Name: Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Scopri la formazione mediata dalla luce di idrogeli sintetici per colture cellulari tridimensionali. Questo metodo utilizza chimica fotoclick citocompatibile per incapsulare cellule e studiare risposte cellulari in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai programmi Delaware Cobre in Drug Discovery e in Biomateriali avanzata finanziati dallo sviluppo Premi Istituzionali presso l&#39;Istituto Nazionale di generali scienze mediche presso il National Institutes of Health (P20GM104316 e P30 GM110758-01, rispettivamente), la Pew Charitable Trusts (00026178), un Science Foundation Premio nazionale Carriera (DMR-1.253.906), il Fondo di Burroughs Wellcome (1.006.787), e il programma National Science Foundation IGERT SBE2 presso l&#39;Università di Delaware (borsa di studio di L. Sawicki). Gli autori ringraziano il Centro Bioimmagini del Delaware Biotechnology Institute presso l&#39;Università di Delaware per la formazione e l&#39;accesso alla microscopia confocale, la signora Katherine Wiley per l&#39;assistenza durante le riprese video, il signor Matthew Rehmann per fornire generosamente hMSCs isolate dal midollo osseo, il Prof. Christopher J . Kloxin e il signor Stephen Ma per fornire generosamente fotomaschere, e il Prof. Wilfred Chen per l&#39;utilizzo del lettore di piastre automatizzato. </p&gt;

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La procedura qui presentata illustra le tecniche per photoencapsulate cellule all&#39;interno idrogel formate da tiolo-ene clic chimica e successivamente photopattern i gel con segnali biochimici. L&#39;uso della luce per formare inizialmente idrogel permette una miscelazione omogenea sospensione delle cellule all&#39;interno della soluzione di polimero prima della polimerizzazione. polimerizzazione &#39;blocca&#39; Rapid gel nella forma dello stampo definita e incapsula cellule all&#39;interno della rete idrogel sospesi. I gel possono anche essere stampati in numerose forme diverse (ad esempio, vetrini o siringhe) a seconda dell&#39;applicazione finale desiderato. Ad esempio, cellule incapsulate cultura 3D in idrogel allegati al vetrini sono particolarmente utili per applicazioni di imaging come attenuazione della luce è limitata all&#39;interno di un campione sottile. stampi siringa può essere utilizzato per una rapida incapsulamento delle cellule, consentendo un maggior numero di campioni da preparati in breve tempo (rispetto al vetrinos) che può essere utilizzato per esperimenti che richiedono un gran numero di cellule, come la citometria a flusso o qPCR. Successivamente, questi gel quindi possono essere modellati con segnali biochimici per sollecitare risposte cellulari desiderati quali la differenziazione o l&#39;invasione. 30,31 Saggi di redditività e attività metabolica indicano la sopravvivenza delle cellule del sistema materiale e condizioni patterning presentati. Si noti che l&#39;attività metabolica è stata monitorata fino al giorno 3 in gel non degradabili (RGKGRK peptide reticolazione) per valutare gli effetti iniziali di condizioni di polimerizzazione e patterning sulla funzione cellulare. Inoltre, un test di integrità della membrana (Live / Dead vitalità / citotossicità colorazione) di hMSCs a 1 e 6 giorni post-incapsulamento in gel formulati con un peptide reticolazione degradabile (GPQGIWGQ) supporta che le cellule rimangono vitali e diffondere a 1 settimana in cultura. La vitalità di linee cellulari aggiuntive stato segnalato per le condizioni di photopatterning 32 simili a quelleusato qui e può essere valutato per il sistema idrogel descritto utilizzando vivo colorazione / morti e saggi di attività metabolica. Anche se non abbiamo osservato problemi con la vitalità delle cellule di utilizzare questo sistema di materiali e relative procedure (4.2 e 4.3), alcuni tipi di cellule possono essere sensibili a radicali liberi e / o esposizione alla luce. In questo caso, gli utenti potrebbero considerare l&#39;utilizzo di sistemi di materiali non photoinitiated come l&#39;azoturo-alchino, 12 FXIII, 31 o chimiche di formazione idrogel Diels Alder-based. 33 Facile tecniche per rilevare e quantificare patterning di segnali biochimici all&#39;interno di gel sono anche presentati (3.1 e 3.2). Dosaggio di Ellman è di particolare interesse perché i reagenti sono commercialmente disponibili e non sono richieste fasi di lavorazione sintetica extra o reagenti più costosi (per esempio, peptide fluorescenza marcata). dosaggio di Ellman può essere utilizzato per determinare con precisione la modifica di tioli liberi con segnali biochimici sotto different photopatterning condizioni, nonché di visualizzare rapidamente modelli. Per quantificare incorporazione peptide, la concentrazione gruppo funzionale tiolo prima e dopo patterning, come misura quantitativa di peptide incorporazione, è direttamente valutata con test di Ellman. Mentre questo tipo di quantificazione può essere fatto con peptidi fluorescenza marcata, 34 quantificazione di imaging basata richiede più fasi di manipolazione e analisi in termini di tempo (ad esempio, la sintesi di un peptide fluorescenza marcata e la generazione di una curva di calibrazione per correlare fluorescenza concentrazione peptide utilizzando l&#39;analisi delle immagini). Per l&#39;imaging peptide incorporazione, il reagente di Ellman può essere applicato direttamente ai campioni ed immediatamente visualizzato. Mentre limitato alla xey piani per la visualizzazione del modello, la tecnica può essere usato come un semplice metodo di routine per determinare se sono state modellato matrici contenenti gruppi tiolici liberi. È importante notare che dosaggio di Ellman non è ccytocompatible onsidered, così mentre può essere usata per osservare e quantificare photopatterns, non può essere eseguita in presenza di cellule. Per l&#39;imaging patterning in tre dimensioni e in presenza di cellule, la coniugazione di peptidi fluorescenti all&#39;interno matrici di idrogel rimane un approccio potente e ampiamente utilizzato. Risoluzione dei modelli può essere valutata nelle direzioni x, ye z-aerei usando la microscopia confocale, e questo metodo è cytocompatible modo che le cellule all&#39;interno delle regioni fantasia o regioni non-fantasia possono essere identificati. Nel loro insieme, le tecniche di analisi e di imaging-based di Ellman sono strumenti complementari per i ricercatori di valutare quantitativamente e qualitativamente la photopatterning di segnali biochimici all&#39;interno del sistema materiali. Photoclick, o più in generale photoinitiated, chimiche per la formazione e la modifica di idrogeli in presenza di cellule sono numerosi. Lo stampaggio, l&#39;incapsulamento, e patterning tecniche presentate qui non sono limmitata al sistema materiale descritto e può essere applicata a chimiche a base di luce alternativi, come tiolo-alchino, 35 azide-alchino, 4 e altre chimiche tiolo-ene (ad esempio, tiolo-norbornene), 10,13 nonché con diversi fotoiniziatori, come Irgacure 2959, eosina Y, e canforochinone. Nota, gli utenti possono avere bisogno di regolare i parametri di procedura (ad esempio, tempi di incubazione, i tempi di polimerizzazione, densità cellulare) per garantire che le condizioni rimangano cytocompatible per questi altri sistemi. Poiché il processo di patterning richiede diffusione del peptide (s) alloc-modificato in idrogel (2.2.3-2.2.5), questo processo può rivelarsi più utile per l&#39;aggiunta di porzioni integrine vincolante (ad esempio, peptidi o proteine della matrice extracellulare frammenti) al idrogel, dove è richiesta attacco del ligando alla rete per la generazione di forze di trazione dall&#39;attivazione cellulare e completa integrina. 36 Note, per biomolecole che possonoessere altrettanto attivi in soluzione o su immobilizzazione (ad esempio, fattori di crescita o citochine), la fase di incubazione per porzione diffusione (~ 1 ora) nel idrogel potrebbe portare ad eventi che Convolute risultati patterning segnalazione. Altri metodi sono stati stabiliti per il fattore di crescita immobilizzazione o il sequestro del locale per il loro patterning. 37-39 Inoltre, la risoluzione modello è dettata dal controllo sulla esposizione alla luce. Qui, fotomaschere consentire la creazione di modelli attraverso la profondità di gel e in x e y aerei; tuttavia, una maggiore controllo spaziale sopra patterning di segnali biochimici all&#39;interno gel può essere ottenuto con metodi alternativi di irradiazione come l&#39;uso di due fotoni microscopio confocale per generare modelli nel assi X, Y e aerei z-. 34,40 Infine, è importante notare che, mentre il sistema materiale utilizzato in questa procedura è solo inizialmente modificato con segnali biochimici, chimiche Photoclick ortogonali potrebbero essere utilizzati per consentire alterazioni di proprietà della matrice nel tempo. 12 La procedura e le tecniche qui presentate aggiungono diversità delle attuali approcci per la creazione di matrici sintetiche con caratteristiche ben definite e spatiotemporally controllati. In particolare, la disponibilità commerciale dei reagenti e materiali utilizzati in questo procedimento sarà utile per una vasta gamma di ricercatori interessati all&#39;uso di biomateriali idrogel a base per applicazioni in coltura cellulare controllata.

Istruzioni chimiche sono sempre più utilizzati nella progettazione di materiali per numerose applicazioni biomediche, tra somministrazione di farmaci, ingegneria dei tessuti, e coltura cellulare controllata, a causa dei loro selettive, reattività cytocompatible efficienti, e spesso. 1-3 chimiche Photoclick che utilizzano la luce per attivare o avviare reazioni (ad esempio, azide-alchino, 4 tiolo-ene, 5 e tetrazolo-alchene 6) sono di particolare interesse per la formazione o la modifica di biomateriali. Tassi rapidi in condizioni miti e il controllo di quando e dove si svolgono con la luce rendono queste reazioni particolarmente adatto per il controllo user-diretto di proprietà biomateriali in presenza di cellule. 7,8 In particolare, sono stati utilizzati chimiche tiolo-ene Photoclick per generare biomateriali a base di idrogel con robuste caratteristiche meccaniche 5,9 e per l&#39;incapsulamento di una grande varietà di tipi di cellule, tra cui, ma nont limitato a, le cellule umane staminali mesenchimali (hMSCs), i fibroblasti, condrociti e cellule pancreatiche, con la promessa per coltura cellulare e la consegna. 10,11 Inoltre, questi chimiche sono state utilizzate per il patterning spaziale di segnali biochimici per imitare gli aspetti chiave della microambienti cellulari nativi e agevola gli opportuni interazioni cellula-matrice, tra cui l&#39;adesione, la differenziazione, e l&#39;invasione. 3,12 Per la costruzione di idrogel tiolo-ene con luce, peptidi contenenti residui di cisteina (tiolo) comunemente vengono fatte reagire con polimeri funzionalizzati con acrilati o norborneni ( &#39;ene&#39;) per una rapida, la polimerizzazione photoinitiated in condizioni cytocompatible. 13 Espansione questa cassetta degli attrezzi, abbiamo cercato di stabilire metodi per la formazione di idrogel con nuovi blocchi di costruzione versatile e accessibile che ha richiesto l&#39;elaborazione di sintesi minimo o erano disponibili in commercio verso la loro ampio utilizzo come matrici extracellulari sintetici.Uno per il ciondolo, gruppi integrine vincolante per promuovere l&#39;adesione delle cellule [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] o due per legami crociati non degradabili o cellule-degradabili [K (14: In particolare, i peptidi sono stati modificati con allilossicarbonil (Alloc) lisine -protected alloc) RGKGRKGK (alloc) G o KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc, rispettivamente]. Con queste sequenze, le condizioni sono state stabilite per la reazione rapida (1-5 min), con quattro bracci poli tiolo-modificato (glicole etilenico) (PEG4SH) utilizzando dosi cytocompatible della lunghezza d&#39;onda della luce UV (10 mW / cm 2 a 365 nm) e litio fotoiniziatore fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Gli idrogel risultanti erano stabile in condizioni di coltura cellulare per settimane. Per abilitare la degradazione delle cellule-driven e rimodellamento, un peptide enzimaticamente-cleavable è stata costituita entro i legami crociati gel (cioè, GPQGIWGQ), 15 e un modello di cellula primaria, le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs), è rimasto altamente praticabile dopo l&#39;incapsulamento e during cultura all&#39;interno di queste matrici. Inoltre, i peptidi sono stati spazialmente fantasia all&#39;interno di questi materiali, e hMSCs rimanere vitali e metabolicamente attiva in condizioni photopatterning. Alternative sequenze peptidiche pendente, non è riportato (es IKVAV, YIGSR, GFOGER, ecc), anche può essere incorporato all&#39;interno di matrici per sondare interazioni cellulari aggiuntivi con il microambiente circostante. Questi risultati sono promettenti per l&#39;applicazione di questi materiali idrogel a base per tridimensionale coltura cellulare (3D) e la consegna di studiare e interazioni dirette cellula-matrice per una varietà di tipi cellulari. Qui, metodi per photoencapsulate cellule e segnali biochimici successivamente photopattern all&#39;interno del sistema idrogel proposto sono presentati (Figura 1). Tecniche per osservare e quantificare questi photopatterns anche sono dimostrati: in particolare, i) l&#39;utilizzo quantitativo e qualitativo dei test di Ellman per determinare la Modificazione dei tioli liberi all&#39;interno substrati a motivi geometrici e ii) l&#39;uso qualitativa complementare di peptidi fluorescenti (AF488Pep1Alloc) per osservare questi modelli in tre dimensioni. Inoltre, metodi per determinare la vitalità (Live / Dead vitalità / citotossicità colorazione) e l&#39;attività metabolica (MTS; 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolium) sono presentati in modo tale che gli utenti possono determinare il citocompatibilità delle condizioni photoencapsulation e photopatterning per le diverse linee di cellule all&#39;interno di matrici di idrogel. Mentre il protocollo è dimostrata per un sistema Photoclick idrogel basato sulla luce facile, le tecniche possono essere applicate a numerosi altri sistemi idrogel radicalmente avviate per photoencapsulation e photopatterning in presenza di cellule.

<table><tbody><tr><td>Peptidi personalizzati</td><td>Vari fornitori</td><td>----</td><td>I peptidi possono anche essere sintetizzati tramite tecniche SPPS standard con materiali di fornitori come ChemImpex e ChemPep.</td></tr><tr><td>PEG a 4 bracci Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Elencato tra i PEG omofunzionali a più bracci. PEG4SH può anche essere sintetizzato come precedentemente citato.</td></tr><tr><td>Litio Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato</td><td>Colorado Soluzioni fotopolimeriche</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil fenilfosfonito</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 149470</td><td>Attenzione, provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.</td></tr><tr><td>2,4,6-Trimetilbenzoile cloruro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>682519</td><td>Attenzione, provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.</td></tr><tr><td>Bromuro di litio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>Pallone, fondo rotondo, 100&nbsp; ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>Imbuto filtrante da 80 ml, Buchner, fritta media</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>Se lo si desidera, è possibile utilizzare la carta da filtro all'interno di un normale imbuto di vetro.</td></tr><tr><td>Agitatori magnetici</td><td>Fornitori vari</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico e piastra riscaldante</td><td>Fornitori vari</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td>Fornitori vari</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Selezionare il terreno e la tripsina appropriati a seconda del tipo di cellula.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Vari fornitori</td><td>----</td> <td>formati da 1,5 o 2 ml, sterili.</td></tr><tr><td>Siringa BD con punte a slittamento (Luer) (senza ago)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>Il numero di prodotto qui elencato è per una siringa da 1 ml (16H), sono disponibili varie misure (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in vetro semplice premium Fisherfinest</td> Fisher <td>Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Gomma siliconica ad alta purezza, 0,010" di spessore, foglio da 6" x 8", durometro 55A (guarnizione)</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 prove</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, 800002243 Amazon originale</td><td></td><td></td><td>Può essere acquistato da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>Photomask Division, diversi disegni possono essere stampati a piacere.</td></tr><tr><td>DTNB; Reagente di Ellman; 5,5-ditio-bis(acido 2-nitrobenzoico)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, pellet/Certificato ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Acido ortofosforico</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>Cisteina cloridrato monoidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, per cellule di mammifero</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Aquoous One Solution Assay</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrifuga Vari fornitori</td><td>----</td><td>Capace di velocità a 90-110 x g.</td></tr><tr><td>Lettore di piastre multipozzetto</td><td>Vari fornitori</td><td>----</td><td>In grado di leggere l'assorbanza a 405 nm in una piastra a 96 pozzetti.</td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente o confocale</td><td>Vari fornitori</td><td>----</td><td>Per visualizzare modelli peptidici e cellule all'interno di idrogel.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Serie 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>I sistemi a luce alternata possono essere utilizzati per polimerizzare gli idrogel.</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite Software</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>Disponibile all'zeiss.com; compatibile con le immagini scattate con i microscopi Zeiss</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>----</td><td>Disponibile all'imagej.nih.gov; applicabile per l'analisi generale delle immagini</td></tr></tbody></table>

formazione light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Clicca chimiche sono stati studiati per l&#39;impiego in numerose applicazioni biomateriali, tra cui la somministrazione di farmaci, ingegneria dei tessuti, e la coltura cellulare. In particolare, reazioni click luce-mediata, quali reazioni tiolo-ene e tiolo-ino photoinitiated, garantire un controllo spaziotemporale sopra proprietà del materiale e consentire la progettazione di sistemi con un alto grado di controllo di proprietà dall&#39;utente diretto. Fabbricazione e modifica di biomateriali a base di idrogel che utilizzano la precisione offerta dalla luce e la versatilità offerta da questi chimiche tiolo-X Photoclick sono di crescente interesse, in particolare per la coltura di cellule all&#39;interno di ben definiti, microambienti biomimetici. Qui, descriviamo i metodi per la photoencapsulation delle cellule e la successiva photopatterning di segnali biochimici all&#39;interno di matrici di idrogel che utilizzano blocchi di costruzione versatili e modulari polimerizzati da una reazione Photoclick tiolo-ene. In particolare, un approccio è presentato per constructing idrogel da allilossicarbonil (Alloc) legami crociati del peptide -functionalized e frazioni peptidiche ciondolo e poli tiolo-funzionalizzati (glicole etilenico) (PEG), che rapidamente polimerizzare in presenza di litio acylphosphinate fotoiniziatore e dosi cytocompatible di lunghezza d&#39;onda ultravioletta (UV). Facile tecniche di visualizzare photopatterning e quantificare la concentrazione di peptidi aggiunti sono descritti. Inoltre, i metodi sono stabiliti per le cellule incapsulamento, in particolare le cellule staminali mesenchimali umane, e determinare la loro vitalità e l&#39;attività. Mentre la formazione ed il modello iniziale di idrogel tiolo-alloc sono mostrati qui, queste tecniche ampiamente possono essere applicati ad un certo numero di sistemi materiali altra luce e radicale-iniziati (ad esempio, tiolo-norbornene, tiolo-acrilato) per generare substrati fantasia.

La messa a punto e la procedura per photoencapsulate cellule e gel successivamente photopattern contenenti cellule incapsulate è rappresentato in figura 1, e un esempio per la preparazione di soluzioni madre per formare una% gel 10 in peso è fornita in tabella 1. Utilizzando la tabella 1, la quantità di monomeri (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) e fotoiniziatore (LAP) necessario per polimerizzare idrogel viene calcolato. In base a questi calcoli, soluzioni stock di PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, e LAP sono preparati e mescolati con e senza Pep1Alloc per la formazione e photopatterning gel, rispettivamente (Figura 1A). Successivamente, le cellule vengono raccolte dalle piastre, contati e centrifugati in quantità appropriate per incapsulamento (Figura 1B). Il pellet cellulare viene risospeso in soluzione gelificante (peptide / polimero / LAP in PBS), e miscele di cellule / monomero vengono trasferiti al vetro o una siringa molds. Le cellule sono incapsulati all&#39;interno idrogel all&#39;atto dell&#39;applicazione della luce (1-5 minuti e 10 mW / cm 2 a 365 nm) (Figura 1C). Per photopatterning (Figura 1D), i gel sono impregnati con Pep1Alloc e LAP per 30 minuti a 1 ora e 30 min, permettendo la diffusione di peptide e iniziatore nella matrice polimerizzato. Questi gel peptide-carico sono coperti di fotomaschere con motivi desiderati ed esposto ad una seconda dose di luce (1 min) per coniugare i peptidi a tioli liberi all&#39;interno della matrice. Cavezze pendente solo sono covalentemente legati al gel in regioni esposte alla luce, facilitando appropriate interazioni cellula-matrice e mimando principali proprietà meccaniche e biochimiche del microambiente cellule nativa verso tastatura funzione cellulare e destino in vitro. dosaggio di Ellman fornisce un metodo facile e poco costoso da quantificare modifica gel e peptide incorporazione all&#39;interno photopattesubstrati rned. Fantasia e gel non-fantasia (ad esempio, gel con o senza modifiche peptide) sono immersi in tampone di reazione post-polimerizzazione di Ellman. Successivamente, standard cisteina ei gel imbevuti in tampone sono poste in piastre da 48 pozzetti e incubate con il reagente di Ellman (Figura 2A, sinistra). Dopo 1 ora e 30 minuti, aliquote di campioni vengono posti in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e l&#39;assorbanza è registrata a 405 nm. Una curva di calibrazione (Figura 2A, destra) dagli standard cisteina è tracciata (assorbanza vs concentrazione, adattamento lineare), e la quantità di tioli liberi in gel può essere determinato in base al fattore di diluizione. Queste concentrazioni tioli liberi per vari polimerizzazione e photopatterning condizioni di un gel 10% in peso sono mostrati nella Figura 2B. Gel polimerizzati per 1 o 5 minuti senza Pep1Alloc (blu bar, I = 1 min e II = 5 min) hanno statisticamente simili concentrazioni tioli liberi, indicando tcappello una reazione rapida verifica e gelificazione è completata entro 1 minuto (a due code t-test, p&gt; 0.05). Così, esposizione aggiuntiva alla luce (2-5 minuti) non provoca ulteriore conversione dei gruppi funzionali. Gel polimerizzati per 1 min senza Pep1Alloc erano intrisi di Pep1Alloc (3 mg / ml) e LAP (2,2 mm) per 30 e 90 min (barre verdi, II = 30 min e IV = 90 min) ed esposti a una seconda dose di luce per 1 min. La diminuzione tioli liberi (60-80% rispetto alla condizione 1 min) indica modifica efficiente di gel con stecche pendente in queste condizioni. Se modifica superiore è desiderato, aumento delle concentrazioni di soluzione Pep1Alloc possono essere usati come accessibilità Pep1Alloc di tioli liberi in soluzioni diluite peptidici possono limitare conversione; per esempio, abbiamo trovato che le concentrazioni fino a 20 mg / ml Pep1Alloc producono&gt; conversione del 90% di tioli liberi. Unicamente, modelli di peptidi aggiunti al idrogel puòessere rapidamente ripreso con il reagente di Ellman (Figura 3A, in 5 min). Tuttavia, la visualizzazione del modello è perso nel tempo (maggiore di 5 min) a causa della diffusione giallo TNB 2- dianione attraverso il gel. Per migliorare la risoluzione delle immagini e osservare i modelli in tre dimensioni (X, Y, e Z piani) e in presenza di cellule, peptide fluorescente addizione (AF488Pep1Alloc) può essere utilizzata. Nella Figura 3B X, Y e Z-proiezioni di pile di immagini scattate con un microscopio confocale sono mostrati, a dimostrazione risoluzione modello (scala micron). Circa (94 ± 2)% e (94 ± 1)% di hMSCs incapsulati all&#39;interno di gel degradabili (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) rimangono (corpi cellulari verdi) vitali 1 e 6 giorni dopo l&#39;incapsulamento, rispettivamente, con poche cellule morte (nuclei rossi ) osservato (Figura 4A). Inoltre, hMSC diffusione è osservata a 6 giorni post-incapsulamento ( <st<html> rong&gt; Figura 4A, nel riquadro), che indica che le cellule possono rimodellare e interagire con queste matrici MMP-degradabili modificati con RGDS integrine vincolante. Saggi di attività metaboliche effettuati su cellule incapsulate in gel non degradabili (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 e 3 giorni dopo l&#39;incapsulamento (Figura 4B) di fornire una seconda misura della vitalità cellulare e dimostrano che le cellule rimangono attivi per le varie condizioni photoencapsulation e photopatterning testati con dosaggio di Ellman (Figura 2B). In particolare, non vi è alcuna differenza significativa dell&#39;attività metabolica tra i 30 min e 90 min incubazione con Pep1Alloc + LAP (condizioni III e IV) e l&#39;incapsulamento iniziale (condizioni di I e II), che indica che la procedura è appropriata per le applicazioni di photopatterning a la presenza di cellule incapsulate (due code t-test, p&gt; 0.05). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Installazione per incapsulare le celle all&#39;interno di idrogel e successivamente photopatterning con l&#39;indicazione biochimica (A) Le soluzioni madre di macromeri e fotoiniziatore sono preparati e misto (PEG4SH = spina dorsale, Pep2Alloc = reticolazione, Pep1Alloc = ciondolo parte adesiva (RGDS), LAP = fotoiniziatore ). (B) Le cellule sono raccolti per l&#39;incapsulamento. (C) Le cellule sono mescolate con le soluzioni macromero senza o con peptidi integrine vincolante (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP o PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, rispettivamente) e sono incapsulati in seguito all&#39;esposizione alla luce. (D) gel contenenti gruppi tiolici in eccesso durante la formazione del gel (qui, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, formata con 2 mm in eccesso tioli) possono essere modellati con segnali biochimici dalla successiva aggiunta di peptidi funzionalizzati con un singolo gruppo alloc (Pep1Alloc, ad esempio, RGDS, IKVAV, etc.) per promuovere l&#39;adesione delle celluleall&#39;interno di specifiche regioni del gel. Qui, viene mostrato patterning di gel con RGDS fluorescenza marcata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Figura 2:. Impostazione del test e risultati quantitativi di Ellman per valutare la modifica degli idrogel fantasia Gel (A) e gli standard di cisteina sono incubati in piastre a 48 pozzetti con il reagente di Ellman. Una curva standard lineare viene tracciata per determinare la concentrazione di cisteina nei campioni di gel. (B) tioli liberi in eccesso sono incorporati all&#39;interno di idrogel durante formazione di gel e consumati su patterning con un ciondolo alloc-peptide (I = 1 min polimerizzazione; II = 5 min polimerizzazione; III = 30 min di incubazione con Pep1Alloc; IV = 90 min di incubazione wi<html> esimo Pep1Alloc; sia III e IV polimerizzati e modellati con la luce per 1 min). I dati riportati illustrano la media (n = 3) con barre di errore che mostra l&#39;errore standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Figura 3:. Assay di Ellman e immagini fluorescenti di visualizzare idrogel photopatterned Reattivo (A) di Ellman può essere utilizzato per individuare rapidamente i modelli (linee) in X e Y-piani (giallo = regione non nanostrutturata, Barra di scala = 1 mm). (B) peptidi fluorescenti possono essere utilizzati per osservare i modelli nelle direzioni x, ye z-aerei (verde = regione fantasia; 200 bar scala micron; 10X obiettivo acqua-immersione; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Figura 4: La vitalità e l&#39;attività metabolica delle cellule all&#39;interno non degradabili idrogel photopatterned (A) Esempio confocale Z-stack (Z-proiezione; 10X obiettivo acqua-immersione) di vitali (verde; Ex / Em 488/525 nm) e morti hMSCs (rosso; Ex / Em 543/580 nm) incapsulato all&#39;interno di idrogel 24 ore post-incapsulamento (Scala bar = 200 micron). Le cellule sparse all&#39;interno di questi idrogel 6 giorni dopo l&#39;incapsulamento (immagine inserto, Scala bar = 50 micron). (B) Le cellule sono metabolicamente attivo 1 e 3 giorni (barre chiare e scure, rispettivamente) post-incapsulamento per i vari polimerizzazione (I = 1 min polimerizzazione; II = 5 min di polimerizzazione) e le condizioni di patterning (III = 30 min di incubazione con Pep1Alloc ; IV = 90 min incubation con Pep1Alloc; sia polimerizzati e modellato con la luce per 1 min). I dati riportati illustrano la media (n = 3) con barre di errore che mostra l&#39;errore standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tabella 1: configurazione di esempio per calcolare i volumi di soluzioni madre per fare idrogel cellule all&#39;interno del foglio di calcolo che sono evidenziati blu indicano parametri definiti dall&#39;utente;. le altre quantità sono calcolate sulla base di queste impostazioni. I volumi finali per ciascuna soluzione madre per fare un gel sono evidenziati arancione. I globuli bianchi contengono formule utilizzate per calcolare i volumi finali in base ai parametri definiti dall&#39;utente. Si noti che una concentrazione di 2,2 mM LAP è equivalente a 0,067% in peso.

Descriviamo un processo sequenziale per la formazione mediata dalla luce e il successivo patterning biochimico di matrici sintetiche di idrogel per applicazioni di coltura cellulare tridimensionale. Viene dimostrata la costruzione e la modifica di idrogel con la chimica fotoclick citocompatibile. Inoltre, vengono presentate tecniche semplici per quantificare e osservare i modelli e determinare la vitalità cellulare all'interno di questi idrogel.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

L'obiettivo generale di questa procedura è formare, modellare e incapsulare cellule all'interno di matrici extracellulari sintetiche a base di polimeri. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare domande biologiche fondamentali relative all'identificazione di segnali extracellulari che regolano le risposte cellulari all'interno di microambienti eterogenei. Il vantaggio principale di questa tecnica è che viene generata una matrice sintetica robusta per l'incapsulamento e la coltura cellulare, utilizzando protocolli e materiali facilmente accessibili.Questo metodo può essere utilizzato per la coltura cellulare controllata e per lo studio della risposta cellulare in vitro. Può essere applicato ad altri sistemi, inclusi il rilascio di farmaci e l'ingegneria dei tessuti. Preparare i materiali per la formazione dell'idrogel come descritto nel protocollo testuale.Collegare una lente collimatrice all'estremità della guida luminosa riempita di liquido per garantire un'intensità luminosa relativamente uniforme su tutti i campioni. Regolare la distanza della guida luminosa dai campioni per ottenere una dimensione del fascio che copra i campioni di interesse. Per preparare idrogeli non stampati, preparare idrogeli spessi modellati nelle estremità delle siringhe pipettando da 10 a 20 microlitri di soluzione precursora del gel nell'estremità di una siringa sterile tagliata.Preparare un singolo gel per siringa in modo che abbia uno spessore di circa 0,5-1,5 millimetri, in base al volume e al diametro della siringa. Preparare idrogeli sottili utilizzando stampi in vetrini di vetro posizionando la guarnizione di gomma lungo i bordi del vetrino non rivestito. Successivamente, pipettare da cinque a dieci microlitri della soluzione precursore del gel sul vetrino non rivestito.Posizionare il vetrino ricoperto di antiaderente sulla soluzione di gel. Fissare i vetrini con graffette piccole per stabilizzarli. Impostare l'intensità della lampada in modo da ottenere 10 milliwatt per centimetro quadrato sulla superficie del gel per gli stampi a punta di siringa o per gli stampi in vetrino.Utilizzare un radiometro per rilevare l'intensità. Posizionare gli stampi sotto la lampada. Applicare la luce per uno a cinque minuti per consentire la completa polimerizzazione dei gel.Utilizzare un tempo di polimerizzazione più breve per i gel con contenuto maggiore di tereftalato di polietilene glicole e un tempo più lungo per i gel con contenuto minore, al fine di produrre idrogel completamente polimerizzati con moduli compresi nell'intervallo dei tessuti molli. Posizionare i gel dagli stampi posti alla punta della siringa in una piastra sterile non trattata a 48 pozzetti e inserire i vetrini in una piastra sterile.Per preparare idrogeli strutturati, preparare la soluzione precursora come descritto nel protocollo testuale e pipettare vigorosamente la soluzione per assicurare un mescolamento omogeneo. Successivamente, ricoprire gli idrogeli preformati con peptido pentonico con una soluzione di iniziatore fotopolimerizzante al fosfato di litio e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione in eccesso.Se i gel vengono modellati sulla punta di una siringa, utilizzare una spatola per trasferirli con attenzione dalla piastra a 48 pozzetti a un vetrino sterile per la stampa. Posizionare una maschera fotografica con il modello desiderato direttamente sopra i gel modellati sulla siringa e sul vetrino. Assicurarsi che la parte stampata della maschera tocchi il gel per una fedeltà ottimale del modello.Posizionare i campioni sotto la lampada e irradiare per un minuto. Dopo il patterning, posizionare i gel modellati con siringa in una piastra sterile da 48 pozzetti non trattata per colture cellulari. Posizionare i gel modellati su vetrini, aderenti ai vetrini, in una piastra sterile.Sciacquare tre volte, per 15 minuti ciascuno, con mezzo colturale o con il tampone appropriato in base agli esperimenti previsti. Per eseguire la rilevazione e la quantificazione dei tioli liberi in idrogeli fotolitografati, preparare innanzitutto le soluzioni ed effettuare i calcoli come descritto nel protocollo testuale. Formare idrogeli sottili per la litografia come in precedenza.In particolare, preparare gel con eccesso di tioli liberi e stampare metà di questi campioni con il peptide penton utilizzando un coprioggetto trasparente per esporre completamente l'intero gel alla luce. Posizionare i gel stampati e non stampati in pozzetti di una piastra a 48 pozzetti. Lavare per 15 minuti, tre volte, con il buffer della reazione di Ellman, per consentire la diffusione delle specie reagite all'estremità fuori dal gel e il raggiungimento del rigonfiamento all'equilibrio.Aggiungere ulteriore tampone di reazione di Ellman ai gel di risciacquo, in modo che il volume del gel rigonfiato con il tampone di reazione sia un multiplo di 20 microlitri. Ad esempio, se il volume previsto del gel rigonfiato è di 15 microlitri, aggiungere cinque microlitri di tampone di reazione. Se invece il volume previsto del gel rigonfiato è di 30 microlitri, aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione.Trasferire con pipetta gli standard della cisteina in pozzetti separati di una piastra a 48 pozzetti in multipli di 20 microlitri. La quantità da utilizzare dipende dal volume impiegato nel passaggio precedente. Ad esempio, se nel passaggio precedente il volume del gel rigonfiato, più il tampone di reazione aggiuntivo, era pari a 40 microlitri, aggiungere 40 microlitri di ciascuno standard in pozzetti vuoti separati.Successivamente, diluire il reagente di Ellman e il buffer di reazione. Aggiungere il reagente di Ellman diluito alle pozzette contenenti gli standard e i campioni. Per campioni di 20 microlitri, aggiungere 183,6 microlitri di soluzione a ciascuna pozzetta.Incubare o posizionare su un agitatore per un'ora e trenta minuti, oppure fino a quando il colore della soluzione corrisponde a quello dei gel mediante ispezione visiva, per garantire una diffusione sufficiente del dianione giallo 2-Nitro-5-tiobenzoico, generato dalla reazione del reagente di Ellman con i tioli liberi provenienti dal gel. Prelevare 100 microlitri di soluzione dai campioni e dagli standard e trasferirli in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Leggere l'assorbanza a 405 nanometri mediante un lettore di piastre.Per visualizzare i modelli fotografici, rimuovere il tampone di reazione in eccesso asciugando delicatamente i bordi dell'idrogel con un fazzoletto di carta. Pipettare il reagente di Ellman direttamente sulla superficie del gel. Acquisire immediatamente l'immagine con un microscopio ottico a 10x o con un microscopio stereoscopico dotato di fotocamera a colori.Raccogliere le cellule e prepararle per l'incapsulamento come descritto nel protocollo testuale. Immediatamente dopo l'aspirazione del PBS, sospendere le cellule pelletizzate nella soluzione precursore fino a una concentrazione finale di cinquemila cellule per microlitro. Lasciare una concentrazione appropriata di tioli liberi per la successiva reazione con il peptide pentonico.Se si desidera un'incisione fotolitografica, creare il calco, polimerizzare e strutturare gli idrogeli come in precedenza. Sciacquare i gel per 10 minuti, per tre volte, in mezzo di coltura dopo la strutturazione, per rimuovere le specie non reagite e l'eccesso di iniziatore fotoreattivo a base di fosfato di litio.Incubare i gel nel mezzo di crescita a 37 gradi Celsius e al 5 percento di CO2 fino al tempo desiderato per ulteriori analisi. Rinnovare il mezzo ogni 48 ore, o secondo quanto determinato dalle applicazioni. Per determinare la vitalità delle cellule incapsulate, rimuovere innanzitutto il mezzo di crescita dai gel e risciacquare per 15 minuti, per tre volte, con PBS per consentire la diffusione del mezzo dai gel.Aggiungere due microlitri della soluzione scongelata di etidio omodimero-1 a due millimolari e 0,5 microlitri della soluzione scongelata di calcio AN a quattro millimolari, in un millilitro di PBS sterile. Eseguire il vortex per assicurare un mescolamento completo. Aggiungere 300 microlitri di soluzione a ogni gel nel modello di siringa nelle piastre a 48 pozzetti, oppure una quantità sufficiente a coprire la superficie del gel su un vetrino in una piastra sterile.E incubare per 45 minuti. Rimuovere la soluzione in eccesso e risciacquare per eliminare il colorante in eccesso dai gel. Acquisire le immagini delle cellule mediante microscopio confocale.O su un microscopio ad epifluorescenza con capacità a 10x e con eccitazione a 488 nanometri e emissione a 525 nanometri. La concentrazione di tioli liberi negli idrogeli non stampati e stampati, quantificata con il metodo di Ellman, ha dimostrato che gli idrogeli polimerizzati inizialmente per un minuto e per cinque minuti presentano concentrazioni di tioli liberi statisticamente simili, indicando una reazione rapida e una completa gelificazione entro un minuto.La successiva modifica in massa dei gel incubati con peptidi pentonici per 30 minuti, e per un'ora e 30 minuti, determina una riduzione del 60-80% della concentrazione di tioli liberi, indicando una modificazione efficiente del tiolo in eccesso. I modelli ottenuti mediante esposizione alla luce di campioni coperti con maschere, qui stampate con linee, possono essere osservati in due dimensioni mediante l'applicazione del reagente di Ellman. Oppure, in tre dimensioni, incorporando peptidi fluorescenti nell'analisi successiva. Cellule staminali umane adulte inglobate in idrogeli sono state trattate con coloranti per la vitalità e la idrotossicità. E sono state analizzate mediante microscopia confocale. Le cellule vitali prive di danni alla membrana sono etichettate in verde e indicano la sopravvivenza delle cellule un giorno dopo l'inglobamento.Le cellule iniziano a espandersi all'interno della matrice sei giorni dopo l'incapsulamento. Come mostrato nell'immagine ingrandita. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere procedure di manipolazione sterili e accurate per prevenire danni alle cellule dopo l'incapsulamento, causati dall'introduzione di contaminanti o da sollecitazioni meccaniche di taglio.Una volta seguita questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria a flusso con immunomarcatura e l'analisi dell'espressione genica per studiare la funzione e il destino cellulare in risposta all'ambiente extracellulare. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nei settori della biologia, dell'ingegneria biomedica e della medicina per lo studio dell'erosione di regioni tissutali o della progressione delle malattie in matrici extracellulari sintetiche con controllo delle proprietà definito dall'utente, al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come incapsulare le cellule e modellare matrici morbide per studi di coltura cellulare controllata.

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