Name: Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri un metodo rapido per isolare RNA specifici e proteine associate in vivo utilizzando ceppi di lievito. Questa tecnica ad alta efficienza facilita l'identificazione di nuove proteine legate all'mRNA.

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Ringraziamo il Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin per la loro consigli utili nella creazione del protocollo di rapida e fornire i plasmidi necessari. Ringraziamo anche il Dott Avigail Atir-Lande per il suo aiuto nella creazione di questo protocollo e il dottor Tamar Ziv dalla Smoler Proteomica Centro per il suo aiuto con l&#39;analisi LC-MS / MS. Ringraziamo il Prof. TG Kinzy (Rutgers) per l&#39;anticorpo YEF3. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione 2.011.013 dalla Science Foundation binazionale.

Nota: inserire una sequenza composta da 12 siti MS2-assorbente (MS2 loop; MS2L) nel locus genomico desiderato, di solito tra la griglia di lettura aperta (ORF) e il 3 &#39;UTR. Un protocollo dettagliato per questa integrazione è fornito altrove 22. Verificare il corretto inserimento e di espressione mediante PCR, analisi Northern o RT-PCR 20,23. È importante verificare che l&#39;integrazione non è intervenuto con la sintesi del 3&#39;UTR. Inoltre, un plasmide esprimente MS2-CP fuso SBP sotto l&#39;espressione di un promotore inducibile (esaurimento metionina) dovrebbe essere introdotto nelle cellule 24. Un ceppo identico, escluse le anse MS12 introdotte, dovrebbe essere usato come un controllo per il rilevamento di segnali non specifici. 1. purificazione rapida <ol><li> Grow 500 ml di cellule di lievito (usare 250-1,000 ml di cellule di lievito a seconda del livello di espressione del gene di interesse) esprimenti MS2-etichettato mRNA 20 eMS2-CP-GFP-SBP proteina di fusione da 24 a 600 OD 0,8-1,0 a 30 ° C in terreno di coltura appropriato (ad esempio, sintetico destrosio (SD) terreno selettivo). </li><li> cellule centrifugare a 3000 xg per 4 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule in 1x tampone fosfato (PBS), centrifuga come prima (passo 1,2), risospendere in un volume uguale (passo 1.1) di SD senza metionina, e incubare per 45 - 60 minuti a 30 ° C per indurre l&#39;espressione del MS2 -CP-GFP-SBP proteina di fusione. Nota: tempo di induzione più lungo può causare aggregazione di GFP. </li><li> Mettere da parte 10 ml di cellule e di estrarre l&#39;RNA da questo campione con il metodo semplice &quot;fenolo caldo&quot; 25. Attenzione: fenolo è altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. Nota: Questo RNA è un buon riferimento per la qualità dell&#39;RNA isolato (Figura 1A). </li><li> Per 500 ml cellule, aggiungere 1,35 ml 37% di formaldeide al c finaleoncentration del 0,1% per reticolare i complessi RNA-proteina. Continua incubazione a 30 ° C per 10 min. Attenzione: La formaldeide è altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. </li><li> Aggiungere 26,5 ml di 2,5 M glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M e incubare per 3 minuti per fermare reticolazione. Da questo punto in poi, mettere tutto in ghiaccio per ridurre al minimo la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Cellule centrifugare a 3000 xg per 4 minuti a 4 ° C e lavare con 45 ml di freddo 1x PBS. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml rapida lisi tampone per 100 ml di coltura cellulare iniziali. </li><li> Suddiviso in aliquote di 500 microlitri in tubi microcentrifuga con tappo a vite e aggiungere ~ 400 mg di perle di vetro refrigerate a ciascuna aliquota (circa un pieno 0,2 ml provetta PCR). </li><li> Lisare le cellule in una perlina battitore per 3 min. Subito mettere il lisato in ghiaccio. Nota: La lisi cellulare rilasci RNasi cellulari, che sono la principale causa di degradazione dell&#39;RNA. tampone rapida lisi contiene un&#39;alta concentrazione di RNAsi INHIcura dell&#39;Espositore, quali l&#39;eparina non specifico inibitore RNasi e inibitori specifici. Si raccomanda anche di lavoro rapidamente e tenere tutto freddo. </li><li> Trasferire il lisato di nuovi tubi. Pierce un piccolo foro nella parte inferiore di ciascuna provetta da microcentrifuga con un ago caldo (0,8 mm x 40 mm) e posizionare i tubi microcentrifuga sopra dei tubi 15 ml. Utilizzare la testa di una siringa da 5 ml da adattatore fra i tubi microcentrifuga e le provette da 15 ml. Centrifugare il gruppo tubi a 3.000 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire il flow-through dal tubo 15 ml in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per eliminare i detriti cellulari. </li><li> surnatanti piscina da tutte le provette da 1,5 ml in un unico tubo da 15 ml, e mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato per l&#39;RNA e l&#39;isolamento delle proteine, rispettivamente. Nota: Questi serviranno da campioni &quot;input&quot; per successiva analisi (Figura 1). </li><li> Aggiungere 300 mg di avidina per 500 ml di icoltura di lieviti nitial e incubare per 30 min (questo può essere ridotto a 10 min) a 4 ° C sotto laminazione costante (10 rpm). Nota: i blocchi avidina biotina e proteine ​​biotinilati di legarsi ai talloni streptavidina. </li><li> Pre-lavare le perline streptavidina prima dell&#39;incubazione con lisato cellulare. <ol><li> Trasferire circa 300 ml di streptavidina perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere il surnatante superiore. Questo si tradurrà in 250 pl di perline. Lavare le perle due volte con 1 ml di tampone di lisi RaPID. Centrifugare le perline streptavidina a 660 xg per 2 minuti a 4 ° C tra ogni passo. </li><li> Bloccare le perle incubando per 1 ora con 0,5 ml di tampone di lisi RaPID, 0,5 ml di 10 mg / ml BSA e 10 ml di 10 mg / ml tRNA lievito. Beads possono essere lasciati O / N in soluzione bloccante a 4 ° C con rotazione se necessario. </li><li> Lavare due volte con 1 ml di rapida lisi buffer. Nota: perline magnetici possono essere utilizzati anche per ridurre i tempi e Prioritàound. Questi, tuttavia, avere una capacità inferiore a perline sefarosio. </li></ol></li><li> Aggiungere 250 pl di perline streptavidina pre-lavati al lisato avidina contenente (dal punto 1.14) e incubare 1 ora a 4 ° C con rotazione costante (10 rpm). Nota: Questo tempo di incubazione è un compromesso tra fornire tempo sufficiente vincolante e riducendo al minimo le possibilità per la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Centrifugare a 660 xg per 2 minuti a 4 ° C per cancellare le perline streptavidina e trasferire il surnatante in un nuovo tubo 15 ml. Mettere da parte 1/50 e 1/100 volume del lisato per RNA e proteine ​​isolamento, rispettivamente. Nota: Questi saranno i campioni &quot;Unbound&quot;. </li><li> Lavare le perline con 1 ml di tampone rapida lisi, agitare delicatamente, trasferire in una nuova provetta da 1,5 ml, e centrifugare come al punto 1.17. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Lavare le perline con 1 ml di tampone Rapid Wash, e questa volta la rotazione (10 rpm) per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere questa operazione due volte. </li&gt; <li> Lavare le perline con 1 ml di PBS 1x e centrifugare come sopra. </li><li> Lavare le perline di nuovo con 120 ml di PBS 1x. Centrifuga come sopra, e prendere l&#39;intero surnatante per l&#39;RNA e l&#39;estrazione di proteine ​​come il campione &quot;Wash&quot;. Nota: Questo ultimo campione di lavaggio indicherà la severità dei lavaggi e dovrebbe essere dello stesso volume del campione di eluizione. Questo semplificherà trasformazione e caricamento in saggi successivi. </li><li> Per eluire RNA e proteine ​​RNA associate dalla colonna, aggiungere 120 ml di 6 mM biotina in 1x PBS e incubare per 45 min a 4 ° C con rotazione costante (10 rpm). </li><li> Centrifugare le perline come sopra e trasferire il materiale eluito in una nuova provetta da 1,5 ml. Spin nuovamente il campione eluito e trasferire la fase superiore in una nuova provetta da 1,5 ml per garantire che non riporto di perline. </li><li> Prelevare campioni per RNA o estrazione di proteine. Nota: Il volume taken dovrebbe dipendere dal seguente livello di dosaggio ed espressione del RNA o proteina di interesse. Come linea guida, per l&#39;analisi del nord 26, prendere l&#39;80% del campione, per il Western Blot 23,27 o RT-PCR 28, prendere il 20%, e per la spettrometria di massa 29 alla scoperta di nuove proteine, prendere l&#39;intero campione. </li></ol> 2. RNA Estrazione <ol><li> Aggiungere un volume uguale di 2x reticolazione Reversal Buffer e incubare per 45 min a 65 ° C. Continuare direttamente per estrazione di RNA. Nota: L&#39;inversione reticolazione tampone contiene acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), che migliora in modo significativo l&#39;estrazione di RNA 20. </li><li> Utilizzare il fenolo di serie: il metodo cloroformio 26 per estrarre l&#39;RNA dal &quot;ingresso&quot; e campioni &quot;non legati&quot; (passi 1.13 e 1.17). Nota: Questi campioni contengono una grande quantità di eparina inibitore RNasi, che può inibire successive Reverse Transcriptase- (RT) saggi che utilizzano (ad esempio, RT-PCR), di conseguenza, LiCl precipitazioni 30 si consiglia di rimuoverlo. Il &quot;wash &quot;e&quot; campioni di eluizione &quot;(passi 1.21 e 1.24) contengono piccole quantità di RNA e sono precipitati attraverso le seguenti fasi. </li><li> Aggiungere un volume uguale di 8M Guanidinium-HCl (GuHCl) e due volumi di etanolo 100% al &quot;lavaggio&quot; e &quot;campioni eluizione&quot;. Incubare a -80 ° C per almeno 2 ore. Nota: Guanidinium in modo efficiente denaturare le proteine ​​e quindi inibire RNasi e proteasi nel campione. </li><li> Centrifugare a 20.000 xg, a 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante. Lavare il pellet con fredda 80% etanolo e centrifugare nuovamente a 20.000 xg, a 4 ° C per 15 min. </li><li> Sciogliere il pellet di RNA in 400 ml di RNasi acqua libera e precipitare di nuovo per eliminare ogni residuo GuHCl o altri contaminanti. Aggiungere 40 ml di acetato di 3 M di sodio, pH 5,2 e 800 ml di etanolo al 100%, incubare a -20 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Centrifuga e lavare come al punto 2.4 e rimuovere tutti etanolo con una punta di 10 microlitri. Risospendere il pell RNAet in 10 microlitri acqua priva di RNasi. Fate particolare attenzione come il pellet di RNA di solito non è visibile. Nota: I campioni possono essere utilizzati per l&#39;analisi Northern come descritto in 23 (figura 1). </li></ol> 3. preparazione proteina per Western Blot o Analysis spettrometria di massa <ol><li> Aggiungere 1/3 volume di 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) per campioni di proteine ​​e incubare 45 min a 65 ° C per invertire la reticolazione di RNA e proteine. Nota: I campioni possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Proteine eseguito su un gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) 31. Regolare la percentuale del gel in base alle dimensioni delle proteine ​​da analizzare. Nota: gel di acrilammide 10% dà una vasta gamma di separazione ed è buono come prima approssimazione. </li><li> Trasferire proteine alla membrana come nell&#39;analisi immunoblot standard di 27 per il controllo dell&#39;efficienza di isolamento (Figura 1C). Macchia sia con Coomassie Blu R250 o argento macchia prima analisi di spettrometria di massa. Nota: macchia d&#39;argento è la scelta preferita perché è più sensibile e permette una migliore rilevazione (Figura 1B). La colorazione può essere fatto sia con soluzioni preparate manualmente o kit commerciali. Il tempo di incubazione del gel nella soluzione finale di colorante deve essere determinato sperimentalmente. incubazione può rivelare basse proteine ​​abbondanti, ma può causare proteine ​​altamente espresse, come MS2-CP-SBP-GFP essere finita macchiata e può mascherare le proteine ​​che circondano nelle loro vicinanze. Inoltre, si potrebbe verificare un fondo elevato. Seguire la reazione con cura, e aggiungere soluzione di arresto al momento opportuno. </li><li> Tagliare le bande dal gel e trasferirli in provette da 1,5 ml. Conservare i campioni a -20 ° C, o inviare per l&#39;estrazione di proteine e tripsina digestione seguita da analisi LC-MS / MS 32. </li><li> Come un approccio di proteomica alternativo per escludere la fase di separazione del gel, digerire materiale eluito dal punto 1.24 in modo daluzione utilizzando tripsina e oggetto di analisi LC-MS / MS 33. Nota: Omettere la separazione SDS-PAGE semplifica il protocollo e ne aumenta la resa. Tuttavia, i campioni possono contenere tracce di detergente NP-40, che inibisce l&#39;analisi di spettrometria di massa. Per superare questo problema, effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Eseguire proteine su SDS-PAGE 31 per 10 - 15 minuti. </li><li> Tagliare l&#39;intera porzione della corsia (cioè, dove si trovano le proteine). Nota: Il campione proteico potrebbe includere una quantità significativa della proteina MS2-CP-SBP che possono oscurare i segnali di proteine ​​poco abbondanti. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Vari metodi utilizzano l&#39;isolamento di mRNA specifici per identificare le loro proteine associate 11,34 35. Questi metodi si applicano in vitro e in vivo strategie per sondare le interazioni RNA-proteina. Metodi in vitro incubare esogena trascritti di RNA con lisato cellulare per catturare RBPs e isolare complessi RNP 36,37. Un approccio efficace di questo tipo è stato presentato di recente, che ha permesso l&#39;identificazione di nuove proteine che legano...

RNA-binding proteins (RBPs) rappresentano circa il 10% di S. proteine cerevisiae 1,2 e circa il 15% delle proteine di mammiferi 3-5. Essi sono implicati in molti processi cellulari, come l&#39;elaborazione di mRNA post-trascrizionale e la regolamentazione, la traduzione, biogenesi dei ribosomi, tRNA aminoacilazione e la modifica, il rimodellamento della cromatina, e altro ancora. Un importante sottogruppo di RBPs è proteine mRNA-binding (mRNPs) 6,7. Nel corso di mRNA maturazione diversi RBPs legano la trascrizione e mediare la sua lavorazione nucleare, l&#39;esportazione fuori dal nucleo, localizzazione cellulare, la traduzione e la degradazione 6-8. Così, la serie distinta di RBPs legati ad una particolare trascrizione in qualsiasi punto nel tempo determina la sua lavorazione e, infine, il suo destino. L&#39;identificazione di RBPs associati ad un mRNA potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione dei processi sottostanti la loro regolazione post-trascrizionale. Diverse genetica, Microscopiche metodi biochimici e bioinformatica sono stati utilizzati per identificare le proteine coinvolte nella regolazione di mRNA (rivisto in 9-11). Tuttavia, solo alcuni di questi metodi consentono l&#39;identificazione di proteine ​​associate con un particolare mRNA bersaglio. Da segnalare è l&#39;ibrido sistema di lievito Three (Y3H), che utilizza l&#39;mRNA di interesse come esca per lo screening di una libreria di espressione in cellule di lievito. Cloni positivi si osservano di solito attraverso una selezione di crescita o giornalista espressione 12-14. Il vantaggio principale di questo metodo è il gran numero di proteine ​​che possono essere scansionate in un ambiente cellulare e la capacità di misurare la forza dell&#39;interazione RNA-proteina. Svantaggi includono il numero relativamente elevato di falsi positivi a causa di legame non specifico, e l&#39;elevato potenziale di risultati falsi negativi dovuti, in parte, al ripiegamento della preda proteina di fusione o l&#39;RNA esca. Un&#39;alternativa all&#39;approccio genetico è purifi affinitàcazione di RNA con le sue proteine ​​associate. Poly A contenente mRNA può essere isolato mediante l&#39;uso di oligo dT colonne, e le loro proteine ​​associate vengono rilevati mediante spettrometria di massa. L&#39;interazione RNA-proteina è conservata nel suo contesto cellulare da reticolazione, che rende legami covalenti a corto raggio. L&#39;uso della colonna dT oligo produce una visione globale dell&#39;intero proteoma che è associato con qualsiasi poli A contenente mRNA 3,5,15. Tuttavia, questo non fornisce un elenco di proteine ​​che sono associati a un particolare mRNA. Molto pochi metodi sono disponibili per realizzare una tale identificazione. Il metodo COPPIA comporta la transfezione di acido nucleico con complementarità al bersaglio mRNA 16,17. L&#39;acido nucleico è anche collegato ad un peptide, che consente di reticolazione RBPs nelle immediate vicinanze del sito di interazione. Dopo la reticolazione, l&#39;acido RBP-peptide-nucleico può essere isolato e sottoposto ad analisi proteomica. Di recente, una metodologia basata su aptamero eraefficacemente applicato ad estratti da linee cellulari di mammiferi 18. Un aptamero RNA con una maggiore affinità con streptavidina è stato sviluppato e fusa ad una sequenza di interesse (elemento ricco di AU (ARE) in questo caso). Il aptameri-ARE RNA è stata allegata al perline streptavidina e mescolato con lisato cellulare. Le proteine ​​che associate con la sequenza ARE sono stati purificati e identificati mediante spettrometria di massa (MS). Anche se questo metodo rilevato associazioni che si verificano all&#39;esterno le impostazioni cellulari (cioè, in vitro), è probabile essere modificato in futuro in modo da introdurre aptameri nel genoma e consentire così l&#39;isolamento di proteine associate con il mRNA mentre nel ambiente cellulare (cioè, in vivo). In lievito, in cui le manipolazioni genetiche sono ben stabiliti, il metodo rapido (sviluppato nel laboratorio del Prof. Jeff Gerst) fornisce una visualizzazione di vivo associazioni in 19. RaPID combina la specifica e forte legame della proteina di rivestimento MS2 (MS2-CP) alla sequenza RNA MS2, e del dominio di legame streptavidina-(SBP) di streptavidina microsfere coniugate. In questo modo efficiente purificazione di mRNA MS2-taggate con perline streptavidina. Inoltre, l&#39;espressione di 12 copie MS2 loop consente fino a sei MS2-CP di impegnare contemporaneamente al RNA e aumentare l&#39;efficienza del suo isolamento. Questo protocollo è stato quindi suggerito di consentire l&#39;identificazione di nuove proteine ​​mRNA associate una volta che i campioni eluiti vengono sottoposti ad analisi proteomica mediante spettrometria di massa. Recentemente abbiamo utilizzato rapide per identificare nuovi proteine associate con il lievito PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA è stato precedentemente dimostrato di essere associato con la membrana ER e la sua regione 3 &#39;non tradotta (UTR) è stato trovato per essere un elemento determinante in questa associazione 21. Così, RBPs che legano PMP1 3 &#39;UTR sono suscettibili di svolgere un ruolo importante nella sua localizzazione. RaPID seguito da cromatografo liquidoy-spettrometria di massa / spettrometria di massa (LC-MS / MS) ha portato all&#39;identificazione di numerose nuove proteine che interagiscono con PMP1 20. Qui, forniamo un protocollo dettagliato della metodologia rapida e controlli importanti che devono essere fatte, e suggerimenti tecnici che possono migliorare il rendimento e la specificità.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo acido (pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo acido: cloroformio (5:1, pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonile Fluoruro (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi&nbsp; Inibitore</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0,4-0,6 mm di diametro&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Perline di streptavidina</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>TRNA di lievito</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M Tris-HCL pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerolo, 0,04% Bromofenolo-Blu.</td></tr><tr>tampone <td></td><td></td> di <td>lisi fenolica calda</td><td>10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% SDS&nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Acetato di sodio pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% e 70% Etanolo (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td>priva di RNasi</tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lisi RaPID <td>20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Eparina, 1 mM Ditiotreitolo (DTT), 1 mM Fenilmetilsulfonile Fluoruro (PMSF), 10 &; g/ml Leupeptina, 10 &; micro; g/ml Aprotinina, 10 &micro; g/ml Inibitore della tripsina di soia, 10 &micro; g/ml di pepstatina, 20 U/ml di DNasi I, 100 U/ml di ribonucleasi&nbsp; Inibitore.</td></tr><tr>2x tampone <td></td><td></td><td>di inversione reticolante</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>20 mM Tris-HCl pH 7,5,&nbsp; 300 mM NaCl, 0,5% NP-40</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>Per la rilevazione di proteine in gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>SD medium selettivo</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l di azoto base di lievito senza aminoacidi e solfato di ammonio, 5 g/l di solfato di ammonio, 2% di glucosio, 350 mg/l di treonina, 40 mg/l di metionina, 40 mg/l di adenina, 50 mg/l di lisina, 50 mg/l di triptofano, 20 mg/l di istidina, 80 mg/l di leucina, 30 mg/l di tirosina, 40 mg/l di arginina</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)</td><td>Regalo da Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5.000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3.000</td></tr><tr><td>Anti coniglio IgG-HRP coniugato</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10.000</td></tr></tbody></table>

novel rna-proteine ​​leganti isolamento dalla rapida metodologia

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Le proteine leganti l'RNA (RBP) svolgono un ruolo importante in ogni aspetto del metabolismo e della regolazione dell'RNA. La loro identificazione è una sfida importante nella biologia moderna. Solo pochi metodi in vitro e in vivo consentono l'identificazione di RBP associate a un particolare mRNA bersaglio. Tuttavia, i loro principali limiti sono l'identificazione di RBP in un ambiente non cellulare (in vitro) o l'isolamento a bassa efficienza dell'RNA di interesse (in vivo). Una metodologia di purificazione e identificazione delle proteine leganti l'RNA (RaPID) è stata progettata per superare queste limitazioni nel lievito e consentire l'isolamento efficiente delle proteine associate in vivo. Per raggiungere questo obiettivo, l'RNA di interesse viene marcato con loop MS2 e co-espresso con una proteina di fusione di una proteina legante MS2 e una proteina legante la streptavidina (SBP). Le cellule vengono quindi sottoposte a reticolazione e lisata e i complessi vengono isolati attraverso perle di streptavidina. Le proteine che co-purificano con l'RNA marcato possono quindi essere determinate mediante spettrometria di massa. Recentemente abbiamo utilizzato questo protocollo per identificare nuove proteine associate all'mRNA PMP1 associato all'ER. Qui, forniamo un protocollo dettagliato di RaPID e discutiamo alcuni dei suoi limiti e vantaggi.

RaPID consente l&#39;isolamento di uno specifico RNA bersaglio con le sue proteine ​​associate. Critico per il successo è mantenere l&#39;RNA intatto il più possibile, ottenendo una quantità sufficiente di proteine. Per determinare l&#39;efficienza di isolamento e la qualità dell&#39;RNA, analisi Northern viene eseguita (Figura 1A). analisi Northern ha il vantaggio di segnalazione direttamente l&#39;efficienza e la qualità della RaPID. Così, le quantità relative di lungh...

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente un RNA specifico insieme alle proteine associate all'RNA in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul metabolismo e la regolazione dell'RNA, ad esempio quali siano l'insieme distinto di Fau-Bee-PEE legate a un particolare trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata efficienza di isolamento, che consente l'identificazione successiva di proteine associate a mRNA nobili.La metodologia rapida utilizza una ceppa di lievito che co-esprime un MRNA marcato con MS2 e una proteina fusa composta da una proteina legante MS2 e una proteina legante streptavidina. Coltivare 500 millilitri di cellule di lievito a 30 gradi Celsius in mezzo selettivo sintetico con destrosio (SD) fino a un OD600 compreso tra 0,8 e 1,0. Quando le cellule sono pronte, centrifugare a 3000 ×g per 4 minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante.Lavare le cellule in PBS e centrifugare nuovamente. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in un volume uguale di SD privo di metionina. Incubare per 45-60 minuti a 30 gradi Celsius per indurre l'espressione della proteina di fusione.Dopo 45-60 minuti, prelevare 10 millilitri delle cellule per l'estrazione di RNA e utilizzare le cellule rimanenti per la purificazione rapida. Per iniziare questa procedura, aggiungere alle cellule 1,35 millilitri di formaldeide al 37%, fino a una concentrazione finale dello 0,1%, al fine di cross-linkare i complessi RNA-proteina. Continuare l'incubazione a 30 gradi Celsius per 10 minuti.Per arrestare il cross-linking, aggiungere 26,5 millilitri di glicina 2,5 molari, fino a una concentrazione finale di 0,125 molarità, e incubare a 30 gradi Celsius per 3 minuti. Da questo punto in poi, mantenere tutto sul ghiaccio e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione dell'RNA. Centrifugare le cellule a 3000 ×g per 4 minuti a 4 gradi Celsius.Eliminare il soprannatante, aggiungere 45 millilitri di PBS freddo e centrifugare nuovamente. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 5 millilitri di tampone di lisi rapida contenente una concentrazione elevata di inibitori della Rnasi. Dividere la sospensione cellulare in aliquote da 500 microlitri in provette microcentrifuga con tappo a vite e aggiungere circa 400 milligrammi di perle di vetro refrigerate a ciascuna aliquota.Lisare le cellule in un omogeneizzatore a sferette per tre minuti. Posizionare immediatamente il lisato sul ghiaccio. Trasferire il lisato in nuove provette per microcentrifuga.Tagliare la parte superiore di una siringa da 5 millilitri e posizionarla su un tubo vuoto da 15 millilitri per utilizzarla come adattatore per i tubi con tappo a vite. Usare un ago caldo per praticare un piccolo foro nel fondo di ogni tubo e posizionarli sopra i tubi da 15 millilitri modificati. Centrifugare gli insiemi di tubi a 3000 ×g per un minuto a 4 °C per eluire il lisato nei tubi da 15 millilitri.Trasferire il flusso passante da ciascun tubo da 15 millilitri a un nuovo tubo da 1,5 millilitri e centrifugare a 10.000 × g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il sopranatante proveniente da tutti i tubi da 1,5 millilitri in un singolo tubo da 15 millilitri. Mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato rispettivamente per l'isolamento di RNA e proteine.Iniziare la procedura rapida per l'isolamento di complessi RNA-proteina aggiungendo 300 microgrammi di Avidina al lisato cellulare. Incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius sotto rotazione costante. Mentre il lisato cellulare viene incubato con l'Avidina, prelavare le perle di streptavidina, trasferire circa 300 microlitri della sospensione di perle di streptavidina in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri, centrifugare il preparato, quindi rimuovere il sopranatante superiore, ottenendo così 250 microlitri di perle.Aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi rapida alle perle e centrifugare a 660 ×g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e lavare nuovamente con il tampone di lisi rapida. Per bloccare le perle, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lisi rapida, 0,5 millilitri di BSA e 10 microlitri di TRNA di lievito e incubare per 1 ora a 4 gradi Celsius con rotazione costante.Lavare le perle due volte con 1 millilitro di tampone di lisi rapida. Aggiungere 250 microlitri delle perle di streptavidina prelavate al lisato contenente avidina e incubare per 1 ora a 4 gradi Celsius con rotazione costante. Questo tempo di incubazione rappresenta un compromesso tra il garantire un tempo di legame sufficiente e il ridurre al minimo le possibilità di degradazione dell'RNA.Dopo un'ora, centrifugare a 660 ×g per 2 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i microsfera di streptavidina. Trasferire il soprannatante in un tubo da 15 millilitri. Mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato rispettivamente per l'isolamento di RNA e proteine.Aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi rapida alle perle. Mescolare mediante pipettaggio, trasferire in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 660 ×g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Lavare altre tre volte con il tampone di lisi rapida.Dopo l'ultimo lavaggio con il tampone di lisi rapida, rimuovere il soprannatante, aggiungere 1 millilitro di tampone di lavaggio rapido e ruotare per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Centrifugare e lavare altre 2 volte con il tampone di lavaggio rapido. Lavare le perle con 1 millilitro di PBS e centrifugare come in precedenza.Rimuovere il soprannatante, aggiungere alle perle 120 microlitri di PBS e ruotare per 5 minuti su un agitatore rotante. Centrifugare come in precedenza e raccogliere tutto il soprannatante per l'estrazione di RNA e proteine come campione di lavaggio. Per eluire l'RNA e le proteine associate all'RNA, aggiungere alle perle 120 microlitri di biotina 6 millimolare in PBS e incubare per 45 minuti a 4 gradi Celsius con rotazione costante.Centrifugare le perle e trasferire il materiale eluito in un nuovo tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare nuovamente il campione eluito e trasferire la fase superiore in un nuovo tubo da 1,5 millilitro per assicurare l'assenza di trascinamento delle perle. Prelevare campioni per l'estrazione di RNA o proteine.Per determinare l'efficienza di isolamento e la qualità dell'RNA, è stata eseguita un'analisi Northern per due RNA marcati: PMP1 e FPR1, ottenuti dalla lisi delle cellule in situ, dalla lisi rapida delle cellule e dopo l'eluizione con biotina. Gli RNA ribosomiali sono stati rilevati mediante colorazione con bromuro di etidio, e l'assenza di RNA ribosomiali nel campione eluito indica la stringenza della purificazione.La stringenza e la specificità della purificazione sono ulteriormente dimostrate dall'assenza di segnale di un MRNA non marcato nei campioni di eluizione. Il segnale apparente nella corsia FPR1, che non ha le dimensioni di ACT1, è un residuo dell'ibridazione precedente con la sonda MS2L. Sebbene l'RNA in ingresso sia in qualche modo più degradato rispetto all'RNA purificato mediante il protocollo Hot Phenol, viene isolata in modo specifico una quantità significativa di RNA marcato a lunghezza intera, come evidenziato dal forte segnale nelle frazioni di eluizione.I campioni proteici possono essere analizzati mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione argentica prima dell'analisi proteomica. La proteina di fusione MS2-CP-GFP-SBP, indicata dalla freccia, dimostra un uguale caricamento proteico. Gli asterischi indicano bande con intensità differenziali che sono state successivamente escisse dal gel per l'analisi mediante spettrometria di massa.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante indossare guanti, assicurarsi di avere un'area di lavoro pulita, preparare le soluzioni con acqua priva di RNasi ed operare rapidamente ed in modo efficiente per ridurre il tempo del protocollo. Non dimenticare che l'uso di reagenti come il fenolo e il formaldeide può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come lavorare sotto cappa chimica devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare in modo efficiente ed efficace l'RNA di fayn-tress e del suo corpo associato.Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'RNA-Seq, al fine di rilevare gli RNA che si legano al trascritto di interesse.

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Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

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