Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di formare, modellare e incapsulare le cellule all'interno di matrici extracellulari basate su polimeri sintetici. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare questioni biologiche critiche relative all'identificazione di segnali cellulari extra che regolano le risposte cellulari all'interno di microambienti eterogenei. Il vantaggio principale di questa tecnica è che viene generata una robusta matrice sintetica per l'incapsulamento e la coltura cellulare utilizzando protocolli e materiali accessibili.

Questo metodo può essere utilizzato per colture cellulari controllate e per studiare la risposta cellulare in vitro. Può essere applicato ad altri sistemi, tra cui la somministrazione di farmaci e l'ingegneria tissutale. Preparare i materiali per la formazione di idrogel come descritto nel protocollo di testo.

Fissare una lente di collimazione all'estremità della guida di luce riempita di liquido per garantire un'intensità della luce relativamente uniforme su tutti i campioni. Regolare la distanza della guida di luce dai campioni per ottenere una dimensione dello spot che copra i campioni di interesse. Per realizzare idrogel non modellati, preparare idrogel spessi stampati in puntali per siringhe pipettando da 10 a 20 microlitri della soluzione precursore del gel nella punta di una siringa tagliata sterile.

Prepara un singolo gel per siringa in modo che abbia uno spessore compreso tra 0,5 e 1,5 millimetri, in base al volume e al diametro della siringa. Preparare idrogel sottili in stampi per vetrini di vetro posizionando la guarnizione di gomma attorno ai bordi del vetrino non rivestito. Quindi, pipettare da cinque a 10 microlitri della soluzione precursore del gel sul vetrino di vetro non rivestito.

E posizionare il vetrino rivestito con anti adesivo sopra la soluzione in gel. Fissare i vetrini con piccole clip per legare per stabilizzarli. Impostare l'intensità della lampada in modo da raggiungere 10 milliwatt per centimetro quadrato sulla superficie del gel per stampi per punte di siringhe o stampi per vetrini in vetro.

Utilizzo di un radiometro per rilevare l'intensità. E posiziona gli stampini sotto la lampada. Applicare una luce da uno a cinque minuti per consentire la completa polimerizzazione dei gel.

Utilizzare un tempo di polimerizzazione più breve per i gel con un contenuto di polietilenglicole tereftalato più elevato. E un tempo più lungo per i gel con un contenuto inferiore per produrre idrogel completamente polimerizzati con moduli all'interno della gamma dei tessuti molli. Posizionare i gel dagli stampi per puntali della siringa in una piastra sterile da 48 pozzetti non trattata e posizionare i vetrini in una piastra sterile.

Per preparare gli idrogel modellati, preparare la soluzione precursore come descritto nel protocollo di testo e pipettare energicamente la soluzione per garantire una miscelazione uniforme della soluzione. Quindi, coprire i gel preformati con un peptide di penton in una soluzione fotoiniziatrice di fosfato di litio e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione in eccesso.

Se i gel sono modellati in una punta di siringa, utilizzare una spatola per trasferire con cura dalla piastra a 48 pozzetti a un vetrino di vetro sterile per la modellazione. Posizionare una maschera fotografica con il motivo desiderato direttamente sopra la siringa e i gel stampati con vetrini. Assicurarsi che la parte stampata della maschera tocchi il gel per una fedeltà ottimale del modello.

Posizionare i campioni sotto la lampada e irradiare per un minuto. Dopo la modellazione, posizionare i gel stampati con siringa in una piastra sterile a 48 pozzetti non trattata con coltura tissutale. Posizionare i gel modellati con vetrini che aderiscono ai vetrini in un piatto sterile.

Risciacquare tre volte, 15 minuti con terreno di coltura o il tampone appropriato in base agli esperimenti pianificati. Per preparare la rilevazione e la quantificazione dei tioli liberi negli idrogel fotomodellati, preparare prima le soluzioni ed eseguire i calcoli come descritto nel protocollo di testo. Formare idrogel sottili per modellare come prima.

In particolare, creare gel con tioli liberi in eccesso e modellare metà di questi campioni con il peptide penton utilizzando un vetrino coprioggetti trasparente per esporre completamente l'intero gel con la luce. Posizionare i gel modellati e non modellati nei pozzetti di una piastra da 48 pozzetti. Risciacquare per 15 minuti, tre volte con il tampone di reazione di Ellman, per consentire la diffusione delle specie reattive finali fuori dal gel e il rigonfiamento dell'equilibrio.

Aggiungi un ulteriore tampone di reazione Ellman ai gel di risciacquo, in modo che il volume del gel gonfio con il tampone di reazione sia un multiplo di 20 microlitri. Ad esempio, se il volume previsto del gel gonfio è di 15 microlitri, aggiungere cinque microlitri di tampone di reazione. E se il volume di gel gonfio previsto è di 30 microlitri, aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione.

Pipettare gli standard sistine in pozzetti individuali di una piastra da 48 pozzetti in multipli di 20 microlitri. A seconda del volume utilizzato nel passaggio precedente. Ad esempio, se la fase precedente aveva un volume di gel gonfio, più un tampone di reazione extra pari a 40 microlitri, aggiungere 40 microlitri di ogni standard ai singoli pozzetti vuoti.

Quindi, diluire il reagente di Ellman e il tampone di reazione. Aggiungere il reagente di Ellman diluito ai pozzetti contenenti standard e campioni. Per campioni da 20 microlitri, aggiungere 183,6 microlitri di soluzione a ciascun pozzetto.

Incubare o porre su uno shaker per un'ora e trenta minuti, o fino a quando il colore della soluzione corrisponde al colore dei gel mediante ispezione visiva, per garantire una diffusione sufficiente del dianione giallo 2-Nitro-5-tiobenzoico, che viene generato dalla reazione del reagente di Ellman con i tioli liberi dal gel. Prelevare 100 microlitri di soluzione dai campioni e dagli standard e posizionarli nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Leggere l'assorbenza a 405 nanometri su un lettore di piastre.

Per visualizzare i modelli fotografici, rimuovere il tampone di reazione in eccesso strofinando delicatamente i bordi dell'idrogel con un fazzoletto. Pipettare il reagente di Ellman direttamente sulla superficie del gel. Immagini immediate su un microscopio ottico a 10x o su un microscopio stereo con fotocamera a colori.

Raccogli le cellule e preparale per l'incapsulamento come descritto nel protocollo di testo. Immediatamente dopo l'aspirazione del PBS, sospendere le cellule pellettate nella soluzione precursore a una concentrazione finale di cinquemila cellule per microlitro. Lasciare una concentrazione appropriata di tioli liberi per una successiva reazione con il peptide di pentone.

Se si desidera un modello fotografico. Modellare, polimerizzare e modellare gli idrogel come prima. Sciacquare i gel per 10 minuti, tre volte, nel terreno di crescita dopo il modellamento per rimuovere le specie non reagite e l'eccesso di fotoiniziatore del fosfato di litio.

Incubare i gel in terreno di crescita a 37 gradi Celius e al cinque percento di CO2 fino al punto temporale desiderato per ulteriori analisi. Rabboccare il terreno ogni 48 ore o come determinato dalle applicazioni. Per determinare la vitalità delle cellule incapsulate, rimuovere prima il terreno di coltura dai gel e risciacquare per 15 minuti, tre volte, con PBS per consentire la diffusione del terreno dai gel.

Aggiungere due microlitri dell'omodimero di etidio-1 scongelato a due millimolari e 0,5 microlitri delle soluzioni di AN di calcio scongelate a quattro millimolari, a un millilitro di PBS sterile. Vortice per garantire una miscelazione completa. Aggiungere 300 microlitri di soluzione in piedi a ciascun gel per siringa nelle piastre a 48 pozzetti, o abbastanza da coprire la superficie del gel su un vetrino in un piatto sterile.

E incubare per 45 minuti. Rimuovere la soluzione in eccesso e risciacquare per rimuovere il colorante in eccesso dai gel. Visualizzare le cellule su un microscopio confocale.

O su un microscopio a epifluorescenza con capacità di 10x. E 488 nanometri di eccitazione e 525 nanometri di emissione. La concentrazione di tiolo libero di idrogel non modellati e modellati quantificati con Ellman ha dimostrato che gli idrogel inizialmente polimerici per un minuto e per cinque minuti hanno concentrazioni di tiolo libero statisticamente simili, indicando una reazione rapida e una gelificazione completa entro un minuto.

Il successivo patterning di massa dei gel incubati con peptidi di penton per 30 minuti e per un'ora e 30 minuti, ha una riduzione dal 60 all'80% della concentrazione di tiolo libero, indicando una modifica efficiente del tiolo in eccesso. I modelli fotografici formati dalla luce brillante attraverso campioni coperti da maschere, stampati qui con linee, possono essere osservati in due dimensioni con l'applicazione del reagente di Ellman. Oppure, in tre dimensioni con l'incorporazione di peptidi fluorescenti nell'imaging successivo.

Le cellule staminali umane adulte incapsulate all'interno di irogelli sono state trattate con colorazioni di vitalità e idrotossicità. E ripreso con microscopia confocale. Le cellule vitali senza danni alla membrana sono etichettate in verde e indicano la sopravvivenza delle cellule un giorno dopo l'incapsulamento.

Le cellule iniziano a diffondersi all'interno della matrice sei giorni dopo l'incapsulamento. Come mostrato nell'immagine nel riquadro. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere procedure di manipolazione sterili e attente per evitare danni alle cellule dopo l'incapsulamento attraverso l'introduzione di contaminanti o traslazione meccanica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunocolorazione, la citometria a flusso e l'espressione genica per studiare la funzione e il destino delle cellule in risposta all'ambiente extracellulare. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nei campi della biologia, della bioingegneria e della medicina, allo studio dell'erosione della regione tissutale o della progressione della malattia in matrici extracellulari sintetiche con controllo delle proprietà definito dall'utente, verso lo sviluppo di nuove strategie di trattamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incapsulare le cellule e modellare le matrici morbide per studi di coltura cellulare controllata.