Name: Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Impara a indurre la trombosi con cloruro ferrico nel modello murino dell'arteria carotidea e mesenterica. Questa tecnica di microscopia intravivente permette di studiare l'attivazione piastrinica e valutare farmaci anticoagulanti.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) del National Institutes of Health con i numeri di premio R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) e R01 HL098217 (PI: Nieman). Il contenuto di questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Tutte le procedure e le manipolazioni di animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e utilizzo Comitati (IACUC) di The Cleveland Clinic in accordo con gli Stati Uniti la politica di servizio sanitario pubblico sulla cura umana e all&#39;uso degli animali, e la Guida NIH per la cura e L&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Preparazione: <ol><li> Colorante fluorescente per l&#39;etichettatura Piastrine <ol><li> Preparare rodamina 6G soluzione, 0,5 mg / ml, in soluzione fisiologica e sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtro. </li></ol></li><li> FeCl 3 Soluzione <ol><li> Fare un magazzino soluzione fresca del 30% FeCl 3 (anidro, è uguale a 1,85 m) in acqua pura, e filtrare con 0,45 micron filtro. Preparare 5 ml fresca FeCl 3 soluzione alla concentrazione desiderata [ad esempio, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) e 12,5% (0,771 M)] di diluendo la soluzione al 30% FeCl 3 con i waterna 6 centimetri piatto di coltura di tessuti e tenere il coperchio chiuso. NOTA: Usando il piatto cultura rende più facile per prendere la carta da filtro saturato con FeCl 3 soluzione che raccoglierlo da un contenitore stretto, come ad esempio una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. FeCl3 è estremamente pericolosa e che le precauzioni, come ad esempio indossare guanti e camice da laboratorio, ecc, dispositivi di protezione individuale, dovrebbe sempre essere presa. </li></ol></li><li> Carte da filtro <ol><li> Tagliare la carta da filtro a 1 mm x 2 mm Dimensioni. Impregna abbastanza pezzi di carta filtro taglia nella soluzione FeCl 3 nello stesso piatto. </li></ol></li><li> Papaverine cloridrato Soluzione <ol><li> Preparare la soluzione papaverina cloridrato (25 mg / ml) in acqua e sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtro. </li></ol></li><li> gel <ol><li> Preparare 2% gel in PBS o soluzione salina in 6-pozzetti di coltura tissutale, ~ 1 cm di spessore, e Cut a semicerchio con ~ 3 cm di diametro. </li></ol></li></ol> 2. FeCl 3 Induced carotidea arteriosa Injury Trombosi Modello <ol><li> Procedure chirurgiche per il modello Trombosi <ol><li> Utilizzare 8 - 12 settimane di età topi C57Bl6 (o altri ceppi, se necessario). Anestetizzare topi con la miscela di ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. Confermare la profondità dell&#39;anestesia per pizzicare punta. NOTA: Questa quantità di ketamina / xilazina è sufficiente a mantenere l&#39;animale in anestesia stabile e nessun dolore (risposta alla punta pizzicamento) per almeno 1 ora. </li><li> Rimuovere pelliccia sul collo e parte superiore del torace, con un piccolo tagliatore elettrico degli animali. crema depilatoria non è necessario. Applicare neutro unguento oculare petrolio sugli occhi per evitare la secchezza durante l&#39;anestesia. </li><li> Fissare il mouse in posizione supina sul coperchio di 15 cm di piastra di coltura tissutale. Utilizzare un nastro lungo (~ 10 cm) per garantire hind arti e inferiore del corpo, e due pezzi di nastro piccolo (2 centimetri x 0,5 cm) per garantire zampe anteriori. Utilizzare una sutura 4-0 per avvolgere gli incisivi, nastro le due estremità della sutura al coperchio per mantenere il collo del mouse diritta (Figura 2). </li><li> Mettere piatto con la testa del mouse verso l&#39;operatore sotto una fonte di luce chirurgica. </li><li> Sterilizzare il sito chirurgico con tampone imbevuto di alcool. Utilizzare i Micro-Adson pinze per tenere la pelle e utilizzare un paio di forbici chirurgiche per fare una piccola incisione (2-3 mm). </li><li> Tenere la pelle dell&#39;incisione con la pinza e inserire forbici chirurgiche con ganasce chiuse nell&#39;incisione. Spingere le forbici per via sottocutanea verso il manubrio o il mento, e quindi aprire le forbici per liberare la pelle dallo strato sottocutaneo. </li><li> Tagliare la pelle con le forbici chirurgiche per fare una incisione mediana dal manubrio al livello di ioide (Figura 3A e 3B). Senza mezzi termini sezionare la fascia sottile (linea tratteggiata, in <strong&gt; Figura 3B) tra le ghiandole sottomascellari con una multa emostatico e una pinza Graefe (Figura 3B e 3C; frecce blu). NOTA: Il manubrio (freccia nera nella figura 3C) e la trachea (T in Figura 3C) saranno visti dopo questo passo. </li><li> Tenere il tessuto molle e la pelle visto alla destra del manubrio con la pinza Graefe, inserire il emostatico sotto la fascia verso la posizione ore 2 (gialla linea tratteggiata in figura 3C), aprire le ganasce della pinza emostatica per liberare la vena giugulare dal tessuto circostante. </li><li> Tagliare la fascia, tessuti molli e la pelle verso la posizione ore 2 (Figura 3C) con le forbici chirurgiche per esporre la vena giugulare destra (Figura 3D, freccia). </li><li> Disegnare sui 200-300 ml rodamina 6G soluzione utilizzando una siringa da 1 ml con 22 ago G, e quindi il cambiamentoal 30 ago G. NOTA: Questo protegge l&#39;ago 30 G dai danni della sua punta fine. Direttamente disegnare la soluzione rodamina 6G con l&#39;ago 30 G non danneggia la punta; tuttavia toccare la parete del contenitore accidentalmente causerà un danno, che può rendere iniezione difficile. </li><li> Lavare l&#39;ago 30 G lentamente spingendo fuori la soluzione rodamina 6G, assicurarsi che non rimangano bolle d&#39;aria nella siringa o dell&#39;ago. Tenere 100 ml rodamina 6G soluzione iniettabile. </li><li> Bend 2 - 3 mm punta dell&#39;ago ad un angolo di 90 ° con il porta-ago, che impedirà di inserire l&#39;ago troppo profonda alla vena giugulare e rende l&#39;iniezione più facilmente controllato (Figura 3D). </li><li> Iniettare la soluzione rodamina 6G nella vena giugulare destra alle piastrine di etichette. Per stabilizzare la siringa e mantenere l&#39;ago in posizione, tenere la siringa con una mano e l&#39;ago con la pinza Graefe con un&#39;altra mano durante il injection.Afiniezione ter, morsetto il sito di iniezione con la pinza Graefe per evitare il sanguinamento. </li><li> Aprire le ganasce della pinza emostatica e inserirla sotto la pinza Graefe per bloccare la parete del vaso del sito di iniezione, e quindi legare il sito di iniezione con un 6-0 di sutura. NOTA: in alternativa di passo 2.1.15, applicando una pressione al sito di iniezione con un dito per 2 minuti si ferma l&#39;emorragia; Tuttavia, questo metodo ha un rischio di causare ulteriori sanguinamento se il coagulo nel sito di iniezione viene rimossa accidentalmente. </li><li> Senza mezzi termini sezionare il tessuto molle e la fascia intorno alla ghiandola sottomascellare sinistra con la pinza emostatica e la pinza Graefe e tirare la ghiandola verso la posizione delle ore 7 (Figura 3E) per esporre il muscolo sternocleidomastoideo sinistra (freccia blu in figura 3E). </li><li> Senza mezzi termini sezionare la fascia (Figura 3E, linea tratteggiata) tra il muscolo sternocleidomastoideo a sinistra e il muscolo omoioideo o sternohymuscolare OID (Figura 3E, freccia verde) che si trova sul sito di sinistra della trachea con la pinza emostatica. </li><li> Passare un ago con 6-0 sutura di seta (circa 15 cm) sotto il centro del muscolo sternocleidomastoideo (freccia blu nella Figura 3E), inserire le due estremità della sutura ed estrarre la sutura lateralmente verso la posizione ore 10 . NOTA: Questa procedura deve essere eseguita con cura per evitare lesioni della vena giugulare sinistra, che si trova al di fuori del muscolo sternocleidomastoideo. </li><li> Senza mezzi termini separare il sottile muscolo sternoioideo e / o muscolo omoioideo per esporre l&#39;arteria carotide (CA) (Figura 3F freccia) dopo aver tirato via il muscolo sternocleidomastoideo. Tagliare il muscolo sternoioideo e / o muscolo omoioideo se necessario. Utilizzare la pinza emostatica per separare i tessuti molli dal CA senza toccare il CA. NOTA: CA è accompagnata dal nervo vago, la struttura bianca visto in <strong&gt; Figura 3G (freccia verde), e nella maggior parte dei casi è sotto la sottile muscolo sternoioideo e / o muscolo omoioideo (tra le linee tratteggiate gialle in figura 3F). </li><li> Utilizzare una pinza sottile punta a raccogliere la fascia laterale intorno al CA, evitando il nervo vago e CA. Utilizzare un altro pinze punta fine per fare un buco sulla fascia tra la CA e il nervo vago. </li><li> Passare il gancio attraverso il foro e sollevare delicatamente il CA, e quindi posizionare le pinze punta fine sotto la CA. Spostare il gancio e pinze in direzioni opposte lungo il CA per mettere a nudo i tessuti molli avventiziale. Libero di almeno ~ 5 mm di lunghezza di CA (Figura 3H, freccia blu) dal tessuto circostante. </li><li> Per bloccare fluorescenza di fondo, premere l&#39;estremità di un nero di plastica del caffè agitatore piatta, crosscut l&#39;agitatore caffè in un pezzo a 3 mm, e poi tagliare longitudinalmente lungo i bordi piega per ottenere due pezzi di &quot;U&quot; in plastica di forma (Figura 3H, verde freccia). </li><li&gt; Sciacquare un pezzo di questo &quot;U&quot; in plastica di forma con soluzione salina e tenerlo con una pinza e posizionarlo sotto il CA mentre delicatamente sollevare la California, con il gancio (Figura 3H, freccia verde). Applicare immediatamente 2-3 gocce di soluzione salina per evitare l&#39;essiccamento CA. </li></ol></li><li> Il video in tempo reale di registrazione <ol><li> Trasferire il coperchio del mouse e la piastra insieme al palco microscopio e posto in una posizione appropriata sotto la lente d&#39;acqua 10X. Riempire lo spazio tra la lente 10X e il CA con soluzione salina. </li><li> Avviare l&#39;applicazione software digitale di registrazione video, e lanciare un nuovo file e il nome di conseguenza. Registrare le immagini dei vasi normali e annotare il numero di frame quando la registrazione video viene interrotta. NOTA: Fare riferimento al software di registrazione video nel computer per la registrazione. Usiamo software di registrazione video digitale e le seguenti descrizioni sono basati su questa applicazione. NOTA: Dal momento Tra meccanicouma può danneggiare l&#39;endotelio e portare alla formazione di trombi 20, è necessario confermare che non vi è alcun pregiudizio chirurgica alla parete del vaso prima dell&#39;incidente FeCl 3. È anche necessario confermare che non rimane tessuto intorno alla CA, che può formare una barriera ed attenuare l&#39;effetto di FeCl 3 lesioni indotta. Annotare il numero di telaio dei record renderà più facile per analizzare i video secondo tempi trascorsi in seguito. </li><li> Spostare il mouse con il coperchio piatto fuori della lente 10X. Piegare un angolo di un tovagliolo di carta per fare una punta sottile e fine e usarlo per cancellare con attenzione la soluzione salina in tutto il CA (evitare di toccare CA), così come in altri luoghi nel campo chirurgico. Questo è importante per evitare la diluizione della soluzione di FeCl 3 utilizzati. </li><li> Utilizzare una pinza sottile punta e prendere un pezzo di carta da filtro saturato con FeCl 3 soluzione e posizionarlo direttamente sul CA e tenerlo in loco per 1 min. NOTA: To visualizzazione ausilio di sangue e raccolta dati precisi, posizionare la carta da filtro in prossimità dell&#39;estremità distale del esposto CA (Figura 3I) e lasciare un breve segmento nella sede prossimale (freccia verde in figura 3I) per osservare il flusso di sangue al fine fase (vedi sotto). </li><li> Rimuovere la carta da filtro (questo punto di tempo viene definito come l&#39;inizio di &quot;dopo la lesione&quot;) e sciacquare il CA con soluzione salina (almeno 2 ml). </li><li> Mettere il mouse con piastra di coperchio posteriore alla lente 10X; osservare la nave e iniziare a immagini video record. Annotare il numero di frame video alla fine del primo minuto di registrazione. NOTA: La formazione del trombo è identificato da accumulo di piastrine fluorescenti, che si osserva nelle immagini video in tempo reale sullo schermo del computer o al microscopio. immagini registrare video subito dopo aver messo il mouse di nuovo sotto il microscopio. Mantenere registrazione alla fine del primo minuto dopo aver rimosso la fcarta Ilter. Osservare l&#39;intero vaso dal distale ai siti prossimali per ottenere informazioni sulla ferita, e poi concentrarsi sulla zona di interesse (di solito è il centro della zona lesa) per ulteriore imaging. </li><li> Immagini video record per 10 secondi ogni minuto per i primi 10 min (ad esempio, 2:55-03:05) e quindi 10 secondi ogni minuto fino alla fine dell&#39;esperimento. Scrivi i numeri di telaio quando ogni registrazione viene arrestata. NOTA: i punti finali del modello sono: 1) quando il flusso di sangue è cessato per&gt; 30 sec; o 2) se l&#39;occlusione non è visto in 30 min dopo la lesione. In questo caso, utilizzare 30 min per l&#39;analisi statistica. Tempo di esposizione impostato del record video come 10 msec all&#39;inizio, quindi sarà facile osservare il flusso di sangue nel trombi. Quando i trombi diventano grandi e la fluorescenza satura sensore della fotocamera, diventa difficile individuare il flusso di sangue nel corso trombi. Per risolvere questo problema, spostare l&#39;ce l&#39;imagingnter al sito illeso prossimale (Figura 3I, freccia verde), dove il flusso di sangue può ancora osservare chiaramente. Aumentiamo anche la Esporre tempo di 15 o 20 msec quando concentrandosi sul prossimale un site-feriti, in modo che il flusso di sangue può essere osservato più chiaramente. Quando il flusso di sangue cesserà, numerose cellule più grandi (leucociti) cominciano a rotolare sulla parete del vaso nel sito prossimale del trombo. Flusso arresta solitamente entro 2 - 3 min dopo la comparsa delle grandi cellule. Annotare il Esporre tempo sul foglio di registrazione se è cambiato. Richiede solitamente circa 30 minuti dall&#39;anestesia alla fine dell&#39;esperimento, se sono stati utilizzati i normali topi wild type C57BL6. ATTENZIONE NOTA: non utilizzare il bianco coagulo di piastrine aggregate come il segno della cessazione del flusso sanguigno, che non darà un dati accurati ed è influenzato dal tempo di esposizione. Il coagulo bianco coperto lume del vaso non significa flusso di sangue cessato (vedere il video rappresentante 1). </li><li&gt; Alla fine dell&#39;esperimento, i topi eutanasia mediante overdose di ketamina / xylazina (200/20 mg / Kg), seguita da dislocazione cervicale dopo aver confermato senza respiro e battito cardiaco. </li></ol></li></ol> 3. FeCl 3 Induced mesenterica / trombosi venosa modello <ol><li> Anestetizzare 8-12 settimane di età topi C57Bl6 come indicato nella sezione 2.1.1. Applicare veterinario pomata sugli occhi per evitare la secchezza durante l&#39;anestesia. </li><li> Iniettare la soluzione Papaverine (totale 0,4 mg / topo) per via intraperitoneale per inibire peristalsi intestinale. </li><li> Rimuovere pelliccia sul collo e l&#39;addome con un tagliatore elettrico degli animali. crema depilatoria non è necessario. </li><li> Fissare il mouse in posizione supina sul coperchio di 15 cm di piastra di coltura tissutale. Utilizzare quattro pezzi di nastro piccolo (2 centimetri x 0,5 cm) per garantire tutte le gambe. Utilizzare una sutura 4 -0 per avvolgere gli incisivi, nastro le due estremità della sutura al coperchio per mantenere il collo dritto (Figura 2). </li><li> Seguire le procedure 2.1.4 -2.1.15 Per esporre la vena giugulare per l&#39;iniezione di rodamina 6G alle piastrine di etichette. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana attraverso la pelle dal xifoide al basso addome con le forbici chirurgiche (Figura 4A). Sollevare il peritoneo centrale (chiamata anche linea alba, 4A, freccia) con una pinza Graefe, che è chiaro e non ha vasi sanguigni, sollevare circa 2 - 3 mm, confermare senza intestino sotto la linea di taglio, e tagliare il peritoneo aperto longitudinalmente fini forbici (Figura 4B). </li><li> Re-proteggere i topi alla posizione laterale destro. Porre il gel di agarosio semicerchio vicino all&#39;addome e esteriorizzare delicatamente l&#39;intestino e distribuirlo sulla sommità del gel con la pinza Graefe (Figura 4C). Utilizzare il secondo rami per l&#39;esperimento trombosi (Figura 4C, freccia). NOTA: Utilizzare la pinza emostatica o pinze Micro-Adson per contribuire a esteriorizzare l&#39;intestino. Evitare di danneggiare ilintestinale e la nave. </li><li> Posizionare 5 - 6 gocce di soluzione salina per mantenere l&#39;umidità dell&#39;intestino e vaso. Trasferire il mouse con il coperchio piatto insieme al palco microscopio e mettere in posizione appropriata sotto la lente a secco 10X. NOTA: utilizzare una lente asciutta perché la membrana digiuno-ileale non può tenere soluzione salina. Assicurati di cadere soluzione salina sui tessuti esposti a mantenerli umidi. </li><li> Tamponare la soluzione salina intorno all&#39;arteria mesenterica e la vena prima del trattamento. </li><li> Utilizzare una pinza sottile punta a raccogliere un pezzo di carta da filtro saturato con il 12,5% FeCl 3 soluzione e posizionarlo direttamente sul mesenterica e la vena per 1 min (Figura 4D). Rimuovere la carta da filtro (questo punto di tempo viene definito come l&#39;inizio di &quot;dopo la lesione&quot;) e risciacquare l&#39;arteria mesenterica feriti e vena con soluzione salina (almeno 2 ml). </li><li> Mettere il mouse con piastra di coperchio posteriore sotto la lente a secco 10X; osservare i vasi e iniziare a recimmagini video ord come indicato al punto 2.2). NOTA: I punti finali di questo esperimento sono: 1) quando il flusso sanguigno è cessata da&gt; 30 sec; o 2) se l&#39;occlusione non è visto in 30 min dopo la lesione, e in questo caso utilizzare 30 minuti per l&#39;analisi statistica. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, i topi eutanasia mediante overdose di ketamina / xylazina (200/20 mg / Kg), seguita da dislocazione cervicale dopo non respiro e battito cardiaco sono confermate. </li></ol>

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<li>Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+a+model+of+thrombogenesis+induced+by+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Submicrosc+Cytol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury.</a> J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+participates+in+a+signaling+pathway+that+regulates+ROS+formation+in+murine+VSMCs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs.</a> J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).</li>
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<li>Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+monoclonal+antibodies+against+Protease+Activated+Receptor+4+%28PAR4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4).</a> Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).</li>
<li>Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+anionic+region+of+human+protease-activated+receptor+4+inhibits+platelet+aggregation+and+thrombosis+without+interfering+with+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis.</a> J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il modello di FeCl 3 indotta è uno dei modelli più utilizzati trombosi, che possono non solo fornire preziose informazioni modificazioni genetiche sulla funzione piastrinica e la trombosi 7,8,16,19,31-33, ma può anche essere uno strumento prezioso per la valutazione di composti terapeutici e strategie per il trattamento e la prevenzione delle malattie aterotrombotici 11,17,34-37. Qui abbiamo dimostrato le nostre modifiche e perfezionamenti di questo modello e ha mostrato ulteriori prove ...

trombosi arteriosa (coagulo di sangue) è una complicanza comune di molte malattie sistemiche associate a infiammazione cronica, tra cui l&#39;aterosclerosi, il diabete, l&#39;obesità, cancro e patologie reumatologiche autoimmuni croniche. Trombi che si verificano nel gambo circolazione arteriosa da piastrine di attivazione inadeguato, l&#39;aggregazione e successive meccanismi coagulatoria, e sono implicati in attacchi di cuore, ictus e perdita di estremità. La parete del vaso è un sistema complesso che comprende diversi tipi di cellule ed è influenzata da molteplici fattori estrinseci compreso sollecitazione di taglio, le cellule del sangue, ormoni e citochine, così come espressione di proteine ​​antiossidanti circolanti nella parete del vaso. In vitro esperimenti non possono replicarsi questo ambiente complesso e, pertanto, in studi in vivo su modelli animali sono fondamentali per consentire una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nei disordini trombotici. I topi hanno dimostrato di avere simmeccanismi ili per gli esseri umani in termini di trombosi, arteriosclerosi, infiammazione e il diabete 1,2. Inoltre, i topi transgenici e knockout possono essere creati per testare la funzione di prodotti genici specifici in un fisiologico complesso o un ambiente patologico. Tali studi imitano patologia umana e possono fornire importanti informazioni relative al meccanicistico scoperta di nuovi percorsi e terapie, oltre a fornire dettagli importanti nel caratterizzare gli effetti della droga sulla trombosi. Trombi arteriosi patologiche si verificano a causa di lesioni endoteliali strato o disfunzione e l&#39;esposizione del flusso sanguigno alla matrice sottoendoteliale 3,4. Vari modelli trombosi sono stati sviluppati per indurre il danno endoteliale, come lesioni meccaniche, danno ossidativo composto fotoreattivo Rosa Bengala-based e lesioni a laser 5. In questo spettro, cloruro ferrico (FeCl 3) indotta danno vascolare è un modello ampiamente utilizzato di trombosi. Questo reagente quandoapplicata all&#39;aspetto esterno delle navi induce danno ossidativo alle cellule vascolari 6-8, con perdita di protezione delle cellule endoteliali dalle piastrine e componenti della cascata della coagulazione circolante. Il modello di FeCl 3 è semplice e sensibile sia anticoagulanti e antipiastrinici farmaci, ed è stata eseguita su arterie carotidee e femorali, vene giugulari e mesenterici ed arteriole cremasterico e venule nei topi, ratti, cavie e conigli 6-15. Un parametro misurabile in questo modello è il tempo trascorso da un infortunio per completare l&#39;occlusione nave, misurata come la cessazione del flusso sanguigno con un misuratore di portata Doppler o sotto l&#39;osservazione diretta con intravitale 6,7,9 microscopia. Una gamma di volte tra i 5 ei 30 minuti è stato riportato in diversi studi in topi C57Bl6 7-10,16, suggerendo che FeCl 3 concentrazioni, tipi di anestesia, tecniche chirurgiche, l&#39;età del mouse, sfondo genomica, metodo di misurazione Bflusso lood, e di altre variabili ambientali hanno effetti significativi in ​​questo modello. Questa ampia variabilità rende difficile il confronto tra gli studi di diversi gruppi di ricerca e può rendere la rilevazione di sottili differenze difficile. Con una visione per ridurre al minimo tali variabilità e stabilire un modo uniforme e riproducibile nel sistema modello in vivo, abbiamo affinato il modello dell&#39;arteria carotide FeCl 3 indotta che rende i dati altamente riproducibili con minime variazioni 6-10,16-19. In questo lavoro descriviamo e condividere le competenze e riportiamo alcuni esempi rappresentativi sperimentali che possono beneficiare di questo modello.

<table><tbody><tr><td>Forbici chirurgiche - Strumenti di scienza fine in carburo di tungsteno</td><td>&nbsp;</td><td>14502-14</td> Pinza Micro-Adson per <td>taglio e mantenimento della pelle</td></tr><tr><td>- Seghettata/Dritta/12 cm</td><td>Strumenti per la scienza raffinata&nbsp;</td><td>11018-12</td><td>taglia e trattieni la pelle</td></tr><tr><td>Forbici Metzenbaum Fino - Carburo di tungsteno/Curvo/Blunt-Blunt/14,5 cm</td><td>Strumenti per la scienza raffinata&nbsp;</td><td>14519-14&nbsp; &nbsp;</td><td>per sezionare e separare i tessuti molli</td></tr><tr><td>Emostatico ultra fine - Liscio/Curvo/12,5 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>13021-12</td><td>per sezionare e separare i tessuti molli</td></tr><tr><td>Pinze Graefe - Seghettato/Dritto/10 cm</td><td>Strumenti per le scienze fini&nbsp;</td><td>11050-10</td><td>per sezionare e separare i tessuti molli</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Ropeps - Punte per biologia/Dritto/Inox/11 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>Codice 11254-20&nbsp;</td><td>Isolare il vaso dal tessuto circostante</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5XL - Punte standard/Dritte/Inox/15 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11253-10</td><td>Isolare il vaso dal tessuto circostante</td></tr><tr><td>Uncino smussato - 12 cm/0,3 mm Diametro della punta</td><td>Strumenti per la scienza fine&nbsp;</td><td>10062-12</td><td>Isolare il vaso dal tessuto circostante</td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Needle Holders</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12061-02</td><td>Portaaghi</td></tr><tr><td>Filo di sutura 4-0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-40</td><td>Per fissare gli incisivi alla piastra</td></tr><tr><td>Suture Thread 6-0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-60</td><td>Per tutti gli interventi chirurgici e la legatura</td></tr><tr><td>Aghi da sutura Kalt</td><td>Strumenti di scienza fine&nbsp;</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>rodamina 6G&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83697-1G</td><td>Per lebel piastrine</td></tr><tr><td>FeCl3 (Anidro)</td><td>Sigma</td><td>12321</td><td>Per indurre lesioni ai vasi</td></tr><tr><td>Papaverina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>P3510</td><td>Per inibire la peristalsi intestinale.</td></tr><tr><td>Medline Strumento chirurgico Sterilizzazione Vapore Nastri per autoclave</td><td>Medline</td><td>111625</td><td>Per fissare il mouse alla piastra</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Filtri per siringhe - Sterili 0,22 & micro; m</td><td>Fisher</td><td>09-720-004</td><td>Per la sterilizzazione di soluzioni iniettate nei topi</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Filtri per siringhe - Sterili 0,45 & micro; m</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td>Per filtrare la soluzione FeCl3</td></tr><tr><td>Tampone sterile per la preparazione dell'alcol</td><td>Fisher</td><td>06-669-62</td><td>Per sterilizzare il sito chirurgico</td></tr><tr><td>Agarosio&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>Per realizzare il microscopio</td></tr><tr><td>a fluorescenza Leica DMLFS</td> con tavolino <td>in</td> gel, Microscopio Leica <td></td><td>Intravital</td></tr><tr><td>, piattaforma GIBRALTAR e sistema di tavolino X-Y con piastra riscaldante collegata.</td><td>npi electronic GmbH</td><td></td><td>http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html</td></tr><tr><td>Streampix versione 3.17.2 software</td><td>NorPix</td><td></td><td>https://www.norpix.com/</td></tr></tbody></table>

ferrico i modelli murini trombosi indotta da cloruri

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

La trombosi arteriosa (coagulo di sangue) è una complicanza comune di molte malattie sistemiche associate all'infiammazione cronica, tra cui aterosclerosi, diabete, obesità, cancro e disturbi reumatologici autoimmuni cronici. I trombi sono la causa della maggior parte degli attacchi di cuore, ictus e perdita delle estremità, rendendo la trombosi un problema di salute pubblica estremamente importante. Poiché questi trombi derivano da un'inappropriata attivazione piastrinica e dalla successiva coagulazione, il targeting terapeutico di questi sistemi ha un importante significato clinico per lo sviluppo di trattamenti più sicuri. A causa della complessità del sistema emostatico, gli esperimenti in vitro non possono replicare le interazioni sangue-parete vascolare; Pertanto, gli studi in vivo sono fondamentali per comprendere i meccanismi patologici della formazione dei trombi. A tal fine, sono stati sviluppati vari modelli di trombosi nei topi. Tra questi, il danno vascolare indotto da cloruro ferrico (FeCl3) è un modello ampiamente utilizzato di trombosi occlusiva che riporta l'attivazione e l'aggregazione piastrinica nel contesto di un sistema vascolare chiuso asettico. Questo modello si basa sul danno delle cellule endoteliali indotto da redox, che è semplice e sensibile sia ai farmaci anticoagulanti che agli antipiastrinici. Il tempo necessario per lo sviluppo di un trombo che occlude il flusso sanguigno fornisce una misura quantitativa del danno vascolare, dell'attivazione piastrinica e dell'aggregazione che è rilevante per le malattie trombotiche. Abbiamo perfezionato in modo significativo questo modello di trombosi vascolare indotta da FeCl3, che rende i dati altamente riproducibili con variazioni minime. Qui descriviamo il modello e presentiamo dati rappresentativi da diversi set-up sperimentali che dimostrano l'utilità di questo modello nella ricerca sulla trombosi.

Carotide Trombosi Modello Nei topi con C57BL6 sfondo, si consiglia di utilizzare 7,5% FeCl 3 per trattare il vaso per 1 min come punto di partenza. Sotto trattamento del 7,5% FeCl 3, i confini della zona feriti e parete dei vasi normali sono facilmente identificabili al microscopio (vedi video in linea 1), suggerendo che lo strato endoteliale è stata significativamente danneggiata. Il trombi formata subito dopo FeCl 3</s...

Riportiamo una procedura raffinata del cloruro ferrico (FeCl 3) modelli trombosi -indotta sulla carotide e dell&#39;arteria mesenterica così come la vena, caratterizzato in modo efficiente usando la microscopia intravitale per monitorare il tempo di occlusiva la formazione di trombi.

Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è indurre una trombosi mediante cloruro ferrico in un modello di arteria carotidea del topo, al fine di ottenere risultati altamente riproducibili analizzati mediante microscopia intravitale. Questi topi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali su diverse malattie o disturbi genetici associati all'attivazione delle piastrine e all'aggregazione del sistema vascolare chiuso. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella sua semplicità e nella sensibilità sia ai farmaci anticoagulanti che antiaggreganti piastrinici, nonché nella possibilità di combinarla con altre tecniche.Questo metodo può essere utilizzato per ottenere informazioni preziose sulla patofisiologia della trombosi, scoprire nuovi meccanismi e terapie, e valutare gli effetti di farmaci innovativi, inclusa la nanomedicina mirata, sulla trombosi. La visualizzazione di questo metodo è fondamentale per apprendere le strategie necessarie a ottenere un tempo accurato di arresto del flusso sanguigno. Dopo aver verificato l'assenza di risposta alla compressione del dito del piede, utilizzare piccole forbici elettriche per animali per rimuovere il pelo dal collo

ferric-chloride-induced-murine-thrombosis-models

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Il modello di trombosi indotta da FeCl3 nei topi è descritto qui. Viene presentato un metodo per monitorare la crescita dei trombi mediante osservazione al microscopio intravitale su un vaso mesenterico e mediante misurazione del flusso sanguigno nell'arteria carotide.

Cloruro ferrico-indotta Trombosi modello murino sulla carotide e Mesentere Vessel

Qui, presentiamo le modifiche necessarie a un ben caratterizzato e comunemente usato piccolo indotta da cloruro ferrico (FeCl3) dell'arteria carotica ferita modello animale per l'uso in un modello di grande animale ferita vascolare. Il modello risultante può essere utilizzato per la valutazione pre-clinica prova degli interventi farmacologici e meccanici sia profilattici e trombolitici.

Trombosi dell'arteria carotica canini cloruro ferrico-indotta: Un grande modello animale di danno vascolare

Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.

Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D

Questo studio presenta un protocollo per stabilire un modello ratto riproducibile e minimamente invasivo della trombosi del seno sagittale superiore indotta dal cloruro ferrico, utilizzando un metodo di sutura di seta in combinazione con immagini laser a contrasto di speckle e ultrasuoni ad alta risoluzione per la valutazione.

Stabilimento di una trombosi del seno sagittale superiore indotta dal cloruro ferrico modificato

L'induzione elettrolitica di attivazione endoteliale sulla superficie interna della vena cava risultati in formazione tipo trombo venoso a causa di attivazione endoteliale e parziale stasi del sangue, due componenti della triade di Virchow.

Elettrolitico vena cava inferiore Model (EIM) della Trombosi Venosa

L'intero modello murino stasi di trombosi della vena cava inferiore rendimenti quantificabile quantità di tessuto della parete venosa e trombosi. Si è dimostrato utile per valutare le interazioni tra la parete venosa e il trombo occlusivo e nel valutare la progressione da acuta a cronica.

Modello del mouse completa stasi della vena cava inferiore Trombosi

Analisi del contenuto di grassi è abitualmente condotta in studi che utilizzano modelli murini di obesità. Metodi emergenti nel piccolo animale CT imaging e di analisi stanno fornendo per l'analisi longitudinale di contenuti particolari grassi. Qui passo dettaglio da procedure dettagliate per l'esecuzione di piccoli animali CT imaging, analisi e visualizzazione.

Segmentazione e misurazione dei volumi FAT nei modelli murini di obesità Utilizzo di X-ray Tomografia Computerizzata

Descriviamo le procedure per quantificare e caratterizzare le lesioni aterosclerotiche in modelli murini utilizzando il sezionamento di precisione del seno aortico e dell'aorta ascendente combinato con analisi istochimica e immunoistochimica.

Analisi quantitativa e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nel seno aortico murino

I modelli preclinici di emorragia intracerebrale vengono utilizzati per imitare alcuni aspetti della malattia clinica. Pertanto, possono essere esplorati i meccanismi di lesione e le potenziali strategie terapeutiche. In questo protocollo vengono descritti due modelli di emorragia intracerebrale, iniezioni intrastriatali (gangli della base) di sangue autologo o collagenasi.

Iniezione intrastriatali di sangue autologo o Clostridial Collagenase come modelli murini di emorragia intracerebrale

Il cancro è una malattia complessa che è influenzata dal tessuto circostante il tumore nonché pro- locale e anti-infiammatori mediatori. Pertanto, modelli iniezione ortotropici, anziché modelli sottocutanee possono essere utili per studiare la progressione del cancro in un modo che imita migliori patologia umana.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Impara a indurre la trombosi con cloruro ferrico nel modello murino dell'arteria carotidea e mesenterica. Questa tecnica di microscopia intravivente permette di studiare l'attivazione piastrinica e valutare farmaci anticoagulanti.

Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri

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