Name: Phagosome chiusura Assay per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri la formazione e la chiusura dei fagosomi in macrofagi vivi utilizzando la microscopia TIRF. Questa tecnica consente di visualizzare in 3D l'estensione dei pseudopodi e la dinamica della membrana plasmatica.

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Ringraziamo il Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Parigi, Francia) per le discussioni iniziali sull'approccio sperimentale e il Dr. Jamil Jubrail per aver letto il manoscritto. Nadège Kambou e Susanna Borreill sono riconosciute per aver condotto esperimenti con il metodo nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del CNRS (Programma ATIP), della Ville de Paris e dell'Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), della Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 inclusa una borsa di dottorato per FMA) a FN, e dell'Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS) inclusa una borsa di dottorato per JM.

Nota: Il plasmide utilizzato Lifeact-mCherry è un gentile dono del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parigi, generato dopo il 17. 1. Cellule e Trasfezione Nota: i macrofagi RAW264.7 coltivati ​​a sub confluenza in terreno completo (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM di sodio piruvato, 50 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina e 10% FCS ( Fetal Calf Serum)) in una piastra a 100 mm. Sono trasfettate con plasmidi che codificano per proteine ​​fluorescenti tag mediante elettroporazione. Ordinariamente circa 5 - 6 x 10 6 cellule vengono trasfettate rispettivamente con 20 mg o 10 mg di plasmide per ogni trasfezione o co-trasfezione. Notare che altri mezzi di trasfezione basato su elettroporazione o lipofezione possono essere utilizzati come approcci alternativi. <ol><li> Raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e risospendere in 10 ml di mezzo di coltura pipettando su e giù diverse volte. </li><li> Centrifuga lasospensione cellulare 300 xg, 5 min a RT in rotore ad angolo di oscillazione. </li><li> Preriscaldare 10 ml di terreno completo supplementato con 10 ug / ml di gentamicina a 37 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di &quot;lavaggio tampone A&quot; dal kit elettroporazione. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare 300 xg, 5 min a temperatura ambiente in rotore ad angolo oscillante. </li><li> Nel frattempo preparare la miscela DNA a temperatura ambiente: 120 microlitri 2x tampone B, 20 pg di plasmide DNA codificante per la proteina di interesse, QSP 240 ml H 2 O. </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare l&#39;intero surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule nella miscela DNA e trasferire nelle cuvette di elettroporazione 4 mm. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Elettroporazione a 250 V, 900 uF. </li><li> risospendere immediatamente le cellule del pre-riscaldato (37 ° C) terreno completo integrato con gentamicina e piastra delm in un piatto a 100 mm. </li><li> Incubare le cellule trasfettate notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> La mattina seguente, sostituire il terreno completo con 10 ml di terreno di microscopia privo di siero (RPMI 1640 senza rosso fenolo, 10 mM HEPES, 1 mM di piruvato di sodio, 50 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina). </li></ol> 2. Opsonizzazione di globuli rossi Nota: Come modello di destinazione di particelle per i macrofagi, le cellule vengono utilizzati pecore sangue rosso (GRP che). Di solito, circa 7 x 10 6 GRP che per 35 millimetri piatto fondo di vetro viene utilizzato. <ol><li> Lavare i GRP che con 100 ml di 1x PBS (tampone fosfato salino) /0.1% BSA (albumina sierica bovina) e centrifugare (600 xg, 4 min). </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le GRP che in 100 ml di 1x PBS / 0.1% BSA e centrifuga (600 xg, 4 min). </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le GRP che in 1x PBS / 0.1% BSA con coniglio IgG anti-GRP chea concentrazioni sub-agglutinante. Utilizzare 500 ml di soluzione contenente anticorpi / 5 ml di GRP che. Nota: La concentrazione sub-agglutinante di anticorpi corrisponde alla concentrazione più bassa che non inducono agglutinazione rilevato come formazione di una rete. In generale, la concentrazione sub-agglutinante è 8,2 ug / ml. <ol><li> Determinare la concentrazione di IgG anti-GRP che necessari per opsonize i GRP che da un test di emoagglutinazione. In serie diluire l&#39;IgG anti-GRP che (azioni a 13,1 mg / ml) tra 1/50 - 1 / 25.600 in una micropiastra. Aggiungere 2 x 10 6 GRP che in ogni pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per diverse ore. </li></ol></li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione lenta. </li><li> Dopo due lavaggi in PBS 1x / 0.1% BSA come descritto sopra, risospendere le GRP che IgG-opsonizzati (IgG) GRP che in media microscopia pre-riscaldato privo di siero (2 ml / piatto). </li></ol> Coating 3. Poli-lisina di vetrini <ol><li> Nel frattempo, Trattare piatti di fondo 35 cristallo mm con 2 ml di 0,01% di poli-L-lisina per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i piatti due volte con 2 ml di PBS 1x. </li></ol> 4. Fissaggio non covalente di GRP che su piatti di vetro di fondo <ol><li> Versare 2 ml della GRP che la sospensione per 35 millimetri di vetro piatto fondo. </li><li> Centrifuga con un rotore oscillante a 500 xg durante 2 minuti su piatti di fondo 35 millimetri di vetro. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare una volta con 2 ml di PBS 1x / 10% BSA. </li><li> Incubare le particelle per 30 minuti con 2 ml di PBS 1x / 10% BSA a piatto. </li><li> Lavare i piatti tre volte con 2 ml di PBS 1x. </li><li> Sostituire 1x PBS con 2 ml di pre-riscaldato (37 ° C) a medio microscopia privo di siero. </li></ol> 5. fagocitosi visualizzati tramite TIRFM <ol><li> Microscopio Nota: TIRFM è stata effettuata utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo ad immersione in olio (N 100X, NA1.49), una camera di riscaldamento con CO 2, e due cantarele telecamere di rilevamento fotoni EMCCD (Electron Moltiplicando Charge Coupled Device) accoppiato con una lente 1,5X. <ol><li> Il giorno prima della sessione del microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento a 37 ° C per consentire un riscaldamento omogeneo del palco microscopio. </li></ol></li><li> Critical Determinazione Angle Nota: il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare i flussi di immagini TIRF. <ol><li> Collocare un bicchiere 35 millimetri piatto inferiore contenente SRBC opsonizzati con terreno privo di siero microscopio sotto il microscopio. </li><li> Raschiare le cellule e risospendere in mezzo prima di aggiungerli (100 - 500 microlitri) nel piatto. </li><li> Utilizzare il software &quot;Live Acquisition&quot; per controllare il microscopio ed eseguire l&#39;eccitazione con una 491 nm e / o di un laser 561 nm per identificare le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti tag. </li><li> Identificare una cella che esprime le proteine ​​fluorescenti tag. </li><li> Posizionare nel centro del campo e acquisire 500 imetà a una lunghezza d&#39;onda di eccitazione, con angoli diversi a partire da 0 ° fino a 5 °, con un incremento di 0,01º (Figura 2A). Gli angoli vengono modificate automaticamente dal sistema microscopio. </li><li> Determinare l&#39;angolo critico permettendo la luce incidente viene riflessa totalmente all&#39;interfaccia vetro / medie e generare l&#39;onda evanescente. Utilizzando il software ImageJ Color Profiler, aprire la sequenza immagine facendo clic su &quot;File&quot;, &quot;Apri&quot; e selezionare il file. </li><li> Selezionare una regione di interesse (ROI), con lo strumento rettangolare nella cella con una fluorescenza uniforme (Figura 2B giallo 1). </li><li> Tracciare il &quot;profilo dell&#39;asse Z&quot; media intensità di fluorescenza misurata nel ROI con la funzione degli angoli sull&#39;asse x cliccando sul tab &quot;immagine&quot;, &quot;Stack&quot; nel menu e &quot;Plot Z profilo&quot; verso il basso (Figura 2B rosso 2). Nota: L&#39;angolo critico è l&#39;angolo che porta al mafluorescenza ximum prima di una brusca diminuzione della fluorescenza. </li><li> Utilizzare qualsiasi valore dell&#39;angolo sul asse x superiore all&#39;angolo critico durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF come esempio 2.00 (Figura 2C). </li></ol></li><li> acquisizioni <ol><li> Utilizzando il software di acquisizione dal vivo, impostare i parametri di acquisizione con il modulo &quot;Protocollo Editor&quot; (Figura 3A). <ol><li> Creare un protocollo con un &quot;loop&quot; che comprende &quot;Canali&quot; Multi acquisizione per acquisire segnale fluorescente da proteine ​​di interesse nella regione TIRF. Inserire l&#39;angolo TIRF (ad esempio 2.00), il tempo di esposizione (ad esempio 50 msec) e l&#39;intensità del laser (ad esempio 50%) (Figura 3B 1). </li><li> Introdurre un &quot;Z mossa&quot; dell&#39;obiettivo del 3 micron al di sopra della regione TIRF per ottenere acquisizione del segnale in epifluorescenza con lo strumento &quot;Multi Channels&quot;. Inserire un angolo in basso tha angolo critico (come ad esempio 1.00), il tempo di esposizione (50 msec) e l&#39;intensità del laser (50%) (Figura 3B, 2 e 3). </li><li> Successivamente aggiungere una &quot;z mossa&quot; dell&#39;obiettivo 3 micron di seguito, per tornare nella regione TIRF (Figura 3B 4). Aggiungere un &#39; &quot;istantanea&quot; della cella a LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5) luce brillante. </li></ol></li><li> Trova una cella di interesse con un moderato livello di espressione della proteina codificata fluorescente che avvia fagocitosi di SRBC estendendo membrana plasmatica intorno alla particella. </li><li> Posizionare nel centro del campo. </li><li> Avviare lo streaming acquisizione di 500 - 1.000 fotogrammi. Nella scheda &quot;numero di loop&quot;, inserire &quot;750 frames&quot; (Figura 3B 1). Nota: il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare i flussi di immagini TIRF. </li><li> Aprire le immagini della sequenza di immagine software J cliccando&quot;File&quot;, &quot;Apri&quot; e scegliere il file. </li><li> Separare i canali facendo clic sulla scheda &quot;Immagine&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; menu a discesa e sulla funzione &quot;Stack per HyperStack&quot;. Completare la finestra apparsa: Ordine: xyctz; Channel (c): numero di canali (es: &quot;2&quot; se si dispone di due fluorocromi); Fette (z): numero di fette in asse z (es: &quot;1&quot; se non vi è alcun movimento nell&#39;asse z); Cornici (t): numero di immagini divise per numero di canali; Modalità di visualizzazione: scala di grigi. Nota: Due sequenze di immagini separati generati, corrispondenti ai due canali differenti. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo sperimentale qui descritto propone un metodo inedito per seguire in tempo reale e in cellule viventi, ad alta risoluzione, la formazione di un fagosoma e in particolare la sua chiusura. Diversi aspetti tecnici devono essere discussi. In primo luogo, il test è molto sensibile alla temperatura. È molto importante controllare che la camera di riscaldamento sia a 37 °C e che tutti i mezzi, i dispositivi o le celle siano mantenuti all'interno della camera per evitare sbalzi di temperatura che potrebbero comprome...

La fagocitosi è una funzione delle cellule importante che inizia con il riconoscimento e vincolante di materiale alla superficie recettori, che poi porta alla internalizzazione e la degradazione del materiale ingerito. Mentre eucarioti unicellulari come il Dictyostelium discoideum e amebe stampo utilizzano fagocitosi per l&#39;alimentazione di batteri, organismi superiori si sono evoluti con le cellule professionali. I macrofagi o cellule dendritiche sono la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in vari tessuti e organi, e sono cruciali per attivare il sistema immunitario adattativo attraverso presentazione dell&#39;antigene e produzione di citochine 1-4. In determinate circostanze fagocitosi può essere eseguita da fagociti non professionali, ad esempio, endoteliali e cellule epiteliali. Questo processo è importante per mantenere l&#39;omeostasi durante lo sviluppo e in età adulta per fatturato tessuto normale e rimodellamento. fagociti Infine, specializzati come le cellule di Sertoli nel testicolo o della retinale cellule epiteliali del pigmento sono estremamente potenti fagociti 5. La formazione di un phagosome cui il degrado di microrganismi o detriti cellulari verifica inizia con il raggruppamento dei recettori fagocitiche sulla superficie della cellula fagocitaria. eventi di segnalazione a valle di seguito il clustering dei recettori opsonic quali recettori Fc (CFR) o integrano recettori (CRS) sono stati ben caratterizzati. Tuttavia, ci sono anche numerosi recettori non opsonic tra cui i recettori Toll-like (TLR), lectine, i recettori del mannosio e recettori scavenger. Questi recettori riconoscono determinanti sulla superficie delle particelle come mannosio o fucosio residui, fosfatidilserina e lipopolisaccaridi 1,6-9. Patogeno o detriti cellulari riconoscimento comporta legandosi e il clustering dei diversi tipi di recettore fagocitosi, che poi portano alla intensa e transitorie rimodellamento actina. In parallelo, esocitosi focale di comparti intracellularits contribuisce al rilascio di tensione della membrana ed è importante per efficiente fagocitosi di particelle più grandi. Gli eventi di segnalazione che portano alla polimerizzazione e la membrana deformazione sono stati sezionati in modelli sperimentali che hanno innescato un singolo recettore fagocitaria. Durante la fagocitosi FCR-mediato, non vi è intenso polimerizzazione actina che viene regolato da piccole GTPasi (Rac, Cdc42). Tra i loro effettori a valle, la proteina sindrome di Wiskott-Aldrich (WASP) porta all&#39;attivazione della proteina actina-Related 2/3 complesso (Arp2 / 3) che nucleates filamenti di actina 1,2,4,10. La produzione locale di fosfatidilinositolo-4, 5-difosfato (PI (4,5) P2) è di fondamentale importanza per la polimerizzazione di actina iniziale che guida la formazione pseudopodio. La sua conversione al PI (3,4,5) P 3 è richiesto per l&#39;estensione e la chiusura pseudopodo phagosome 11. Diversi percorsi contribuiscono alla scomparsa di PI (4,5) P 2. In primo luogo il distacco di fosfatidilinositolo fosfato KinaSES (PIPKIs) dal PI arresti phagosome (4,5) P 2 sintesi. In secondo luogo, può essere fosforilata e consumata per classe I PI3K chinasi (PI3K) e convertito in PI (3,4,5) P 3 12. Un ruolo per fosfatasi e fosfolipasi è stato anche implicato nel PI (4,5) P2 idrolisi e la rimozione di F-actina durante la fagocitosi in cellule di mammifero e in Dictyostelium 13,14. La fosfolipasi C (PLC) δ idrolizza PI (4,5) P2 in diacilglicerolo e inositolo-1,4,5- tris di fosfato. Il OCRL PI (4,5) P2 e PI (3,4,5) P 3 fosfatasi (sindrome oculocerebrorenal di Lowe) è stato anche coinvolto nella formazione phagosome. formazione locale precisa di F-actina e la sua depolimerizzazione è strettamente regolata nello spazio e nel tempo e abbiamo dimostrato che l&#39;assunzione di compartimenti intracellulari è importante per fornire localmente la fosfatasi OCRL, contribuendo così alla depolimerizzazione actina locale alla base della coppa fagocitica <sup&gt; 13,15. Per questo, abbiamo usato il set up sperimentale qui descritto. I giocatori di meccanismo e molecolari necessari per la chiusura phagosome e scissione membrana rimangono poco definiti a causa delle difficoltà di visualizzazione e il monitoraggio del sito di chiusura phagosome. Fino a poco tempo, fagocitosi è stata osservata su cellule fisse o viventi che internalizzano particelle sulla loro faccia dorsale o sui loro lati, rendendo la visualizzazione tempestiva del sito di chiusura phagosome difficile. Inoltre, i metodi di fissaggio potrebbero causare retrazione delle membrane e dei pregiudizi i risultati sul prolungamento pseudopodi e la chiusura. Per contro, il saggio che abbiamo creato e descrivere qui ci permette di visualizzare estensione pseudopodo e la fase di chiusura della fagocitosi in cellule viventi 13, basato sulla microscopia totale interno riflessione (TIRFM) 16. Questa tecnica ottico utilizza un onda evanescente per eccitare fluorofori in un&#39;area sottile all&#39;interfaccia tra un trasparente cosìcoperchio (vetrino) e un liquido (mezzo di coltura cellulare). Lo spessore della profondità eccitazione è circa 100 nm dalla superficie solida, consentendo la visualizzazione di eventi molecolari vicino alla membrana plasmatica. TIRFM permette un alto rapporto segnale-background, e limita la fluorescenza out-of-focus raccolta e la citotossicità a causa di illuminazione di cellule. Approfittando di TIRFM, abbiamo sviluppato il &quot;saggio di chiusura phagosome&quot;, in cui lamelle sono attivati ​​con poli-lisina e poi ricoperto con globuli rossi IgG-opsonizzati (IgG-GRP che). I macrofagi che esprimono proteine ​​fluorescenti transitoriamente tag di interesse sono quindi autorizzati a fagocitare le IgG-GRP che. Mentre le cellule si staccano le particelle di destinazione che non sono a legame covalente alla superficie del vetro, le punte delle pseudopodi possono essere osservati e registrati in modalità TIRF. acquisizioni TIRF sono combinati con acquisizioni in modalità epifluorescenza, dopo aver spostato il micron fase 3 di cui sopra, che consenta la visualization della base della coppa fagocitaria. L&#39;aggiunta di farmaci farmacologici come quelli inibire actina o dynamin durante il processo è anche possibile sezionare ulteriormente il processo a livello molecolare. Il protocollo descritto in dettaglio qui è una linea cellulare di macrofagi murini RAW264.7 e particelle opsonizzati, ma praticamente, può essere adattato a qualsiasi altra cellula fagocitica e con altri obiettivi come perline. Questo metodo consentirà una migliore caratterizzazione del regolamento nel tempo e nello spazio degli attori molecolari coinvolti in estensione pseudopodo e chiusura phagosome durante i vari processi di fagocitosi.

<table><tbody><tr><td>Globuli rossi anti-pecora IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di shock termico dell'albumina sierica bovina, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Sollevatore di celle</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette da 4 mm</td><td>Progetto cella</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Kit elettrotampone</td> a temperatura ambiente <td>Progetto cella</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare trattato TC da 100 mm Corning</td><td></td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro 35 mm non rivestiti 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Custodia</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Obiettivo a immersione in olio (N 100X, NA1.49), camera di riscaldamento con CO2, una fotocamera per il rilevamento di fotoni singoli EMCCD (Electron Dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatrice) e una soluzione</td></tr> di <tr><td>poli-L-lisina</td> per lenti 1,5X 0,1%<td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Diluizione allo 0,01% in acqua&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio GLUTAMAX&nbsp; Integratore</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio, senza rosso fenolo (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Caldo in 37 gradi. C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Globuli rossi di pecora (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conservato in tampone Alsever a 4 gradi C prima dell'uso</td></tr></tbody></table>

&quot;phagosome chiusura assay&quot; per visualizzare phagosome formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente microscopy (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

La fagocitosi è un meccanismo utilizzato da cellule specializzate per internalizzare ed eliminare microrganismi o detriti cellulari. Si basa su profondi riarrangiamenti del citoscheletro di actina che è la forza trainante per l'estensione della membrana plasmatica attorno alla particella. Inoltre, l'inghiottimento efficiente di materiale di grandi dimensioni si basa sull'esocitosi focale dei compartimenti intracellulari. Questo processo è altamente dinamico e numerosi attori molecolari sono stati descritti per avere un ruolo durante la formazione della coppa fagocitica. La regolazione precisa nel tempo e nello spazio di tutte queste molecole, tuttavia, rimane sfuggente. Inoltre, l'ultima fase della chiusura dei fagosomi è stata molto difficile da osservare perché l'inibizione da parte dell'interferenza dell'RNA o dei mutanti negativi dominanti spesso provoca lo stallo della formazione di coppe fagocitiche. 
Abbiamo messo a punto un approccio sperimentale dedicato utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) combinata con l'epifluorescenza per monitorare passo dopo passo l'estensione degli pseudopodi e delle loro punte in un fagosoma che cresce attorno a una particella debolmente legata a un vetrino coprioggetti. Questo metodo ci permette di osservare, ad alta risoluzione, le punte stesse degli pseudopodi e la loro fusione durante la chiusura del fagosoma in cellule viventi per due diverse proteine marcate in fluorescenza allo stesso tempo.

Il sistema sperimentale descritto in questo manoscritto è schematicamente rappresentata in figura 1. Macrofagi transfettati RAW264.7 esprimono le proteine ​​di interesse fusa a un tag fluorescenti vengono posti a contatto con eritrociti di pecora IgG-opsonizzati (GRP che) che erano non covalentemente fissa sul vetrino. I macrofagi possono staccare il SRBC dal vetrino di inghiottire esso. Il microscopio TIRF utilizzata permette l&#39;acquisizione contemporanea di segnali ...

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è visualizzare la formazione del fagosoma, nonché il sito preciso della scissione del fagosoma in 3D, all'interno di macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione totale interna, o microscopia TIRF. Questo metodo combina la microscopia TIRF con l'epifluorescenza per monitorare passo dopo passo la localizzazione di due diverse proteine fluorescenti durante l'estensione dei pseudopodi e la fusione delle loro estremità. La tecnica fornisce un metodo sistematico per determinare l'angolo critico e ottenere un segnale TIRF, essenziale per trarre conclusioni riguardo alle strutture poste in prossimità della membrana plasmatica.Il giorno prima della sessione al microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento portandola a 37 gradi Celsius per consentire un riscaldamento omogeneo della piastra del microscopio. La mattina seguente, utilizzare 100 microlitri di PBS, integrati con 0,1% di BSA, per lavare due volte 7x10 alla sesta cellule rosse di pecora o SRBC per ogni piastra da 35 millimetri con fondo in vetro. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule in 500 microlitri di IgG di coniglio anti-SRBC, a una concentrazione sub-agglutinante, in PBS integrato con 0,1% di BSA ogni 5 microlitri di cellule, e incubare le cellule per 30 minuti con una rotazione lenta.Al termine dell'incubazione, lavare i globuli rossi di montone due volte in PBS più BSA e risospendere le cellule in 2 millilitri di mezzo microscopico senza siero a 37 gradi Celsius per ogni piastra. Successivamente, trattare le piastre da 35 millimetri con fondo in vetro con 2 millilitri di poli-L-lisina 0,1% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi con 2 millilitri di PBS. Per la fissazione non covalente dei globuli rossi di montone, versare 2 millilitri delle cellule opsonizzate con IgG in ciascuna delle piastre rivestite con polilisina e centrifugare i campioni in una centrifuga con rotore oscillante.Eliminare i soprannatanti e lavare le particelle una volta con 2 millilitri di PBS contenente il 10% di BSA. Successivamente, incubare le particelle con 2 millilitri di PBS fresco contenente il 10% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente, seguita da tre lavaggi con 2 millilitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con 2 millilitri di mezzo microscopico senza siero, a 37 gradi Celsius.Posizionare una piastra rivestita con SRBC sul palchetto del microscopio. Quindi, raschiare le cellule trasfettate di interesse dal fondo della piastra di coltura e pipettare le cellule alcune volte per ottenere una sospensione di singole cellule. Aggiungere le cellule trasfettate alla piastra rivestita con SRBC.Avviare il software di acquisizione in tempo reale. Individuare una cellula che esprime le proteine marcate con fluorescenza e regolare la posizione della piastra in modo che la cellula di interesse si trovi al centro del campo. Acquisire 500 immagini a diversi angoli, da zero a 5%, con incrementi di 0,01 gradi, a una lunghezza d'onda di eccitazione.Per determinare l'angolo critico per cui la luce incidente viene totalmente riflessa all'interfaccia vetro-mezzo e generare un'onda evanescente, aprire la sequenza di immagini nel software di imaging appropriato. Selezionare una regione di interesse nella cellula con fluorescenza uniforme. Successivamente, sotto la scheda Immagine, selezionare Stacks e Profilo Asse Z.Per tracciare il profilo dell'intensità media della fluorescenza lungo l'asse z, misurata nella regione di interesse, in funzione degli angoli sull'asse x. Qualsiasi valore di angolo sull'asse x superiore all'angolo critico può quindi essere utilizzato durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF. Successivamente, nel software di acquisizione in tempo reale, utilizzare l'editor di protocollo per impostare i parametri dell'acquisizione.Includere il numero di sequenze di acquisizione del loop, i canali fluorescenti e l'intensità del loro laser, l'angolo TIRF e il tempo di esposizione. Impostare lo spostamento Z dell'obiettivo per raggiungere il piano della modalità epifluorescenza. Quindi, in modalità epifluorescenza, impostare l'angolo TIRF a 1 e lo spostamento Z dell'obiettivo nuovamente sul piano TIRF.Quindi, acquisire un'immagine della cellula in modalità LED a luce brillante. Ora, individuare una cellula di interesse con un livello moderato di espressione della proteina marcata con fluorescenza, impegnata nella fagocitosi di un globulo rosso (SRBC), e spostare la cellula al centro del campo. Si noti che tale cellula può essere identificata da una membrana plasmatica estesa attorno alla particella.Immettere il numero di fotogrammi nella scheda Loop Count per avviare un'acquisizione in streaming di 500-1.000 fotogrammi. Se necessario, modificare l'intensità del laser e il tempo di esposizione per adattarli ai diversi livelli di fluorescenza nella cellula. Per generare due sequenze di immagini separate corrispondenti ai due canali, aprire le sequenze nel software di imaging e fare clic sulla scheda Image.Nel menu Hyperstacks, selezionare Stack a Hyperstack. Quindi, nella finestra di pop-up, inserire xyctz per l'Ordine, il numero di fluorocromi utilizzati per i Canali, il numero di Fette lungo l'asse z, il numero di immagini diviso per il numero di canali sotto Frame e Scala di grigi per la Modalità di visualizzazione. Successivamente, separare i canali.Qui viene mostrato un filmato rappresentativo al microscopio TIRF su cellule vive di un saggio di chiusura del fagosoma in macrofagi RAW 264.7 che inglobano un globulo rosso opsonizzato con IgG. Mentre le estremità dei pseudopodi opposti al vetrino attorno al globulo rosso si avvicinano, viene rilevato un anello di F-actina nell'area TIRF che si restringe progressivamente fino alla chiusura. Parallelamente, il segnale sfocato di F-actina rilevato mediante epifluorescenza, dopo aver spostato lo stadio di tre micron al di sopra dell'area TIRF, corrisponde alla depolimerizzazione alla base della coppa fagocitica.Dopo tre minuti, i globuli rossi di montone (SRBC) sono completamente internalizzati, come confermato dall'immagine in luce trasmessa. Utilizzando questo metodo, è possibile dimostrare la presenza di actina alla base della coppa fagocitica, dove avviene l'esocitosi focale dei compartimenti intracellulari. Dopo l'acquisizione, una cellula può essere ulteriormente processata per microscopia elettronica correlativa, oppure l'intera popolazione cellulare può essere fissata e congelata per essere processata successivamente per microscopia a immunofluorescenza classica.È importante tenere presente che la fagocitosi è molto sensibile alla temperatura e, pertanto, la temperatura all'interno della camera di riscaldamento e del mezzo nel piatto di coltura deve essere mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius per tutta la durata della procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come opsonizzare le particelle, ricoprire i coverslip con le particelle, determinare gli angoli critici per la microscopia TIRF e acquisire immagini sulla localizzazione delle proteine di interesse durante la fagocitosi in cellule vive.

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Questo video descrive TIRF, una tecnica basata sulla microscopia a riflessione interna totale per visualizzare le dinamiche di polimerizzazione dell'actina e dei microtubuli. Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle dinamiche di accoppiamento tra actina e microtubuli in tempo reale, che è essenziale per comprendere i crosstalk cellulari.

Microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento di actina e microtubuli

Questo video mostra una tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) ad alta risoluzione per la visualizzazione in tempo reale della formazione e della chiusura dei fagosomi durante la fagocitosi mediata dai macrofagi dei globuli rossi (RBC) opsonizzati da IgG attaccati alla superficie di un piatto con fondo di vetro. I macrofagi estendono gli pseudopodi attorno ai globuli rossi e li inghiottono all'interno dei fagosomi, staccandoli dalla superficie del vetro.

Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Fonte: Daniele, F., et. al Sonde TIRFM e GFP sensibili al pH per valutare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y: imaging cellulare e analisi dei dati. J. Vis. Exp. (2015). Questo video mostra l'imaging di cellule di neuroblastoma umano utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare vescicole sinaptiche marcate con fluorofori. Le cellule vengono prima focalizzate in modalità epifluorescenza.

Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per la visualizzazione di eventi esocitici nei neuroni corticali. Un marcatore di proteina fluorescente verde (GFP) sensibile al pH emette fluorescenza dopo la fusione delle vescicole, con eccitazione...

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici 

Basato polarizzazione-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) permette un rilevamento in tempo reale della dinamica della membrana cellulare. Questo articolo descrive l'implementazione di pTIRFM per lo studio della membrana rimodellamento durante l'esocitosi regolata. La tecnica è generalizzabile ad altri processi in biologia cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente cambiamenti di forma della membrana.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Scopri la formazione e la chiusura dei fagosomi in macrofagi vivi utilizzando la microscopia TIRF. Questa tecnica consente di visualizzare in 3D l'estensione dei pseudopodi e la dinamica della membrana plasmatica.

Phagosome chiusura Assay per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM) (Video) | JoVE Journal

"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

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