Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri

L'obiettivo generale di questo procedimento è indurre una trombosi mediante cloruro ferrico in un modello di arteria carotidea del topo, al fine di ottenere risultati altamente riproducibili analizzati mediante microscopia intravitale. Questi topi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali su diverse malattie o disturbi genetici associati all'attivazione delle piastrine e all'aggregazione del sistema vascolare chiuso. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella sua semplicità e nella sensibilità sia ai farmaci anticoagulanti che antiaggreganti piastrinici, nonché nella possibilità di combinarla con altre tecniche.

Questo metodo può essere utilizzato per ottenere informazioni preziose sulla patofisiologia della trombosi, scoprire nuovi meccanismi e terapie, e valutare gli effetti di farmaci innovativi, inclusa la nanomedicina mirata, sulla trombosi. La visualizzazione di questo metodo è fondamentale per apprendere le strategie necessarie a ottenere un tempo accurato di arresto del flusso sanguigno. Dopo aver verificato l'assenza di risposta alla compressione del dito del piede, utilizzare piccole forbici elettriche per animali per rimuovere il pelo dal collo e dal torace superiore di un topo di età compresa tra le otto e le dodici settimane.

Applicare un unguento oculare neutro a base di vaselina sugli occhi dell'animale e fissare il topo in posizione supina sul coperchio di una piastra per colture cellulari da 15 centimetri. Avvolgere un filo di sutura 4-0 attorno agli incisivi e fissare le estremità del filo al coperchio per mantenere il collo dritto. Successivamente, spostare l'animale sotto una sorgente luminosa chirurgica e utilizzare un pad imbevuto di alcol per sterilizzare il sito chirurgico.

Successivamente, utilizzare pinze Micro-Adson per afferrare la pelle e forbici chirurgiche per praticare un'incisione lunga due-tre millimetri. Tenendo ferma l'incisione con le pinze, inserire le forbici con le lame chiuse e spingere le forbici sotto la cute verso il manubrio. Quindi, aprire le lame per staccare la pelle dallo strato sottocutaneo.

Ora, effettuare un'incisione mediana dal manubrio al corno dell'osso ioide e utilizzare un emostatico fine e pinze Graefe per dissezionare in modo ottuso la fascia sottile tra la ghiandola sottomandibolare. Quando la trachea è visibile, utilizzare le pinze per trattenere il tessuto molle alla destra del manubrio ed inserire l'emostatico sotto la fascia verso la posizione delle due in punto. Aprire le ganasce dell'emostatico per liberare la vena giugulare dai tessuti circostanti.

Quindi, proseguire l'incisione attraverso la fascia, il tessuto molle e la cute fino alla posizione delle due, fino a quando non viene esposta la vena giugulare destra. A questo punto, fissare un ago da 30 gauge a una siringa da un millilitro contenente 100 microlitri di soluzione di rodamina 6G ed utilizzare un portaghi per piegare da due a tre millimetri della punta di 90 gradi. Successivamente, tenendo la siringa con una mano e il tessuto molle con l'estremità distale della vena giugulare con la pinza di Graefe nell'altra, inserire l'ago nel vaso.

Stabilizzare l'ago con la pinzetta ed iniettare la rodamina. Una volta somministrata tutta la soluzione per l'etichettatura delle piastrine, clampare il sito di iniezione con la pinzetta per prevenire il sanguinamento, aprendo l'emostato e inserendo lo strumento sotto la pinzetta per clampare la parete vascolare del sito di iniezione. Successivamente, utilizzare un sutura 6-0 per legare il sito di iniezione.

Dissezionare in modo tronco il tessuto molle e la fascia intorno alla ghiandola sottomandibolare sinistra, quindi tirare la ghiandola verso la posizione delle sette per esporre il muscolo sternocleidomastoideo sinistro. Successivamente, dissezionare in modo tronco la fascia tra il muscolo sternocleidomastoideo sinistro e i muscoli omoioideo e sternoiodeo fino al lato sinistro della trachea. Una volta spostata la fascia, passare un ago con un filo di seta 6-0 lungo 15 centimetri sotto la parte centrale del muscolo sternocleidomastoideo e tirare i due capi del filo lateralmente verso la posizione delle dieci.

Separare in modo netto i muscoli sternoiodeo e omoioideo per esporre l'arteria carotide. Successivamente, utilizzare l'emostatico per separare i tessuti molli dall'arteria carotide senza toccare l'arteria stessa. Utilizzando una pinzetta a punta fine, sollevare la fascia laterale intorno all'arteria carotide evitando il nervo vago e l'arteria.

Quindi, utilizzare un altro paio di pinzette a punta fine per forare la fascia tra l'arteria carotidea e il nervo vago. Ora, passare un uncino smussato attraverso il foro per sollevare delicatamente l'arteria carotidea e far scivolare le pinzette a punta fine al di sotto dell'arteria stessa. Muovendo l'uncino e le pinzette in direzioni opposte lungo l'arteria, rimuovere circa cinque millimetri di tessuto molle avventiziale dal vaso, separandolo dal tessuto circostante.

Quindi, risciacquare un pezzo di plastica a forma di U con soluzione fisiologica e utilizzare il gancio per sollevare delicatamente l'arteria, consentendo di posizionare la plastica al di sotto dell'arteria stessa. La plastica bloccherà la fluorescenza di fondo, impedendo la diffusione della soluzione di cloruro ferrico ai tessuti circostanti, e garantirà che solo l'arteria carotidea sia visibile al microscopio. Idratare immediatamente l'arteria carotidea con due o tre gocce di soluzione fisiologica.

Quindi, trasferire il mouse sul palco del microscopio a fluorescenza sotto l'obiettivo ad acqua 10X e riempire lo spazio tra l'obiettivo e l'arteria con soluzione fisiologica. Ora, avviare l'applicazione software per la registrazione video digitale ed acquisire immagini del vaso normale. Se la parete del vaso è integra e non danneggiata, trasferire il mouse sulla piattaforma Gibraltar ed utilizzare l'angolo di un tovagliolo di carta per asciugare con attenzione la soluzione fisiologica intorno all'arteria carotidea nel campo chirurgico, senza toccare l'arteria.

Quindi, utilizzare una pinzetta fine per trasferire un pezzo di carta da filtro saturata di cloruro ferrico direttamente sulla superficie dell'arteria carotide, vicino all'estremità distale dell'arteria esposta. Assicurarsi di posizionare la carta da filtro vicino all'estremità distale dell'arteria carotide esposta, in modo da lasciare un breve segmento all'estremità prossimale per osservare il flusso sanguigno nella fase successiva della lesione. Dopo un minuto, rimuovere la carta da filtro e risciacquare l'arteria con almeno due millilitri di soluzione salina.

Riportare il mouse sul palchetto del microscopio ed acquisire immagini del vaso. La formazione del trombo può essere identificata dall'accumulo delle piastrine fluorescenti. Continuare ad acquisire immagini del vaso per 10 secondi ogni minuto per i primi 10 minuti, seguiti da 10 secondi ogni due minuti fino al termine dell'esperimento.

La somministrazione di attivatore del plasminogeno di tipo tessutale cinque minuti dopo la lesione indotta da cloruro ferrico dimostra l'inizio della trombolisi circa quattro minuti dopo il trattamento. I trombi formati mostrano ripetute variazioni di dimensione durante il periodo di osservazione di 30 minuti, ma senza un'ablazione completa del trombo mediato dalle piastrine. Il trattamento con un anticorpo policlonale anti-PAR4 che ritarda il taglio di PAR4 prolunga significativamente il tempo necessario alla formazione di un trombo occlusivo nel modello di trombosi dell'arteria carotidea indotta da cloruro ferrico.

Gli esperimenti di marcatura dei globuli rossi non piastrinici indicano che, sebbene i trombi indotti da cloruro ferrico siano composti esclusivamente da piastrine aderenti alla parete vascolare, i globuli rossi vengano comunque intrappolati all'interno del trombo, contribuendo nel tempo alla forma e alla proprietà occlusiva del coagulo. Curiosamente, mentre il trombo iniziale viene visualizzato entro circa 15 secondi dal danno all'arteria e alla vena mesenterica, la formazione del trombo all'interno dei vasi mesenterici è notevolmente ritardata, raggiungendo approssimativamente i 17 minuti nella vena mesenterica e quasi 24 minuti nell'arteria mesenterica, anche a causa, almeno in parte, della diffusione del cloruro ferrico attraverso il tessuto adiposo che circonda i vasi mesenterici.

Una volta padroneggiato, questo modello di trombosi indotto da lesione con cloruro ferrico può essere completato in circa 30-60 minuti, a seconda del livello di abilità raggiunto, se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la misura che ci consentirà di ottenere è il tempo trascorso dalla lesione fino all'occlusione completa dei vasi, e un'osservazione precisa del flusso sanguigno è fondamentale per ottenere risultati accurati. Questo modello può essere combinato con una trasfusione di piastrine wild-type trattate ex vivo per mimare knockout piastrinici specifici, al fine di definire la funzione delle vie di regolazione e delle piastrine.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per esplorare non solo il ruolo delle piastrine nella trombosi, ma anche in varie altre condizioni infiammatorie dell'endotelio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare un modello di trombosi dell'arteria carotide indotta da cloruro ferrico nei topi, al fine di ottenere risultati altamente riproducibili utilizzando il microscopio intravitale. Non dimenticare che il cloruro ferrico può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'apposita attrezzatura di protezione individuale, durante l'esecuzione di questo modello.