Name: Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Impara la microiniezione citoplasmatica assistita da laser negli zigoti di bestiame per la biotecnologia animale. Questa tecnica consente la consegna precisa di strumenti di editing genomico come CRISPR Cas9 per creare animali transgenici in modo affidabile.

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Il lavoro relativo a questa tecnica è supportato dai progetti NIH/NICHD RO1 HD070044 e USDA/NIFA Hatch W-3171 e W-2112.

1. Micropipetta Produzione <ol><li> micropipetta iniezione <ol><li> Posizionare un capillare di vetro borosilicato (diametro esterno (OD): 1,0 mm, diametro interno (ID): 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo. </li><li> Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga tapper. (Esempio: Heat: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tempo: 200; Pressione: 500). </li><li> Rimuovere con cura le pipette tirato dal dispositivo e posizionarlo su una microforge in posizione orizzontale. </li><li> Portare la pipetta tirato e il riscaldamento del filamento microforge con la sua perla di vetro a fuoco. Utilizzare il reticolo oculare per misurare lo spessore desiderato e spostare la pipetta orizzontale fino filamento riscaldatore raggiunge il diametro interno di destinazione (5 micron). </li><li> Regolare il calore a circa il 45% e delicatamente portare la pipetta verso il basso in modo che tocchi il filamento. Attivare brevemente il riscaldamento. Questo will leggermente fondere la pipetta in modo da aderire al filamento e per raffreddamento, la pipetta si romperà nel punto di contatto generando un taglio dritto. Nota: L&#39;impostazione della temperatura appropriata è fondamentale in questa fase dal momento che le temperature troppo alte renderanno la curva pipetta e quindi un taglio dritto, non sarà possibile e le temperature troppo basse non saranno sufficienti a fondere la pipetta (Figura 1A). </li><li> Fare un approssimativo di 30 ° angolo vicino alla punta della pipetta posizionandola a circa 10 micron di distanza dal filamento di riscaldamento. Impostare la temperatura a 60% ed attivare il riscaldamento. Nota: Questo piegare la pipetta sul filamento. Questo angolo è desiderato in modo che la punta dell&#39;ago è parallelo alla superficie della piastra di iniezione quando montato nell&#39;iniettore (Figura 1B). </li><li> Maneggiare pipette microiniezione con cautela in quanto sono estremamente nitide e fragile. </li></ol></li><li> tenendo micropipetta <ol><li> Posizionare un borosilicate capillare di vetro (OD: 1,0 mm ID: 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo. </li><li> Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga anche cono e pareti parallele (Esempio: Heat: 815; Pull: 20; Velocity: 140; Tempo: 175; Pressione: 200). </li><li> Rimuovere con cautela la pipetta tirato dal dispositivo estrattore e posizionarlo sul supporto microforge in posizione orizzontale. Regolare il fuoco sul filamento riscaldatore e pipetta. </li><li> Utilizzare il reticolo oculare per misurare il diametro pipetta e spostare la pipetta fino al suo diametro sopra il filamento raggiunge 180 micron. </li><li> Alla dimensione indicata, segnare il capillare di vetro con una penna punta di diamante, e quindi premere delicatamente sulla punta tirato a rompere il vetro. Questo dovrebbe portare a un taglio dritto (Figura 1C). </li><li> Spostare la pipetta in posizione verticale con la punta vicino al filamento. Impostare la temperatura<html> del microforge al 60%. </li><li> Fuoco smalto la punta della pipetta utilizzando tecniche standard 7 fino a raggiungere un ID di 40 micron. Utilizzare il reticolo oculare per controllare l&#39;ID (Figura 1D). </li><li> Realizzare un angolo la pipetta. <ol><li> Portare la pipetta torna in posizione orizzontale a circa 10 micron di distanza dal filamento e lontano dalla punta 5 mm. Impostare la temperatura a circa il 60% ed attivare il riscaldamento di piegare la pipetta sul filamento. Continuare riscaldamento fino a raggiungere un angolo desiderato (di circa 30 °). Controllare l&#39;angolo visivo (Figura 1E). Nota: La pipetta è di solito montato al microinjector ad un angolo approssimativo di 60 o rispetto al fondo del piatto iniezione. La punta della pipetta è piegata in modo che sia parallelo al fondo del piatto, che è necessaria per la corretta iniezione dell&#39;embrione al suo piano medio. </li></ol></li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 2. Impostazione Micromanipolatore <ol><li> Controllare che le microiniettori sono a pieno carico con olio e che non ci siano bolle d&#39;aria nel sistema (bolle nel microinjector impediscono un controllo preciso di iniezione). </li><li> Controllare che i micromanipolatori sono nella posizione centrale. Ciò consentirà per una vasta gamma di movimento delle pipette. </li><li> Inserire la pipetta tenendo nel supporto micromanipolatore sinistra e la pipetta di iniezione nel supporto micromanipolazione giusta. </li><li> Lasciare che l&#39;olio di entrare nelle pipette per capillarità e verificare che il sistema funzioni correttamente spostando olio su e giù dentro la pipetta utilizzando i controlli microinjector. Nota: se non c&#39;è movimento di olio all&#39;interno degli aghi, ci potrebbe essere uno zoccolo. In questo caso, utilizzare un ago nuovo. </li><li> Utilizzare i controlli micromanipolatore per portare le pipette nel centro del campo del microscopio di vista. Utilizzando 4X ingrandimento, controllare che le punte micropipetta sono nella corretta angolazione (parallel al fondo del piatto). Nota: Una corretta impostazione degli aghi è la chiave per una iniezione di successo e per i risultati coerenza. </li><li> Calibrare il sistema laser seguente manuale di taratura del produttore. </li></ol> 3. Preparazione del piatto iniezione (figura 2) <ol><li> Mettere una goccia 50 ml di riscaldato (37 ° C) SOF-HEPES (composizione descritto nella sezione materiali) supplementato con siero fetale bovino 20% (FBS) sul centro del coperchio di una piastra di Petri di 100 mm. Inserire un 1 - 2 goccia microlitri della soluzione da iniettare vicino alla goccia iniezione. Assicurarsi che gli embrioni non raffreddare sotto RT. Nota: In questo protocollo aggiungeremo il colorante Destrano-Red per la soluzione parenterale per essere in grado di visualizzare il sito di iniezione e tenere traccia in un secondo momento. </li><li> Coprire le gocce nella piastra iniezione utilizzando circa 10 ml di olio minerale. </li><li> Porre la capsula di iniezione sul palco del microscopio invertito e portare il pipEttes nella goccia iniezione. Verificare che gli aghi sono a fuoco all&#39;interno della goccia. Regolare la loro altezza in base alle esigenze utilizzando i controlli micromanipolatore. </li><li> Utilizzando un microdispenser, caricare circa 20 - 30 zigoti (17 - 20 hr post-fecondazione (HPF)) nella parte superiore della goccia iniezione. Eseguire iniezione a temperatura ambiente in modo che il numero di embrioni nella goccia iniezione è determinata dalla velocità con cui la persona può iniettare. Non caricare più embrioni di quelli che possono essere iniettati in 30 min. <ol><li> Per caricare gli embrioni nel microdispenser, premere lo stantuffo completamente ed immergere la punta nella soluzione contenente gli embrioni. Toccare gli embrioni che vengono raccolti con la punta del capillare di vetro (uno alla volta) e rilasciano lentamente il pistone così ogni embrione entra nel capillare. Ripetere questa operazione fino a quando tutti gli embrioni vengono prelevati o la capacità microdispenser è piena. </li><li> Per rilasciare gli embrioni caricati, premere delicatamente lo stantuffo fino a quando l&#39;intero volume di containing gli embrioni viene rilasciato dal capillare. </li></ol></li></ol> 4. microiniezione <ol><li> Utilizzando l&#39;obiettivo 4X, caricare la soluzione da iniettare nella pipetta di iniezione applicando pressione negativa (aspirazione). Caricare soluzione sufficiente per iniettare 2 - 3 zigoti. Quindi spostare la goccia iniezione. </li><li> All&#39;interno della goccia iniezione, spostare la pipetta tenendo così la punta si avvicina a uno zigote. Applicare una pressione negativa (aspirazione) con la partecipazione microinjector così lo zigote viene fissata alla pipetta detenzione e la modifica a un obiettivo 20X. </li><li> Una volta che lo zigote è attaccato alla pipetta holding, controllarne la qualità utilizzando la pipetta iniettando per spostare delicatamente l&#39;embrione in giro senza staccarla. Un zigote buona qualità dovrebbe avere i due corpi polari (anche se a volte è visto solo uno) e un citoplasma omogeneo. Non iniettare zigoti anormali (Figura 3a). </li><li> Se necessario, riposizionare l&#39;embrione di iniezione correttoluogo. Un buon posizionamento sarebbe quella in cui vi è uno spazio tra la ZP e PM, in modo che il PM non danneggiare dal laser. </li><li> Verificare che la pipetta di iniezione è posizionato sul piano medio dell&#39;embrione sfiorando zigote sul sito di iniezione. Se non è sul suo piano di mezzeria, l&#39;ago tenderà a rendere l&#39;embrione ruotare invece di foratura. Regolare l&#39;altezza della pipetta di iniezione come necessario. </li><li> Fare un buco nella ZP utilizzando un laser (Figura 3B). <ol><li> Utilizzando posto software del laser del reticolo laser nel ZP cui verrà effettuato il foro (sul lato opposto a dove l&#39;embrione è attaccato alla pipetta tenuta). Utilizzando la finestra di controllo del laser, fare clic sul pulsante di fuoco. Assicurarsi che la dimensione del foro è grande abbastanza per creare un&#39;apertura nella ZP per l&#39;ago di passare attraverso senza danneggiare il PM (Esempio: 0,662 ampiezza impulso msec / 6,9 micron Formato del foro). </li></ol></li><li> Passare l&#39;ago per l&#39;iniezioneattraverso il foro nella ZP e prendere contatto con il PM. Continuare a spingere la pipetta in avanti fino a quando l&#39;ago è ¾ del modo in l&#39;embrione (Figura 3C). </li><li> Osservare la posizione del menisco all&#39;interfase soluzione di olio, in modo da essere usato per controllare costantemente volume di iniezione. </li><li> Applicare pressione negativa (aspirazione) sulla pipetta di iniezione, che si tradurrà in PM e citoplasma essere inspirate l&#39;ago di iniezione. Continuare finché il movimento di citoplasma all&#39;interno dell&#39;ago accelera o quando il contenuto citoplasma mescolando con la soluzione iniettabile può essere visto. Questi indicheranno rottura del PM (Figura 3D). </li><li> Iniettare nuovamente il contenuto citoplasmatico seguita dalla soluzione nel citoplasma dello zigote applicando pressione positiva (iniezione), finché il menisco all&#39;interfase soluzione-olio ha avanzato diametro equivalente di uno zigote oltre il punto di partenza. Nota: Nelle nostre condizioni, questo rappresenta circa 7 pl di soluzione iniettata (Figura 3E). </li><li> Passare un obiettivo 4X e spostare l&#39;embrione / s iniettato al lato inferiore della goccia iniezione. Rilasciare l&#39;embrione mediante l&#39;applicazione di una pressione positiva sul microinjector azienda. Mantenere gli embrioni non iniettati sul lato superiore e quelli iniettati sul lato inferiore della goccia per tenere traccia degli embrioni iniettati / non-iniettato e lavorare in modo efficiente. </li></ol> 5. Embrione di recupero e iniezione Risultati <ol><li> Fare 3 gocce di circa 200 ml in un nuovo piatto con pre-riscaldato SOF-HEPES. Raccogliere gli embrioni iniettati usando una microdispenser (come descritto sopra). Lavare gli embrioni iniettati spostandoli attraverso il 3 SOF-HEPES gocce. </li><li> Contare gli embrioni lisati durante la microiniezione e gettarli. Nota: Un zigote lisato può essere facilmente distinguibili da un uno intatto dal momento che il primo appare traslucido, compilare l&#39;intero ZP, e ha di solito citoplasmaticacontenuti fuoriuscita all&#39;esterno dell&#39;embrione. </li><li> Facoltativamente, verificare l&#39;efficienza microiniezione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Essere consapevoli del fatto che l&#39;esposizione ai raggi UV può indurre danni embrione che può influenzare il successivo sviluppo. </li><li> Gruppi Cultura di 25 embrioni iniettati in 50 gocce microlitri di media ottimizzazione simplex di potassio (KSOM) integrato con 4 mg / ml albumina sierica bovina (BSA) sotto olio minerale a 38,5 ° C, 5% di CO 2 in aria, umidità e alla saturazione. </li><li> Integrare il terreno di coltura con il 5% di FBS due giorni dopo l&#39;iniezione. </li><li> Controllare blastocisti (BL) i tassi di 7 giorni dopo l&#39;iniezione. Calcola BL tariffe come numero totale di embrioni blastocisti / numero totale di embrioni coltivati ​​in quella goccia. </li></ol>

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<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
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<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
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<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Microiniezione di zigoti è un metodo consolidato per l&#39;introduzione di soluzioni in embrioni di mammiferi. Con alcune variazioni dipendenti dalla specie e l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento, questa tecnica può essere utilizzata largamente. Mostriamo come eseguire microiniezione intracitoplasmatica utilizzando un laser per assistere all&#39;ingresso di una micropipetta smussato-end. Zigoti di alcune specie di bestiame (come bovini, ovini, suini e) hanno un citoplasma scuro, ostacolando la visualizzazione della pipe...

microiniezione citoplasmatica di embrioni di 1-Cell è una tecnica molto potente. Può essere usato per erogare qualsiasi soluzione nell&#39;embrione, per esempio, producono gene knock-out per studiare la funzione del gene o per generare animali geni modificati. La maggior parte agricolo-zigoti rilevanti animali da allevamento hanno una composizione molto alto acido grasso che rende il loro citoplasma opachi e scuri 1. Hanno anche una membrana plasmatica mediamente elastiche (PM). Queste caratteristiche rendono la microiniezione utilizzando convenzionale pronuclear iniezione / citoplasmatica usati in specie di roditori impegnative e spesso imprecisi. Microiniezione citoplasmatica ha dei vantaggi rispetto microiniezione pronuclear poiché è più facile da eseguire e provoca anche meno danni agli embrioni iniettati, con conseguente maggiore vitalità 2. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare un metodo di successo per fornire soluzioni nel citoplasma degli zigoti animali da allevamento. Per poter eseguiremicroiniezione citoplasmatica con alta efficienza sugli embrioni bestiame, un laser viene utilizzato per generare un foro nella zona pellucida (ZP) e poi un ago di vetro smussato-end viene utilizzato per la microiniezione. Questa strategia mira a ridurre il danno meccanico impresso l&#39;embrione durante l&#39;iniezione. Poi, l&#39;aspirazione del contenuto citoplasmatica dentro l&#39;ago dell&#39;iniezione permette la rottura efficiente e sicuro del PM garantire che la soluzione è consegnato nel citoplasma dell&#39;embrione. Questa tecnica è già stata utilizzata con successo in embrioni di bovini per fornire siRNA nel citoplasma zygotic 3,4 e generare mutazioni utilizzando i cluster si ripete regolarmente intervallati brevi palindromi (CRISPR) / CRISPR associato sistema 9 Sistema 5 (Cas9). E &#39;anche adatto (con piccole modifiche) per iniettare bovini ovociti cumulo-racchiuso 6. Qui, descriviamo il nostro protocollo di iniezione fornire un colorante, che può essere applicabile a qualsiasi iniezione dessoluzione ired nel zigote, e mostrano che l&#39;utilizzo di questa tecnica provoca la lisi minima e non influenza lo sviluppo embrionale precoce.

<table><tbody><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>Strumenti Sutter</td><td>B100-75-10</td><td>Questi capillari vengono utilizzati per la tenuta e l'iniezione delle pipette. È possibile utilizzare qualsiasi tubo in borosilicato a parete spessa/standard senza filamento.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Dotato di lente con ingrandimento 10X.</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Dotato di lenti 4X, 20X e di un sistema laser.</td></tr><tr><td>Strumenti di</td><td>ricerca</td> laser <td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Laser attivo.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>Il microdispenser viene utilizzato per spostare gli embrioni. È possibile utilizzare anche una pipetta p10, ma caricando il minor volume possibile.</td></tr><tr><td>Piatto di coltura 100 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Utilizzare il coperchio della piastra per realizzare la piastra di iniezione, poiché hanno pareti più basse e facilitano il posizionamento e lo spostamento del micromanipolatore. È possibile utilizzare anche il coperchio di una piastra di coltura da 60 mm.</td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Questi piatti sono utilizzati per la coltura degli embrioni in 50 &mu; l. gocce ricoperte di olio minerale. In alternativa, si può utilizzare anche una parabola a 4 pozzetti. Indipendentemente dalla piastra scelta per la coltura degli embrioni, questi devono sempre essere bilanciati nell'incubatrice per almeno 4 ore prima di trasferire gli embrioni.</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Qualsiasi incubatrice che può essere impostata su 38,5 gradi C, 5% CO2 condizioni.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Utilizzato per visualizzare gli embrioni nelle gocce di coltura e durante i lavaggi. È possibile utilizzare qualsiasi stereomicroscopio con un ingrandimento 10X.</td></tr><tr><td>Unità di controllo HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Sistema di riscaldamento collegato allo stereomicroscopio.</td></tr><tr><td>Tavolino per microscopio riscaldato</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Sistema di riscaldamento collegato allo stereomicroscopio.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>Per l'iniezione viene utilizzata una soluzione sterile da 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>Olio Minerale</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Conservare l'olio minerale a temperatura ambiente e al riparo dalla luce con carta stagnola.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Integrato con 4 mg/ml di BSA. Le piastre KSOM per la coltura di embrioni devono essere bilanciate in un'incubatrice per almeno 4 ore prima dell'uso.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Utilizzare un FBS qualificato per cellule staminali.</td></tr><tr><td>Zigoti</td><td></td><td></td><td>Gli zigoti vengono iniettati 17 - 20 hpf e possono essere derivati in-vitro- o in-vivo.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Concentrazione finale: 107,7 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Concentrazione finale: 7,16 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Concentrazione finale: 1,19 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Concentrazione finale: 0,49 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Sodio DL-lattato</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Concentrazione finale: 5,3 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Concentrazione finale: 1,71 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>D-(&meno;)-Fruttosio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Concentrazione finale: 0,5 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Concentrazione finale: 21 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Concentrazione finale: 1x. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Concentrazione finale: 1x. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Concentrazione finale: 4 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Concentrazione finale: 0,33 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Concentrazione finale: 1 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Concentrazione finale: 1 mg/ml. Componente del terreno SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Concentrazione finale: 5 &mu; g/ml. Componente del mezzo SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Acqua per il trasferimento di embrioni</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Componente del terreno SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Terreno SOF-HEPES</td><td>Prodotto in laboratorio</td><td></td><td>pH 7,3 - 7,4, 280 & 10 mOs. Filtro sterilizzato attraverso un 22 &mu; m filtro può essere conservato in frigorifero a 4 gradi C per 1 mese. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr></tbody></table>

laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

La microiniezione citoplasmatica in embrioni unicellulari è una tecnica molto potente. Ad esempio, consente la fornitura di strumenti di editing del genoma in grado di creare modifiche genetiche che saranno presenti in ogni cellula di un organismo adulto. Può anche essere utilizzato per fornire siRNA, mRNA o anticorpi bloccanti per studiare la funzione genica negli embrioni preimpianto. La tecnica convenzionale per la microiniezione di embrioni utilizzata nei roditori consiste in una micropipetta molto sottile che penetra direttamente nella membrana plasmatica quando viene avanzata nell'embrione. Quando questa tecnica viene applicata agli animali da reddito, di solito si traduce in una bassa efficienza. Ciò è dovuto principalmente al fatto che, a differenza dei topi e dei ratti, gli zigoti bovini, ovini e suini hanno un citoplasma molto scuro e una membrana plasmatica altamente elastica che rende difficile ottenere la visualizzazione durante l'iniezione e la penetrazione della membrana plasmatica. In questo protocollo, descriviamo un metodo di microiniezione adatto per la somministrazione di soluzioni nel citoplasma di zigoti bovini che si è dimostrato efficace anche per gli embrioni di ovini e suini. Innanzitutto, viene utilizzato un laser per creare un foro nella zona pellucida. Quindi una micropipetta di vetro smussata viene introdotta attraverso il foro e fatta avanzare fino a quando la punta dell'ago raggiunge circa 3/4 nell'embrione. Quindi, la membrana plasmatica viene rotta mediante aspirazione del contenuto citoplasmatico all'interno dell'ago. Infine, il contenuto citoplasmatico aspirato seguito dalla soluzione di interesse viene iniettato nuovamente nel citoplasma embrionale. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per la somministrazione di diverse soluzioni in zigoti bovini e ovini con un'efficienza del 100%, una lisi minima e tassi di sviluppo di blastocisti normali.

Laser-assistita microiniezione citoplasmatica è un protocollo potente e affidabile per fornire soluzioni nel citoplasma di zigoti bestiame. La figura 3 mostra uno schema generale dei zigoti prima e dopo l&#39;iniezione e la sagoma complessiva della tecnica. Destrano-rosso viene usato come iniettare soluzione per consentire il monitoraggio sito di iniezione e iniezione efficienza e precisione. Il raggiungimento della soluzione è illustrata nella figura 4 ...

Questo protocollo mostra come eseguire la microiniezione citoplasmatica negli zigoti degli animali da allevamento. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire qualsiasi soluzione nell'embrione unicellulare, come gli strumenti di editing del genoma per generare animali knockout.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consegnare efficacemente soluzioni nel citoplasma dei zigoti del bestiame utilizzando un ago a estremità smussata con l'aiuto di un laser. Questo metodo viene impiegato nella ricerca e nel campo della transgenesi animale; poiché può essere associato a uno strumento di editing genomico, come un sistema CRISPR-Cas9, consente di generare nuovi bovini per lo studio della funzione genica e animali transgenici in modo semplice e affidabile. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata per consegnare qualsiasi soluzione nel citoplasma degli zigoti di animali di grandi dimensioni.Con un'iniezione effettuata da una persona esperta, si riducono al minimo i tassi di lomotil nel fegato degli animali. Preparare innanzitutto la micropipetta per iniezione inserendo una capillare in vetro borosilicato in un tiratore di micropipette e bloccandolo in posizione. Utilizzare un programma appropriato per tirare la capillare in modo da ottenere una punta sottile con un lungo cono.Quindi, rimuovere con attenzione le pipette tirate dal dispositivo e posizionarle su un microforgiatore in posizione orizzontale. Mettere a fuoco la pipetta tirata e il filamento riscaldante del microforgiatore, insieme alla sua perla di vetro. Utilizzare il reticolo dell'oculare per misurare lo spessore desiderato e spostare orizzontalmente la pipetta finché il filamento riscaldante non raggiunge il diametro interno target di cinque micrometri.Regolare il calore al circa 45% e abbassare delicatamente la pipetta in modo che tocchi il filamento. Quindi, attivare brevemente il riscaldatore. Questo farà sciogliere leggermente la pipetta, consentendole di aderire al filamento; al raffreddamento, la pipetta si spezzerà nel punto di contatto, producendo un taglio dritto.Impostare la temperatura corretta è fondamentale in questo passaggio. Temperature troppo elevate deformano la pipetta, mentre temperature troppo basse non sono sufficienti per tagliare la pipetta. Successivamente, formare un angolo di circa 30 gradi vicino alla punta della pipetta posizionando la punta a circa 10 micrometri di distanza dal filamento riscaldante.Impostare la temperatura al 60% e attivare il riscaldatore in modo che la pipetta si pieghi sul filamento fino all'angolo desiderato. Utilizzando le impostazioni mostrate qui, tirare una capillare di vetro in modo da ottenere una micropipetta con una punta sottile, un restringimento lungo e uniforme e pareti parallele. Rimuovere con attenzione la pipetta tirata dal dispositivo di trazione e posizionarla sul supporto del microforziere in posizione orizzontale.Utilizzare il reticolo dell'oculare per misurare il diametro della pipetta e spostare la pipetta finché il suo diametro sopra il filamento non raggiunge 180 micrometri. Contrassegnare la capillare di vetro con una penna a punta di diamante e quindi premere delicatamente sull'estremità tirata per rompere il vetro. Questo dovrebbe produrre un taglio dritto.Successivamente, posizionare la pipetta in posizione verticale, con la punta vicina al filamento. Impostare la temperatura del microforgiatore al 60% e lucidare la punta della pipetta mediante fusione controllata, utilizzando tecniche standard, fino a quando il diametro interno raggiunge la dimensione desiderata. Misurare il diametro interno della pipetta, che dovrebbe essere di 40 micrometri.Utilizzando la stessa procedura descritta in precedenza, piegare la punta ad un angolo di 30 gradi. Inserire la pipetta di ritenzione nel supporto del micromanipolatore sinistro e la pipetta di iniezione nel supporto del micromanipolatore destro. Successivamente, riempire la pipetta di iniezione con olio.Utilizzare i comandi del micromanipolatore per posizionare le pipette al centro del campo visivo del microscopio. Utilizzando un ingrandimento 4X, verificare che le estremità delle micropipette siano all'angolo corretto in modo da risultare parallele al fondo della piastra. Posizionare una goccia di 50 microlitri di soluzione SOF-HEPES a 37 gradi Celsius, integrata con FBS al 20%, al centro del coperchio di una piastra di Petri da 100 millimetri.Quindi, posizionare una goccia di uno o due microlitri della soluzione da iniettare vicino alla goccia di iniezione. Successivamente, coprire le gocce e la piastra di iniezione con circa 10 millilitri di olio minerale. Posizionare la piastra sul palco del microscopio e utilizzare un microdispensatore per caricare circa 20-30 zigoti nel lato superiore della goccia di iniezione.Utilizzando l'obiettivo 4X, caricare la soluzione da iniettare nella pipetta di iniezione applicando una pressione negativa al microinjectore. Caricare una quantità sufficiente di soluzione per iniettare da due a tre zigoti, quindi spostarsi sulla goccia di iniezione. All'interno della goccia di iniezione, muovere la pipetta di ritenzione in modo che la punta si avvicini a uno zigote.Applicare una pressione negativa con la micropipetta di ritenzione in modo che lo zigote si fissi alla pipetta di ritenzione. Una volta che lo zigote è ben posizionato, passare a un obiettivo 20X. Verificare che la pipetta di iniezione sia posizionata sul piano mediano dell'embrione toccando delicatamente lo zigote nel punto di iniezione.Se non si trova sul suo piano mediano, l'ago tenderà a far ruotare l'embrione invece di perforarlo. Successivamente, utilizzare un software per posizionare verticalmente il laser nella zona pellucida nel punto in cui verrà creato il foro. Una volta posizionato correttamente, utilizzare la finestra di controllo del laser e fare clic sul pulsante FIRE.Assicurarsi che la dimensione del foro sia sufficientemente ampia da creare un'apertura nella zona pellucida attraverso cui l'ago possa passare senza danneggiare la membrana plasmatica. Far passare l'ago di iniezione attraverso il foro nella zona pellucida e portarlo a contatto con la membrana plasmatica. Continuare a spingere in avanti la pipetta fino a quando l'ago non è penetrato per circa i 3/4 all'interno dell'embrione.Osservare la posizione del menisco all'interfase tra soluzione e olio. Questa verrà utilizzata per controllare in modo costante il volume di iniezione. Applicare una pressione negativa sulla pipetta di iniezione per aspirare la membrana plasmatica e il citoplasma all'interno dell'ago di iniezione.Continuare fino a quando il movimento del citoplasma all'interno dell'ago si accelera o fino a quando è possibile osservare il contenuto citoplasmatico che si mescola alla soluzione di iniezione. Questi segni indicheranno la rottura della membrana plasmatica. Re-iniettare il contenuto citoplasmatico, seguito dalla soluzione, all'interno del citoplasma dello zigote applicando una pressione positiva finché il menisco all'interfaccia tra soluzione e olio non si sarà spostato di un diametro equivalente a quello dello zigote rispetto al punto di partenza.Quindi, passare a un obiettivo 4X e spostare l'embrione iniettato sul lato inferiore della goccia di iniezione. Rilasciare l'embrione applicando una pressione positiva sul microiniettore di ritenzione. Raccogliere gli embrioni iniettati utilizzando un microerogatore.Lavare gli embrioni iniettati spostandoli attraverso le tre gocce di SOF-HEPES e coltivarli, come descritto nel protocollo testuale allegato. Il successo della somministrazione della soluzione è visibile nell'immagine fluorescente, in cui il dexion rosso viene utilizzato per tracciare il sito di iniezione e valutare l'efficienza e l'accuratezza dell'iniezione. In questo caso, il colorante è distribuito in modo omogeneo nel citoplasma, il che è tipico quando si utilizza questa tecnica.Questo protocollo presenta tassi di lisi minimi nei zigoti bovini e ovini. Solo pochi embrioni iniettati sono andati incontro a lisi nei bovini o nelle pecore a seguito della microiniezione. Inoltre, non ci sono differenze statisticamente significative nei tassi di sviluppo a blastocisti tra i gruppi di controllo e quelli iniettati, sia per gli embrioni bovini che ovini.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita al ritmo di due embrioni al minuto. Con un'iniezione eseguita da una persona esperta, si minimizzano i tassi di blastocisti animali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come eseguire l'iniezione microcitoplasmatica assistita da laser nei zigoti del bestiame.E anche come utilizzare una pressione di aspirazione positiva e negativa per assicurare la rottura della membrana plasmatica e un efficiente rilascio.

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