Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia
30 settembre 2016
Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente l'RNA specifico con le proteine associate all'RNA in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul metabolismo e la regolazione dell'RNA, come ad esempio cosa sia un insieme distinto di fau-bee-pees legato a un particolare trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata efficienza dell'isolamento, che consente l'identificazione di follow-up di proteine associate all'mRNA nobile.
La metodologia rapida utilizza un ceppo di lievito che co-esprime l'MRNA marcato con MS2 e una proteina di fusione di una proteina legante MS2 e di una proteina legante la streptavadina. Coltiva 500 millilitri di cellule di lievito a 30 gradi Celsius in destrosio sintetico o terreno selettivo SD fino a un OD600 da 0,8 a 1,0. Quando le celle sono pronte, centrifugare a 3000 volte G per 4 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
Lavare le celle in PBS e centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un volume uguale di SD senza metionina. Incubare per 45-60 minuti a 30 gradi Celsius per indurre l'espressione della proteina di fusione.
Dopo 45-60 minuti, mettere da parte 10 millilitri di cellule per l'estrazione dell'RNA e utilizzare le cellule rimanenti per una rapida purificazione. Per iniziare questa procedura, aggiungere alle cellule 1,35 millilitri di formaldeide al 37%, fino a una concentrazione finale dello 0,1% per reticolare i complessi RNA-proteina. Continuare l'incubazione a 30 gradi Celsius per 10 minuti.
Per interrompere la reticolazione, aggiungere 26,5 millilitri di glicina molare da 2,5 molari, a una concentrazione finale di 0,125 molari, e incubare a 30 gradi Celsius per 3 minuti. Da qui in poi, mantieni tutto in ghiaccio e lavora rapidamente per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA. Centrifugare le celle a 3000 volte G per 4 minuti a 4 gradi Celsius.
Scartare il surnatante, aggiungere 45 millilitri di PBS freddo e centrifugare di nuovo. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 millilitri di tampone di lisi rapida che contiene un'alta concentrazione di inibitori della RNASI. Dividere la sospensione cellulare in aliquote da 500 microlitri in provette per microfuge con tappo a vite e aggiungere circa 400 milligrammi di perle di vetro refrigerate a ciascuna aliquota.
Liare le cellule in un battitore per tre minuti. Mettere immediatamente il lisato sul ghiaccio. Trasferire il lisato in nuove provette per microfuge.
Tagliare la parte superiore di una siringa da 5 millilitri e metterla su un tubo vuoto da 15 millilitri che funga da adattatore per i tubi con tappo a vite. Utilizzare un ago caldo per praticare un piccolo foro sul fondo di ogni provetta e posizionarli sopra le provette da 15 millilitri adattate. Centrifugare i gruppi vasca a 3000 volte G per un minuto a 4 gradi Celsius per eluire il lisato nelle provette da 15 millilitri.
Trasferire il flusso da ciascuna provetta da 15 millilitri a una nuova provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 10.000 volte G per 10 minuti a 4 gradi Celsius per eliminare i detriti cellulari. Raggruppare il surnatante di tutte le provette da 1,5 millilitri in un'unica provetta da 15 millilitri. Mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato rispettivamente per l'isolamento dell'RNA e delle proteine.
Iniziare la procedura rapida per isolare i complessi proteici dell'RNA aggiungendo 300 microgrammi di avidina al lisato cellulare. Incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius con rotolamento costante. Mentre il lisato cellulare viene incubato con Avidin, prelavare le perle di streptavidina, trasferire circa 300 microlitri di liquame di perle di streptavadina per pesare una provetta microcentrica da 1,5 millilitri, centrifugare la preparazione e quindi rimuovere il surnatante superiore che si tradurrà in 250 microlitri di perle.
Aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi rapida alle perle e centrifugare a 660 volte G per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e lavare nuovamente con tampone di lisi rapida. Per bloccare le perle, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lisi rapida, 0,5 millilitri di BSA e 10 microlitri di lievito TRNA e incubare per 1 ora a 4 gradi Celsius con rotazione costante.
Lavare le perle due volte con 1 millilitro di tampone di lisi rapida. Aggiungere 250 microlitri di perle di streptavidina prelavate al lisato contenente avidina e incubare per 1 ora a 4 gradi Celsius con rotazione costante. Questo tempo di incubazione è un compromesso tra fornire un tempo di legame sufficiente e ridurre al minimo le possibilità di degradazione dell'RNA.
Dopo un'ora, centrifugare a 660 volte G per 2 minuti a 4 gradi Celsius per eliminare le perle di streptavidina. Trasferire il surnatante in una provetta da 15 millilitri. Mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato rispettivamente per l'isolamento dell'RNA e delle proteine.
Aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi rapida alle perle. Miscelare mediante pipettaggio, trasferire in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 660 volte G per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Lavare altre tre volte con tampone di lisi rapida.
Dopo il lavaggio finale con tampone di lisi rapida, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 millilitro di tampone di lavaggio rapido e ruotare per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Centrifugare e lavare altre 2 volte con il tampone di lavaggio rapido. Lavare le perle con 1 millilitro di PBS e centrifugare come prima.
Togliere il surnatante, aggiungere alle perline 120 microlitri di PBS e ruotare per 5 minuti a rullo. Centrifugare come prima e raccogliere tutto il surnatante per l'estrazione di RNA e proteine come campione di lavaggio. Per eluire l'RNA e le proteine associate all'RNA, aggiungere 120 microlitri di biotina da 6 millimolari in PBS alle perle e incubare per 45 minuti a 4 gradi Celsius con rotazione costante.
Centrifugare le perle e trasferire il materiale estratto in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare nuovamente il campione eluito e trasferire la fase superiore in una nuova provetta da 1,5 millilitri per garantire che non vi siano riporti di perle. Prelevare campioni per l'estrazione di RNA o proteine.
Per determinare l'efficienza e la qualità dell'isolamento dell'RNA, è stata eseguita l'analisi settentrionale per due RNA marcati. PMP1 e FPR1, dalla lisi delle cellule fuse, dalla lisi rapida delle cellule e dopo eluizione con biotina. Gli RNA ribosomiali sono stati rilevati mediante colorazione con bromuro di etidio e la mancanza di RNA ribosomiali nel campione di eluizione indica il rigore della purificazione.
Il rigore e la specificità della purificazione sono ulteriormente dimostrati dalla mancanza di un segnale di un MRNA non marcato nei campioni di eluizione. Il segnale apparente nella corsia FPR1, che non ha le dimensioni di ACT1, è un residuo della precedente ibridazione con la sonda MS2L. Sebbene l'RNA in ingresso sia un po' più degradato rispetto all'RNA che è stato purificato dal protocollo Hot Phenol, una quantità significativa di RNA marcato a lunghezza intera viene isolata in modo specifico, come rivelato dal forte segnale nelle frazioni di eluizione.
I campioni di proteine possono essere analizzati mediante SDS-PAGE e argentato prima dell'analisi proteomica. La proteina di fusione MS2-CP-GFP-SBP, indicata dalla freccia, dimostra un carico proteico uguale. Gli asterischi indicano bande con intensità differenziali che sono state successivamente tagliate dal gel per l'analisi della spettrometria di massa.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante indossare guanti, garantire un'area di lavoro pulita, preparare la soluzione con acqua priva di RNA e lavorare in modo rapido ed efficiente per ridurre i tempi del protocollo. Non dimenticare che lavorare con reagenti come fenolo e formaldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una cappa chimica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare in modo efficiente ed efficace l'RNA di fayn-tress e del suo corpo associato.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'RNA-Seq per rilevare gli RNA che legano il trascritto di interesse.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo in vivo per isolare un RNA specifico insieme alle proteine associate. Questa tecnica mira a migliorare la nostra comprensione della regolazione dell'RNA all'interno delle cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Interazioni RNA-proteina
- Processi cellulari
- Metabolismo dell'RNA
Sfondo
- Le interazioni RNA-proteina sono fondamentali per numerose funzioni cellulari.
- Comprendere queste interazioni può fornire informazioni sul controllo della regolazione dell'RNA.
- I metodi esistenti possono risultare inefficaci nell'isolare complessi specifici di RNA-proteina.
- Questo studio presenta un nuovo approccio che utilizza ceppi di lievito.
Scopo dello studio
- Isolare RNA specifici e identificare le proteine associate in vivo.
- Indagare domande relative al metabolismo e alla regolazione dell'RNA.
- Migliorare l'efficienza delle tecniche di isolamento di complessi RNA-proteina.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un ceppo di lievito che esprime contemporaneamente mRNA marcato con MS2.
- Proteina di fusione del legante MS2 e della proteina legante lo streptavidina.
- Crescita delle cellule di lievito in mezzo sintetico con destrosio.
- Centrifugazione per isolare i complessi RNA-proteina.
Risultati principali
- È stata raggiunta un'alta efficienza nell'isolamento di complessi RNA-proteina.
- È stata facilitata l'identificazione di nuove proteine associate a mRNA.
- Il metodo consente un rapido trattamento dei campioni.
- Sono state ottenute informazioni sui meccanismi di regolazione dell'RNA attraverso questo approccio.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni RNA-proteina.
- Migliora la nostra comprensione del metabolismo e della regolazione dell'RNA.
- Applicazioni future potrebbero portare a scoperte nei processi cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
L'identificazione delle proteine leganti l'RNA (RBPs) associate a trascritti specifici è fondamentale per la validazione degli obiettivi terapeutici nell'ambito dei farmaci a base di RNA e nella scoperta di biomarcatori. La metodologia RaPID consente l'isolamento efficiente di complessi RNA-proteina in vivo, supportando la riduzione del rischio meccanicistico grazie alla chiarificazione delle interazioni funzionali in un sistema rilevante per la malattia. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta fornendo dati quantitativi e riproducibili sulle associazioni tra RBP e mRNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche identificando le proteine leganti l'RNA associate a mRNA rilevanti per le malattie, come PMP1 associato al reticolo endoplasmatico.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'isolamento di complessi RNA-proteina nativi da lievito, riducendo i falsi positivi derivanti da metodi in vitro.
- Valore predittivo: Supporta la fiducia nel bersaglio grazie al recupero specifico ed efficiente di interazioni in vivo, facilitando la selezione del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera sistemi biologici validati (ceppi di lievito che esprimono RNA marcato con MS2 e proteina di fusione) per applicazioni di screening successive.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento complesso mediante precipitazione con perle di streptavidina, migliorando la riproducibilità tra esperimenti.
- Prontezza del saggio: Produce frazioni purificate di RNA e proteine adatte ad analisi quantitative mediante spettrometria di massa o Northern blot.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega l'identificazione delle proteine leganti l'RNA nella fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo analisi successive come RNA-Seq ed SDS-PAGE.
- De-risking meccanicistico: Dimostra stringenza e specificità attraverso l'assenza di segnali di RNA ribosomiale e di mRNA non marcati nei campioni eluiti.
- Sistema rilevante per le malattie: Applicabile a modelli di lievito del metabolismo dell'RNA, con potenziale adattamento a sistemi mammiferi per la validazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo RaPID si inserisce nel continuum della scoperta precoce, sostenendo la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico prima dell'identificazione del capostazione e della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi isolando specifici complessi RNA-proteina da condizioni in vivo, chiarificando le associazioni funzionali.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi attraverso l'isolamento standardizzato di complessi RNA-proteina, supportando screening riproducibili di composti o screening genetici.
- Analisi: Produce risultati quantitativi mediante spettrometria di massa e analisi Northern blot, consentendo il confronto dell'abbondanza di RBP in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità preclinica fornendo complessi purificati per la validazione successiva in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la scoperta di RBP su più trascritti, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella regolazione dell'RNA.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità attraverso passaggi definiti di crosslinking, lisi e purificazione basata su microsferette.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo dati affidabili sulle interazioni RBP-mRNA, riducendo il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi in base alle associazioni RBP validate in contesti rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, coltura di lieviti e tecniche di interazione RNA-proteina.
- Necessita di strumentazione per il crosslinking (formaldeide), la separazione su microsferette e la centrifugazione a diverse velocità.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla composizione del buffer di lisi e all'uso di inibitori della RNasi, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio dal lievito ad altri sistemi modello, in particolare per quanto riguarda l'etichettatura e l'espressione delle proteine di fusione.
- Presenta limitazioni pratiche, come il rischio di degradazione dell'RNA durante le lavorazioni e la necessità di manipolazioni rapide e a freddo per mantenere l'integrità del complesso.
