Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde
15 ottobre 2016
PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .
L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di emettere la distribuzione su scala nanometrica del fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato nella membrana plasmatica cellulare utilizzando la microscopia di localizzazione a fluorescenza a singola molecola. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave sulla segnalazione dei fosfoinositidi. Ad esempio, qual è l'organizzazione su scala nanometrica dei fosfoinositidi sotto il complesso di segnalazione nella membrana cellulare?
I principali vantaggi di questa tecnica sono l'elevata risoluzione spaziale e l'elusione del trattamento con detergente, che è una delle principali preoccupazioni negli studi morfologici dei fosfolipidi. Questo approccio comprende tre passaggi principali. Fase uno: la preparazione del foglio di membrana plasmatica da cellule vive.
Fase due: marcatura dei fosfoinositidi e imaging in fluorescenza di singole molecole. Fase tre: localizzazione di singole molecole e ricostruzione dell'imaging. Il giorno dell'esperimento, il rivestimento dei vetrini copricapo con mezzo litro o un millilitro di PDL.
Una o due ore dopo, assorbire l'eccesso di PDL con carta velina dal bordo del vetrino coprioggetto. Quindi conservare i vetrini coprioggetto su una piastra metallica a quattro gradi Celsius. Successivamente lavare le cellule INS-1 pre-trasgregate che sono state coltivate su vetrini coprioggetti con da mezzo a un millilitro di PBS ghiacciato contenente un millimolare di EGTA.
Ripetere questo lavaggio tre volte e assorbire il PBS in eccesso. Ora, utilizzando una pinzetta, posizionare i vetrini coprioggetti con le cellule coltivate sui vetrini coprioggetti rivestiti in PDL, con il lato cellulare rivolto verso il basso. Fallo sulla piastra di metallo raffreddata.
Quindi trasferisci la piastra a quattro gradi Celsius per sette-dieci minuti per dare alle cellule il tempo di attaccarsi. Quindi, utilizzare le pinzette per rimuovere delicatamente il vetrino coprioggetti caricato con cellule che lascerà dietro di sé un sottile strato di membrana cellulare sul vetrino coprioggetti rivestito in PDL. Quindi lavare delicatamente i fogli di membrana con mezzo o un millilitro di PBS ghiacciato.
Ora fissa ogni foglio di membrana in circa 150 microlitri di PFA ghiacciato al quattro percento con lo 0,2% di glutaraldeide in PBS. Lasciare riposare le membrane per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione, procedere immediatamente con l'imaging o coprire i preparati con PBS ghiacciato e conservarli a quattro gradi Celsius.
Se si utilizzano sonde di pH, si consiglia vivamente di eseguire l'imaging immediato. Per questa procedura viene utilizzato un sistema SMLM basato su microscopio TIRF. Prima di eseguire l'imaging delle membrane, diluire un microlitro di soluzione di perline fluorescenti in 10 millilitri di PBS con 50 millimolari di cloruro di magnesio.
Quindi caricare un campione nella camera di imaging e aggiungere 200 microlitri di soluzione diluita, quindi attendere 10 minuti. Quindi lavare il campione con PBS tre volte. Ora avvia il sistema di imaging PALM.
Nel software di imaging associato, selezionare il pulsante del canale iRFP. Quindi trovare la membrana cellulare che esprime le sonde di pH nel canale iRFP, utilizzare le perle fluorescenti per la correzione della deriva. Impostare un angolo TIRF normale su 2140, che è 1,5 più profondo dell'angolo critico TIRF e dovrebbe essere l'angolo predefinito.
Quindi utilizzare il pulsante di acquisizione per raccogliere un'immagine TIRF convenzionale nel canale iRFP come riferimento. Quindi, passa al canale PAm-Cherry1 facendo clic sul pulsante del canale RFP. Quindi regolare la barra di scorrimento nel pad AOTF completamente a destra per un'illuminazione completa e applicare il laser per circa 10-20 secondi per sbiancare la florescenza della membrana di sfondo.
Quindi, imposta l'impostazione ottimale della fotocamera nella scheda del formato su binning due per due. Quindi impostare il protocollo di acquisizione rapida nella scheda Acquisizione sequenza ND su 30.000 immagini a 20 hertz. Quindi applicare una potenza dallo 0,1 all'1% al laser a 405 nanometri durante l'acquisizione dell'immagine in modo che i punti spazialmente isolati in ciascun fotogramma siano facilmente identificabili.
Ora acquisisci le immagini PAm-Cherry1 facendo clic sul pulsante Esegui ora. Il numero di molecole che possono essere attivate diminuirà gradualmente durante le acquisizioni. In risposta, aumentare gradualmente l'intensità del laser a 405 nanometri per mantenere una densità ottimale dei segnali.
Acquisire le immagini fino a quando tutto il segnale PAm-Cherry1 non è attivato. Successivamente, durante l'elaborazione e la ricostruzione delle immagini, identificare e localizzare i singoli eventi molecolari da ciascun fotogramma. Impostare la soglia di intensità del filtraggio con il numero di soglia nella wavelet.
Ulteriori dettagli sono forniti nel protocollo di testo. La distribuzione spaziale PIP2 è sensibile a diverse fissazioni con una fissazione adeguata descritta nel testo, le sonde PIP2 hanno mostrato una distribuzione coerente quando marcate da anticorpi PIP2 o domini pH specifici. In confronto, le cellule vive marcate con domini di pH marcati con EGFP non visualizzano in modo molto diverso.
Tutti i campioni hanno mostrato una distribuzione uniforme delle sonde. Al contrario, una fissazione non ottimale ha portato a cluster PIP2 nitidi e densi e a una diminuzione dell'intensità del segnale. In condizioni di fissazione ottimali, le immagini a super risoluzione di PIP2 in cellule fissate hanno rivelato una distribuzione omogenea delle sonde in una porzione significativa della membrana plasmatica con gradienti di concentrazione limitati.
Alcuni patch di membrana arricchiti con sonde PIP2 erano scarsamente distribuiti e avevano varie dimensioni. Le immagini PALM delle cellule vive hanno mostrato una distribuzione spaziale simile a quella delle celle fisse. Un'analisi dettagliata dei segnali PIP2 ha rivelato che le loro dinamiche erano veloci nelle aree locali, ma ciò non ha comportato cambiamenti significativi nella loro abbondanza complessiva.
Questa tecnica introduce un nuovo modo per i ricercatori nel campo dei fosfolipidi di esplorare la distribuzione e l'attività di altri sottotipi di fosfoinositidi in condizioni fisiologiche.
Panoramica
Questo studio analizza la distribuzione a livello nanometrico del fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) nella membrana plasmatica cellulare mediante microscopia di localizzazione fluorescente a singola molecola. Il metodo fornisce informazioni sui segnali dei fosfoinositidi e sull'organizzazione dei fosfoinositidi nelle membrane cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- Il PI(4,5)P2 svolge un ruolo cruciale in numerose funzioni cellulari.
- L'organizzazione su scala nanometrica del PI(4,5)P2 nella membrana plasmatica non è ancora ben compresa.
- Le tecniche esistenti spesso prevedono il trattamento con detergenti, che può alterare la morfologia dei fosfolipidi.
- Questo studio mira a superare tali limitazioni mediante un nuovo approccio di imaging.
Scopo dello studio
- Chiarire la distribuzione su scala nanometrica del PI(4,5)P2 nella membrana plasmatica.
- Esplorare la dinamica del segnale dei fosfoinositidi.
- Sviluppare un metodo che eviti il trattamento con detergenti per studi morfologici migliori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di foglietti della membrana plasmatica da cellule vive.
- Etichettatura dei fosfoinositidi e analisi mediante microscopia a fluorescenza a singola molecola.
- Acquisizione ed elaborazione delle immagini per localizzare singoli eventi molecolari.
- Confronto tra metodi di fissazione per valutarne l'impatto sulla distribuzione di PI(4,5)P2.
Risultati principali
- Le condizioni di fissazione ottimali hanno rivelato una distribuzione omogenea del PI(4,5)P2 nella membrana plasmatica.
- La fissazione non ottimale ha portato alla formazione di aggregati densi e a una riduzione dell'intensità del segnale.
- L'analisi in tempo reale su cellule vive ha mostrato pattern di distribuzione spaziale simili a quelli osservati nelle cellule fissate.
- La dinamica del PI(4,5)P2 era rapida in aree locali, senza variazioni significative nell'abbondanza complessiva.
Conclusioni
- Lo studio introduce un nuovo metodo per esplorare la distribuzione dei fosfoinositidi.
- I risultati migliorano la comprensione della segnalazione mediata dai fosfoinositidi in condizioni fisiologiche.
- Questa tecnica può essere applicata per indagare altri sottotipi di fosfoinositidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Comprendere l'organizzazione a livello nanometrico dei fosfoinositidi come il PI(4,5)P2 è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nelle vie di trasduzione del segnale. Questo metodo consente di ottenere informazioni meccanicistiche sulla dinamica dei lipidi di membrana senza artefatti indotti da detergenti, supportando una maggiore affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta. Il metodo affronta un punto critico nella validazione degli obiettivi chiarificando l'organizzazione spaziale rilevante per le interazioni farmaco-target nella membrana plasmatica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Esamina ipotesi terapeutiche rivelando l'organizzazione spaziale del PI(4,5)P2, un regolatore chiave dei canali ionici e dei complessi di segnalazione.
- Valore operativo: Permette la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione diretta dell'organizzazione dei nanodomini lipidici in ambienti di membrana simili al nativo.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo chiarezza meccanicistica su bersagli dipendenti dai fosfoinositidi in condizioni fisiologiche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati (foglietti di membrana fissati e cellule vive) per saggi di screening successivi rivolti a composti che modulano i fosfoinositidi.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative con super-risoluzione spaziale che migliorano la standardizzazione e la riproducibilità del saggio.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma su diversi sottotipi di fosfoinositidi, consentendo una valutazione costante dei composti nei percorsi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la fedeltà del sistema rilevante per la malattia preservando la distribuzione di PI(4,5)P2 nell'immagine di cellule vive, favorendo l'estrapolazione a modelli preclinici.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce se gli effetti di segnalazione osservati derivano da una riorganizzazione lipidica piuttosto che da cambiamenti nell'abbondanza, affinando la fiducia sul bersaglio.
- Fiducia Predittiva: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio collegando la dinamica lipidica a livello nanometrico a esiti funzionali in contesti patofisiologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione dell'ipotesi sul bersaglio fino allo sviluppo del saggio e alla validazione meccanicistica preclinica, in particolare per bersagli che coinvolgono il segnaling dei fosfoinositidi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi risolvendo l'organizzazione su scala nanometrica di PI(4,5)P2 nei microdomini della membrana plasmatica.
- Screening: Fornisce dati spaziali quantitativi pronti per saggi e riproducibili, essenziali per uno screening affidabile di composti mirati a proteine che modulano i lipidi.
- Analisi: Fornisce output di localizzazione a singola molecola e ricostruzione che consentono il confronto della distribuzione dei lipidi in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica attraverso l'immagine in tempo reale di cellule vive che rispecchia i modelli di distribuzione in cellule fissate in condizioni fisiologiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile per l'analisi di sottotipi multipli di fosfoinositidi, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di segnalazione mediati da fosfoinositidi.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli ottimizzati per la fissazione e imaging di singole molecole corretto per gli spostamenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione chiarificando i meccanismi dipendenti dai lipidi, riducendo il rischio biologico in fasi avanzate dello sviluppo della target.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei target aggiustata per il rischio, basata sull'organizzazione spaziale validata dei principali lipidi di segnalazione della membrana.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia di localizzazione a singola molecola e preparazione di foglietti della membrana plasmatica.
- Necessita di un sistema SMLM basato su TIRF con attivazione laser e correzione della deriva mediante perline fluorescenti.
- Esige una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di fissazione per evitare aggregazioni artifacose dei segnali di PI(4,5)P2.
- Richiede considerazioni adattative qualora si voglia estendere l’approccio ad altri sottotipi di fosfoinositidi o a modelli cellulari rilevanti per patologie.
- Limite pratico: l’interpretazione del segnale deve tenere conto delle rapide dinamiche locali che non alterano l’abbondanza complessiva del lipide, come osservato nei dati ottenuti su cellule vive.
