Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare efficacemente soluzioni nel citoplasma degli zigoti del bestiame utilizzando un ago smussato con l'aiuto di un laser. Questo metodo viene utilizzato nella ricerca e nel campo della transgenesi animale, poiché è associato a uno strumento di editing del genoma, come un sistema CRISPR Cas9, può creare nuove vacche per studiare la funzione genica e gli animali transgenici in modo molto semplice e affidabile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per somministrare qualsiasi soluzione in un citoplasma di zigoti di grandi animali.

Con l'efficienza dell'iniezione di una persona a portata di mano, riduce al minimo i tassi di lomotil del fegato animale. Innanzitutto, preparare la micropipetta per iniezione inserendo un capillare in vetro borosilicato in un estrattore per micropipette e bloccandolo in posizione. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare in modo da ottenere una punta sottile con una lunga conicità.

Quindi, rimuovere con cautela le pipette estratte dal dispositivo e posizionarle su una microforgia in posizione orizzontale. Metti a fuoco la pipetta estratta e il filamento del riscaldatore per microforgiatura, con la sua perla di vetro. Utilizzare il reticolo dell'oculare per misurare lo spessore desiderato e spostare la pipetta orizzontalmente fino a quando il filamento del riscaldatore raggiunge il diametro interno target di cinque micrometri.

Regolare il calore a circa il 45% e abbassare delicatamente la pipetta in modo che tocchi il filamento. Quindi, attivare brevemente il riscaldatore. Questo scioglierà leggermente la pipetta in modo che aderisca al filamento e, dopo il raffreddamento, la pipetta si romperà nel punto di contatto, generando un taglio dritto.

L'impostazione della giusta temperatura è fondamentale in questo passaggio. Temperature troppo alte piegheranno la pipetta, mentre temperature troppo basse non saranno sufficienti per tagliare la pipetta. Quindi, tracciare un angolo di circa 30 gradi vicino alla punta della pipetta posizionando la punta a circa 10 micrometri di distanza dal filamento del riscaldatore.

Impostare la temperatura al 60% e attivare il riscaldatore in modo che la pipetta si pieghi sul filamento all'angolazione desiderata. Utilizzando le impostazioni mostrate qui, estrarre un capillare di vetro in modo da ottenere una micropipetta con una punta sottile con una conicità lunga e uniforme e pareti parallele. Rimuovere con cautela la pipetta estratta dal dispositivo di estrazione e posizionarla sul supporto della microforgia in posizione orizzontale.

Utilizzare il reticolo dell'oculare per misurare il diametro della pipetta e spostare la pipetta fino a quando il suo diametro sul filamento raggiunge i 180 micrometri. Segnare il capillare del vetro con una penna a punta di diamante e quindi premere delicatamente sulla punta tirata per rompere il vetro. Questo dovrebbe risultare in un taglio dritto.

Quindi, spostare la pipetta in posizione verticale, con la punta vicino al filamento. Impostare la temperatura della microforgia al 60% e lucidare a fuoco la punta della pipetta, utilizzando tecniche standard fino a quando il diametro interno non raggiunge la dimensione desiderata. Misurare il diametro interno della pipetta, che dovrebbe essere di 40 micrometri.

Utilizzando la stessa procedura di prima, piegare la punta a un angolo di 30 gradi. Inserire la pipetta di supporto nel supporto sinistro del micromanipolatore e la pipetta di iniezione nel supporto destro della micromanipolazione. Quindi, riempire la pipetta per iniezione con olio.

Utilizzare i controlli del micromanipolatore per portare le pipette al centro del campo visivo del microscopio. Utilizzando l'ingrandimento 4X, verificare che i puntali della micropipetta siano all'angolazione corretta in modo che siano paralleli al fondo della piastra. Posizionare una goccia da 50 microlitri di soluzione SOF-HEPES a 37 gradi Celsius, integrata con il 20% di FBS, al centro del coperchio di una capsula di Petri da 100 millimetri.

Quindi, posizionare una goccia da uno a due microlitri della soluzione da iniettare vicino alla goccia di iniezione. Successivamente, coprire le gocce e la piastra di iniezione utilizzando circa 10 millilitri di olio minerale. Posizionare la piastra sul tavolino del microscopio e utilizzare un microdispenser per caricare circa 20-30 zigoti nella parte superiore della goccia di iniezione.

Utilizzando l'obiettivo 4X, caricare la soluzione da iniettare nella pipetta di iniezione applicando una pressione negativa al microiniettore. Caricare una quantità sufficiente di soluzione per iniettare due o tre zigoti e poi passare alla goccia di iniezione. All'interno della goccia per iniezione, spostare la pipetta di supporto in modo che la punta si avvicini a uno zigote.

Applicare una pressione negativa con il microiniettore di tenuta in modo che lo zigote si fissi alla pipetta di mantenimento. Una volta che lo zigote è sicuro, passa a un obiettivo 20X. Verificare che la pipetta per iniezione sia posizionata sul piano medio dell'embrione toccando delicatamente lo zigote sul sito di iniezione.

Se non si trova sul suo piano medio, l'ago tenderà a far ruotare l'embrione, invece di pungere. Successivamente, utilizzare il software per posizionare il laser in verticale nella zona pellucida in cui verrà praticato il foro. Una volta posizionato correttamente, utilizzare la finestra di controllo laser e fare clic sul pulsante FIRE.

Assicurarsi che la dimensione del foro sia sufficientemente grande da creare un'apertura nella zona pellucida per il passaggio dell'ago senza danneggiare la membrana plasmatica. Far passare l'ago per iniezione attraverso il foro nella zona pellucida e fare contatto con la membrana plasmatica. Continuare a spingere la pipetta in avanti fino a quando l'ago non si trova a 3/4 dell'interno dell'embrione.

Osservare la posizione del menisco all'interfase dell'olio in soluzione. Questo verrà utilizzato per controllare costantemente il volume di iniezione. Applicare una pressione negativa sulla pipetta per iniezione per aspirare la membrana plasmatica e il citoplasma nell'ago per iniezione.

Continuare fino ad quando il movimento del citoplasma nell'ago accelera o quando si può vedere il contenuto del citoplasma, che si mescola con la soluzione iniettabile. Questi indicheranno la rottura della membrana plasmatica. Reiniettare il contenuto citoplasmatico, seguito dalla soluzione nel citoplasma dello zigote, applicando una pressione positiva fino a quando il menisco all'interfase dell'olio della soluzione non ha avanzato un diametro equivalente di uno zigote oltre il punto di partenza.

Quindi, passa a un obiettivo 4X e sposta l'embrione iniettato sul lato inferiore della goccia di iniezione. Rilasciare l'embrione applicando una pressione positiva sul microiniettore di tenuta. Raccogli gli embrioni iniettati utilizzando un micro-dosatore.

Lavare gli embrioni iniettati facendoli passare attraverso le tre gocce di SOF-HEPES e coltivarli, come descritto nel protocollo di testo allegato. Il successo della somministrazione della soluzione è visibile nell'immagine fluorescente, dove il rosso dexion viene utilizzato per tracciare il sito di iniezione e l'efficienza e la precisione dell'iniezione. Qui, il colorante è distribuito in modo omogeneo nel citoplasma, il che è tipico quando si utilizza questa tecnica.

Questo protocollo ha tassi di lisi minimi negli zigoti bovini e ovini. Pochi degli embrioni iniettati sono stati lisati in bovini o ovini a seguito di microiniezione. Inoltre, non ci sono differenze statisticamente significative nei tassi di sviluppo della blastocisti nei gruppi di controllo rispetto a quelli iniettati sia per gli embrioni bovini che per quelli ovini.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita al ritmo di due embrioni al minuto. Con un'efficienza di iniezione pratica da parte di una persona, riduce al minimo i tassi di blastocisti animale. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come eseguire la microiniezione intracitoplasmatica laser-assistita negli zigoti del bestiame.

E anche come utilizzare la pressione di aspirazione positiva e negativa per garantire la rottura della membrana plasmatica per un'erogazione efficiente.