"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di visualizzare la formazione dei fagosomi, così come il sito preciso dello scisma dei fagosomi in 3D, nei macrofagi viventi, utilizzando la Florescenza a Riflessione Interna Totale, o Microscopia TIRF. Questo metodo combina la microscopia TIRF con l'epifluorescenza per monitorare la localizzazione passo dopo passo di due diverse proteine fluorescenti durante l'estensione degli pseudopodi e la fusione della punta. La tecnica fornisce un metodo sistematico per determinare l'angolo critico e ottenere un segnale TIRF che è fondamentale per trarre conclusioni sulla vicinanza alla membrana plasmatica.

Il giorno prima della sessione al microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento a 37 gradi Celsius per consentire un riscaldamento omogeneo del tavolino del microscopio. La mattina successiva, utilizzando 100 microlitri di PBS, integrato con lo 0,1% di BSA per lavare due volte 7x10 globuli rossi di pecora o SRBC per piatto con fondo di vetro da 35 millimetri. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule in 500 microlitri di IGG di coniglio anti-SRBC, a una concentrazione sub-agglutinante, in PBS integrato con lo 0,1% di BSA per 5 microlitri di cellule, e incubare le cellule per 30 minuti con una rotazione lenta.

Al termine dell'incubazione, lavare gli SRBC due volte in PBS più BSA e risospendere le cellule in 2 millilitri di 37 gradi Celsius, terreno di microscopia privo di siero per piatto. Quindi, trattare piatti con fondo di vetro da 35 millimetri con 2 millilitri di poli-L lisina allo 0,1% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi con 2 millilitri di PBS. Per la fissazione non covalente degli SRBC, versare 2 millilitri di cellule opsonizzate IGG in ciascuna delle piastre rivestite di polilisina e centrifugare i campioni in una centrifuga a rotore oscillante.

Scartare i surnatanti e lavare le particelle una volta con 2 millilitri di PBS più il 10% di BSA. Quindi, incubare le particelle con 2 millilitri di PBS fresco più il 10% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da tre lavaggi con 2 millilitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con 2 millilitri di terreno per microscopia privo di siero a 37 gradi Celsius.

Posizionare un piatto rivestito con SRBC sul tavolino del microscopio. Quindi, raschiare le cellule trasfettate di interesse dal fondo del piatto di coltura e pipettare le cellule alcune volte per ottenere una sospensione a singola cellula. Aggiungere le cellule trasfettate al piatto rivestito con SRBC.

Avvia il software di acquisizione in tempo reale. Trova una cellula che esprime le proteine marcate in fluorescenza e regola la posizione della capsula in modo che una cellula di interesse si trovi al centro del campo. Acquisisci 500 immagini con angoli diversi da zero al 5% con incrementi di 0,01 gradi, a una lunghezza d'onda di eccitazione.

Per determinare l'angolo critico in cui la luce incidente deve essere completamente riflessa all'interfaccia vetro-mezzo e generare un'onda evanescente, aprire la sequenza di immagini nel software di imaging appropriato. Selezionare una regione di interesse nella cella con fluorescenza uniforme. Quindi, nella scheda Immagine, selezionare Pile e Traccia profilo asse Z.

Tracciare il profilo dell'asse z Intensità media di fluorescenza misurata nella regione di interesse con la funzione degli angoli sull'asse x. Qualsiasi valore di angolo sull'asse x, superiore all'angolo critico, può quindi essere utilizzato durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF. Successivamente, nel software di acquisizione in tempo reale, utilizzare l'editor di protocollo per impostare i parametri dell'acquisizione.

Compreso il numero di sequenze di acquisizione del loop, i canali fluorescenti e la loro intensità laser, l'angolo TIRF e il tempo di esposizione. Imposta il movimento Z dell'obiettivo per raggiungere il piano della modalità di epifluorescenza. Quindi, in modalità epifluorescenza, impostare l'angolo TIRF su 1 e lo spostamento Z dell'obiettivo sul piano TIRF.

Quindi, ottenere un'immagine della cella in modalità LED a luce intensa. Ora, trova una cellula di interesse con un livello moderato di espressione proteica marcata in fluorescenza, impegnata nella fagocitosi con un SRBC, e sposta la cellula al centro del campo. Si noti che una tale cellula può essere identificata da una membrana plasmatica estesa attorno alla particella.

Immettere il numero di fotogrammi nella scheda Conteggio loop per avviare un'acquisizione in streaming da 500 a 1.000 fotogrammi. Se necessario, modificare l'intensità del laser e il tempo di esposizione per adattarli ai diversi livelli di fluorescenza nella cellula. Per generare due sequenze di immagini separate corrispondenti ai due canali, aprire le sequenze nel software imagine e fare clic sulla scheda Immagine.

Nel menu Hyperstack, seleziona Stack to Hyperstack. Quindi, nella finestra pop-up, inserisci xyctz per l'Ordine, il numero di fluorocromi utilizzati per i Canali, il numero di Fette sull'asse z, il numero di immagini diviso per il numero di canali in Fotogrammi e Scala di grigi per la Modalità di visualizzazione. Quindi, dividi i canali.

Qui, viene mostrato un filmato rappresentativo al microscopio TIRF su cellule vive di un saggio di chiusura del fagosoma in 264.7 macrofagi grezzi che inghiottono un SRBC opsonizzato IGG. Poiché le punte degli pseudopodi si oppongono al vetrino coprioggetti attorno all'SRBC, viene rilevato un anello di F-actina nell'area TIRF che si restringe progressivamente fino a chiudersi. Parallelamente, il segnale sfocato di F-actina rilevato dall'epifluroescenza, dopo aver spostato lo stadio di tre micron sopra l'area TIRF, corrisponde alla depolimerizzazione alla base della coppa fagocitica.

Dopo tre minuti, l'SRBC è totalmente internalizzato, come confermato dall'imaging a luce trasmessa. Utilizzando questo metodo, può essere dimostrata la presenza di actina alla base della coppa fagocitaria dove si verifica l'esocitosi focale dei compartimenti intracellulari. Dopo la sua acquisizione, una cellula può essere ulteriormente processata per la microscopia elettronica correlata, oppure l'intera popolazione cellulare può essere fissata e congelata per la microscopia a immunofluorescenza classica.

È importante tenere presente che la fagocitosi è molto sensibile alla temperatura e, pertanto, la temperatura all'interno della camera di riscaldamento e del terreno di coltura deve essere mantenuta a una temperatura costante di 37 gradi Celsius durante tutta la procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come opsonizzare le particelle, rivestire i vetrini coprioggetti con le particelle, determinare gli angoli critici per la microscopia TIRF e visualizzare la localizzazione delle proteine di interesse durante la fagocitosi su cellule vive.