia murino.

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Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.

Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

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Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

Il punteggio sistematico dell'infiammazione intestinale utilizzando un sistema assistito da computer gratuito è un potente strumento per confrontare quantitativamente i cambiamenti istopatologici nei modelli di colite caratterizzati dalla presenza di ulcere e cambiamenti infiammatori. La valutazione del punteggio della colite istologica rafforza le osservazioni cliniche e facilita l'interpretazione dei dati.

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Presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging tridimensionale e ad alta risoluzione, label-free di organoidi utilizzando l'olotomografia a bassa coerenza. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione della coltura di organoidi, l'acquisizione di immagini e l'analisi computazionale delle immagini, consentendo la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche strutturali e delle risposte ai farmaci negli organoidi viventi.

Imaging 3D ad alta risoluzione e analisi con apprendimento automatico senza marcatura di organoidi intestinali tramite olotomografia a bassa coerenza

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Impara a utilizzare la microscopia olografica digitale per valutare l'infiammazione intestinale e la guarigione delle ferite epiteliali in vitro con campioni di tessuto colico. Questo metodo senza colorazione fornisce parametri biologici quantitativi.

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita (Video) | JoVE Journal

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

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