"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

L'obiettivo generale di questo protocollo è visualizzare la formazione del fagosoma, nonché il sito preciso della scissione del fagosoma in 3D, all'interno di macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione totale interna, o microscopia TIRF. Questo metodo combina la microscopia TIRF con l'epifluorescenza per monitorare passo dopo passo la localizzazione di due diverse proteine fluorescenti durante l'estensione dei pseudopodi e la fusione delle loro estremità. La tecnica fornisce un metodo sistematico per determinare l'angolo critico e ottenere un segnale TIRF, essenziale per trarre conclusioni riguardo alle strutture poste in prossimità della membrana plasmatica.

Il giorno prima della sessione al microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento portandola a 37 gradi Celsius per consentire un riscaldamento omogeneo della piastra del microscopio. La mattina seguente, utilizzare 100 microlitri di PBS, integrati con 0,1% di BSA, per lavare due volte 7x10 alla sesta cellule rosse di pecora o SRBC per ogni piastra da 35 millimetri con fondo in vetro. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule in 500 microlitri di IgG di coniglio anti-SRBC, a una concentrazione sub-agglutinante, in PBS integrato con 0,1% di BSA ogni 5 microlitri di cellule, e incubare le cellule per 30 minuti con una rotazione lenta.

Al termine dell'incubazione, lavare i globuli rossi di montone due volte in PBS più BSA e risospendere le cellule in 2 millilitri di mezzo microscopico senza siero a 37 gradi Celsius per ogni piastra. Successivamente, trattare le piastre da 35 millimetri con fondo in vetro con 2 millilitri di poli-L-lisina 0,1% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi con 2 millilitri di PBS. Per la fissazione non covalente dei globuli rossi di montone, versare 2 millilitri delle cellule opsonizzate con IgG in ciascuna delle piastre rivestite con polilisina e centrifugare i campioni in una centrifuga con rotore oscillante.

Eliminare i soprannatanti e lavare le particelle una volta con 2 millilitri di PBS contenente il 10% di BSA. Successivamente, incubare le particelle con 2 millilitri di PBS fresco contenente il 10% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente, seguita da tre lavaggi con 2 millilitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con 2 millilitri di mezzo microscopico senza siero, a 37 gradi Celsius.

Posizionare una piastra rivestita con SRBC sul palchetto del microscopio. Quindi, raschiare le cellule trasfettate di interesse dal fondo della piastra di coltura e pipettare le cellule alcune volte per ottenere una sospensione di singole cellule. Aggiungere le cellule trasfettate alla piastra rivestita con SRBC.

Avviare il software di acquisizione in tempo reale. Individuare una cellula che esprime le proteine marcate con fluorescenza e regolare la posizione della piastra in modo che la cellula di interesse si trovi al centro del campo. Acquisire 500 immagini a diversi angoli, da zero a 5%, con incrementi di 0,01 gradi, a una lunghezza d'onda di eccitazione.

Per determinare l'angolo critico per cui la luce incidente viene totalmente riflessa all'interfaccia vetro-mezzo e generare un'onda evanescente, aprire la sequenza di immagini nel software di imaging appropriato. Selezionare una regione di interesse nella cellula con fluorescenza uniforme. Successivamente, sotto la scheda Immagine, selezionare Stacks e Profilo Asse Z.

Per tracciare il profilo dell'intensità media della fluorescenza lungo l'asse z, misurata nella regione di interesse, in funzione degli angoli sull'asse x. Qualsiasi valore di angolo sull'asse x superiore all'angolo critico può quindi essere utilizzato durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF. Successivamente, nel software di acquisizione in tempo reale, utilizzare l'editor di protocollo per impostare i parametri dell'acquisizione.

Includere il numero di sequenze di acquisizione del loop, i canali fluorescenti e l'intensità del loro laser, l'angolo TIRF e il tempo di esposizione. Impostare lo spostamento Z dell'obiettivo per raggiungere il piano della modalità epifluorescenza. Quindi, in modalità epifluorescenza, impostare l'angolo TIRF a 1 e lo spostamento Z dell'obiettivo nuovamente sul piano TIRF.

Quindi, acquisire un'immagine della cellula in modalità LED a luce brillante. Ora, individuare una cellula di interesse con un livello moderato di espressione della proteina marcata con fluorescenza, impegnata nella fagocitosi di un globulo rosso (SRBC), e spostare la cellula al centro del campo. Si noti che tale cellula può essere identificata da una membrana plasmatica estesa attorno alla particella.

Immettere il numero di fotogrammi nella scheda Loop Count per avviare un'acquisizione in streaming di 500-1.000 fotogrammi. Se necessario, modificare l'intensità del laser e il tempo di esposizione per adattarli ai diversi livelli di fluorescenza nella cellula. Per generare due sequenze di immagini separate corrispondenti ai due canali, aprire le sequenze nel software di imaging e fare clic sulla scheda Image.

Nel menu Hyperstacks, selezionare Stack a Hyperstack. Quindi, nella finestra di pop-up, inserire xyctz per l'Ordine, il numero di fluorocromi utilizzati per i Canali, il numero di Fette lungo l'asse z, il numero di immagini diviso per il numero di canali sotto Frame e Scala di grigi per la Modalità di visualizzazione. Successivamente, separare i canali.

Qui viene mostrato un filmato rappresentativo al microscopio TIRF su cellule vive di un saggio di chiusura del fagosoma in macrofagi RAW 264.7 che inglobano un globulo rosso opsonizzato con IgG. Mentre le estremità dei pseudopodi opposti al vetrino attorno al globulo rosso si avvicinano, viene rilevato un anello di F-actina nell'area TIRF che si restringe progressivamente fino alla chiusura. Parallelamente, il segnale sfocato di F-actina rilevato mediante epifluorescenza, dopo aver spostato lo stadio di tre micron al di sopra dell'area TIRF, corrisponde alla depolimerizzazione alla base della coppa fagocitica.

Dopo tre minuti, i globuli rossi di montone (SRBC) sono completamente internalizzati, come confermato dall'immagine in luce trasmessa. Utilizzando questo metodo, è possibile dimostrare la presenza di actina alla base della coppa fagocitica, dove avviene l'esocitosi focale dei compartimenti intracellulari. Dopo l'acquisizione, una cellula può essere ulteriormente processata per microscopia elettronica correlativa, oppure l'intera popolazione cellulare può essere fissata e congelata per essere processata successivamente per microscopia a immunofluorescenza classica.

È importante tenere presente che la fagocitosi è molto sensibile alla temperatura e, pertanto, la temperatura all'interno della camera di riscaldamento e del mezzo nel piatto di coltura deve essere mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius per tutta la durata della procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come opsonizzare le particelle, ricoprire i coverslip con le particelle, determinare gli angoli critici per la microscopia TIRF e acquisire immagini sulla localizzazione delle proteine di interesse durante la fagocitosi in cellule vive.