La fusione assoluta e relativa PCR quantitativa dei dati per quantificare STAT3 Splice Variant Trascrizioni

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare le proporzioni e i livelli assoluti dei trascritti delle varianti di splicing STAT3 negli eosinofili. Questo metodo può affrontare questioni chiave nel campo della regolazione dello splicing, come la coassociazione di eventi di splicing distale e l'identificazione di condizioni che possono causare proporzioni di splicing in tandem diverse. Il vantaggio principale di questa tecnica sono gli standard plasmidici che consentono l'acquisizione di dati qPCR assoluti e relativi in modo da poter determinare le proporzioni e i livelli complessivi di quattro trascritti STAT3.

Nel nostro caso desideriamo capire come le quattro varianti di STAT3 S alfa, S beta, delta S alfa e delta S beta cambiano quando gli eosinofili sono stimolati dalle citochine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla composizione degli eosinofili STAT3, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule per i quali è possibile ottenere il cDNA. Poiché S e delta S variano in soli tre nucleotidi, abbiamo dovuto sacrificare l'efficienza per ottenere la specificità in entrambi gli standard standard per ciascuna variante.

In questo protocollo, il cDNA preparato da eosinofili umani viene utilizzato come modello per amplificare le varianti di splicing di STAT3. Dopo aver creato i plasmidi come descritto nel protocollo di testo, preparare le reazioni di sequenziamento per il sequenziamento dei plasmidi da diverse colonie. Ogni reazione da 20 microlitri dovrebbe contenere tre microlitri di tampone di reazione di sequenziamento, due microlitri di miscela di reazione di sequenziamento, 12 microlitri di acqua ultrapura, un microlitro di plasmide e due microlitri di primer di sequenziamento.

Quando i risultati del sequenziamento sono disponibili, valutare gli elettroforetogrammi dei plasmidi che codificano per ciascuna variante; S alfa, S beta, delta S alfa e delta S beta. Misura la concentrazione di DNA plasmidico puro in nanogrammi per microlitro e calcola il numero di copie per microlitro. Iniziare questa procedura preparando una serie di diluizioni su 10 dei plasmidi STAT3 utilizzando acqua ultrapura.

Con circa 10 all'ottavo a 10 al terzo esemplare per microlitro. Misurare la concentrazione del campione più concentrato. Utilizzare i plasmidi diluiti per preparare quattro miscele non target come controlli negativi per ogni variante di splicing da 10 a 6 copie per microlitro per ogni variante.

Preparare una miscela target con concentrazioni uguali di tutti e quattro i modelli, ciascuno da 10 a sesta copia per microlitro. Preparare le soluzioni di coppia di primer per ogni variante di giunzione con 60 microlitri di primer, ciascuno a una concentrazione di sette micromolari, per una concentrazione finale di 560 nanomolari nel campione. Diluire la DNA polimerasi, miscela di colorante legante il DNA a doppio filamento, da sette a cinque con acqua pura.

Impostare il test in una piastra PCR a 96 pozzetti seguendo questo modello. Per prima cosa aggiungere a ciascun pozzetto 21 microlitri di DNA polimerasi diluita, miscela di colorante legante il DNA a doppio filamento. Quindi aggiungere due microlitri di miscela di primer e due microlitri di dima.

Ad ogni pozzetto di controllo senza modello aggiungere due microlitri di acqua filtrata al posto del modello. Impostare le reazioni in duplicato per valutare la ripetibilità. Sigillare la piastra qPCR con un coperchio adesivo e centrifugare per cinque minuti a 1.200 g a 12 gradi Celsius.

Accendere la macchina qPCR e inserire la piastra qPCR sigillata. Se si utilizza il sistema ABI real-time PCR, impostare l'esperimento come dimostrato. Fare clic su File, Nuovo, Avanti, selezionare il nuovo rilevatore, quindi fornire un nome e scegliere un Reporter e un Quencher.

Impostare un nuovo rilevatore per ogni variante di giunzione. Selezionare Avanti e impostare gli standard come richiesto nella pagina Impostazione piastra campione assicurandosi che le quantità siano inserite nella tabella e che siano selezionati i rivelatori appropriati. Fare clic su Fine.

Impostare il programma di ciclismo PCR appropriato. Assicurarsi che la lettura della fluorescenza per determinare i valori del ciclo di soglia avvenga durante la fase di 72 gradi Celsius di ciascun ciclo. Seleziona Esegui.

Al termine dell'esecuzione, fare clic sulla scheda Risultati scheda Grafico di amplificazione. Valutare il grafico di amplificazione dell'output per valutare la qualità dei dati. Un grafico esponenziale indica un'amplificazione affidabile.

Esporta i risultati in un software per fogli di calcolo. L'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo è fondamentale per sapere se il test richiede un'ulteriore ottimizzazione ai fini della riproducibilità. Il cDNA per questo test è preparato da eosinofili trattati con citochine per promuovere la trascrizione.

Preparare diluizioni seriali di due aliquote di cDNA campione con un intervallo di diluizione da uno a uno su 1,024. Impostare il test in una piastra a 96 pozzetti con reazioni da 25 microlitri, come dimostrato per l'analisi della specificità del primer, ma con diverse concentrazioni di primer per pan STAT3 e un gene di housekeeping GUSB. In questa tabella viene mostrato un modello.

Inserire la piastra PCR sigillata nella macchina qPCR. Impostare l'esperimento utilizzando il software, aggiungendo un nuovo rivelatore per GUSB e utilizzando il programma di ciclo PCR appropriato. Successivamente, i risultati vengono utilizzati per calcolare il valore del ciclo di soglia per ciascun campione, come descritto nel protocollo di testo.

Per iniziare questa procedura, confrontare i valori del ciclo di soglia ottenuti nella qPCR relativa per il gene GUSB e diluire il cDNA di conseguenza con acqua ultrapura per garantire che tutte le concentrazioni rientrino in un ordine di grandezza. Impostare i saggi qPCR assoluti dei campioni in piastre a 96 pozzetti. Segui questo modello per S alfa e S beta e questo modello per delta S alfa e delta S beta.

Eseguire i test come mostrato in precedenza e ripetere i test almeno una volta. Successivamente, impostare una piastra qPCR assoluta a 96 pozzetti con reazioni da 25 microlitri utilizzando primer pan STAT3 a 400 micromolari e una miscela di tutti e quattro i plasmidi o un singolo plasmide seguendo questo modello. Sigillare la piastra qPCR con un coperchio adesivo e centrifugare per cinque minuti a 1.200 g a 12 gradi Celsius.

Inserire la piastra PCR sigillata nella macchina qPCR e impostare l'esperimento come mostrato in precedenza aggiungendo un nuovo rivelatore per pan STAT3. Impostare gli stessi parametri di ciclo della qPCR relativa. Dopo aver ripetuto il test almeno una volta, analizzare i risultati come descritto nel protocollo di testo.

I dati qPCR di buona qualità genereranno un grafico di amplicazione sigmoidale che indica un aumento esponenziale delle trascrizioni nel corso del ciclo. Questi dati sono stati ottenuti dalla qPCR di due diluizioni seriali di plasmidi contenenti STAT3 S alfa. Ogni coppia di linee colorate rappresenta i livelli di fluorescenza dei campioni diluiti duplicati nel corso di 40 cicli.

Le curve standard generate per i plasmidi del calibratore stampo indicheranno l'efficienza dell'amplificazione. In questa curva per STAT3 S alfa l'efficienza di amplificazione è stata dell'83,9%Al fine di valutare la congruenza dei livelli di STAT3, sono stati misurati i valori assoluti di ciascuna delle quattro varianti di splicing e il livello di STAT3 totale. Idealmente, sia la regressione lineare che la pendenza dovrebbero essere vicine a uno.

I dati assoluti della qPCR sono presentati come grafici a torta per mostrare le loro proporzioni delle quattro varianti di splicing STAT3 nel corso del trattamento con citochine. La fusione dei dati assoluti e relativi della qPCR ha dimostrato che i livelli di tutte le varianti di splicing STAT3 aumentavano dopo la stimolazione con le citochine IL3 e TNF alfa con picchi a sei ore. La messa in comune dei dati provenienti da tutti i punti temporali ha rivelato una piccola ma significativa distorsione per la coassociazione degli eventi di splicing beta e delta S.

Una volta ottimizzati, i saggi basati su questa tecnica possono essere eseguiti in quattro ore se eseguiti correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di lavorare in condizioni sterili per prevenire la contaminazione. Le decisioni di splicing che includono o escludono un codone rappresentano il 20% della variazione di splicing nel frame.

Il nostro protocollo dovrebbe essere facilmente adattabile alla quantificazione di tali variazioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha permesso a Mao Zhang di lavorare con il mio gruppo nel gruppo di Li-Shan Rue per controllare gli esperimenti di ri-espressione knockdown delle varianti STAT3 nelle cellule di linfoma ABC. Questi esperimenti hanno dimostrato che un mix di varianti S e delta S è necessario per la sopravvivenza cellulare in coltura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la qPCR assoluta e relativa e delle condizioni appropriate per distinguere e quantificare le sottili differenze di splicing.