La valutazione rapida e specifica del alogenazione perossidasi attività in campioni di sangue leucociti arricchita
28 luglio 2016
Questo protocollo descrive l'arricchimento rapido di leucociti da piccoli campioni di sangue per una successiva determinazione specifica dell'attività alogenante della perossidasi all'interno delle cellule. Il metodo può essere applicato a materiale umano e non umano e può contribuire alla valutazione di nuovi marcatori infiammatori.
L'obiettivo generale di questo metodo di deplezione degli eritrociti è quello di ottenere un rapido e semplice arricchimento dei leucociti da un piccolo campione di sangue. Molti vantaggi di questa tecnica sono che è economica, affidabile e veloce. Inoltre, può essere applicato a campioni di sangue umano e non umano.
Prima di iniziare la procedura di lisi, regolare la pipetta per la somministrazione dell'acqua a due millilitri e la pipetta per PBS a cinque millilitri. Quindi posizionare i matracci aperti di acqua e PBS sotto una cappa a flusso laminare a temperatura ambiente. Poiché la lisi ipotonica è un processo critico in termini di tempo, tutto dovrebbe essere preparato in precedenza.
Inoltre, la procedura di lisi dovrebbe essere eseguita sempre allo stesso modo, per avere risultati compatibili. Quindi, trasferire 100 microlitri da ciascun campione di sangue in una provetta conica da 15 millilitri. E aggiungere due millilitri di acqua distillata a ciascun campione con vortice all'impostazione media.
Far riposare le cellule per 60 secondi, quindi aggiungere cinque millilitri di PBS. E mescola i campioni con il vortex. Ora, raccogli le cellule per centrifugazione e decanta i surnatanti.
Capovolgi i tubi e picchietta le aperture su un tovagliolo di carta per rimuovere quanto più liquido possibile. Quindi ripetere la procedura di lisi ipotonica come appena dimostrato. Dopo aver ottenuto un pellet secco per la seconda volta, risospendere ogni campione in 500 microlitri di HBSS, fino ad ottenere una soluzione omogenea.
E trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio. Per verificare la specificità della perossidasi dei campioni dopo la fluoresceina dell'amminofenolo, o colorazione APF, aggiungere prima cinque microlitri dell'inibitore della perossidasi eme, 4-ABAH, ai campioni appropriati per un'incubazione di 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere cinque microlitri di soluzione di lavoro APF a ciascuna provetta e agitare delicatamente le cellule sull'impostazione del mezzo.
Incubare tutti i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere cinque microlitri di soluzione di lavoro di perossido di idrogeno a ciascun campione e agitare delicatamente le provette. Dopo 60 minuti a 37 gradi Celsius, centrifugare le celle e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare i pellet.
Infine, risospendere le cellule in 250 microlitri di HBSS e conservare i campioni al buio fino alla loro analisi, per evitare il fotosbiancamento. Qui viene mostrato un esempio rappresentativo delle popolazioni leucocitarie dopo lisi ipotonica e colorazione APF come appena dimostrato. Tracciando le dimensioni delle cellule rispetto alla granularità, è possibile osservare la robusta deplezione degli eritrociti, con la popolazione di globuli rossi e detriti che rappresenta solo il 22% degli eventi.
Inoltre, la distribuzione dell'intensità della fluorescenza derivata dall'APF facilita una chiara discriminazione degli eritrociti e dei linfociti perossidasi-negativi, con una moderata ossidazione dell'APF osservata, per i monociti e gli eosinofili positivi alla perossidasi, e una robusta ossidazione della perossidasi esibita dai neutrofili. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata a un massimo di 50 campioni di sangue in parallelo se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione degli anticorpi per identificare i sottogruppi cellulari di interesse.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo degli studi sui piccoli animali per esplorare il ruolo dell'attività alogenante di MPO ed EPO in modelli animali per malattie infiammatorie croniche.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per l'arricchimento dei leucociti da piccoli campioni di sangue, applicabile sia a materiali umani che non umani. La tecnica è economica e affidabile, facilitando la valutazione di nuovi marcatori infiammatori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- L'arricchimento dei leucociti è fondamentale per lo studio delle risposte immunitarie.
- I metodi tradizionali possono essere lunghi e complessi.
- Questo metodo ha lo scopo di semplificare il processo.
- Può essere utilizzato sia per campioni di sangue umano che non umano.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo rapido per l'arricchimento dei leucociti.
- Valutare l'attività della perossidasi alogenante nei leucociti.
- Contribuire all'identificazione di marcatori infiammatori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione delle pipette per la somministrazione di acqua e PBS.
- Utilizzo di un capo a flusso laminare per l'elaborazione dei campioni.
- Lisi ipotonica per la deplezione degli eritrociti.
- Esecuzione della procedura di lisi sensibile al tempo.
Risultati principali
- Arricchimento riuscito di leucociti da piccoli campioni di sangue.
- Valutazione affidabile dell'attività della perossidasi.
- Fattibilità per campioni sia umani che non umani.
- Potenzialità per la valutazione di nuovi marcatori infiammatori.
Conclusioni
- Il metodo è efficiente ed economico.
- Migliora lo studio delle risposte immunitarie.
- Ulteriori ricerche possono basarsi su questo protocollo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente un arricchimento rapido e standardizzato dei leucociti da piccoli campioni di sangue, supportando le attività iniziali di scoperta nella ricerca sulle malattie infiammatorie. Quantificando l'attività perossidasica alogenante di MPO ed EPO, fornisce un'analisi meccanicistica per la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi nei percorsi biologici. La compatibilità del metodo con la citometria a flusso e la colorazione con anticorpi facilita l'integrazione nei flussi di lavoro di screening e traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'attività della perossidasi specifica per i leucociti, validando MPO ed EPO come bersagli terapeutici nell'infiammazione cronica.
- Valore operativo: Richiede un volume minimo di campione (50–100 µL), permettendo prelievi ripetuti da modelli animali di piccola taglia per studi longitudinali sull'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Combina la colorazione con APF con la citometria a flusso per generare letture quantitative basate sulla fluorescenza della produzione di HOCl/HOBr, finalizzate alla standardizzazione del saggio.
- Valore operativo: Permette l'elaborazione ad alto rendimento di fino a 50 campioni in parallelo, supportando campagne di screening scalabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'attività della perossidasi dei leucociti a processi infiammatori rilevanti per la malattia, supportando l'allineamento di biomarcatori in modelli preclinici.
- Valore operativo: Funziona sia con sangue umano che di roditore, consentendo una continuità traslazionale interspecie nella validazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi sul bersaglio alla validazione preclinica, in particolare nei programmi di immunologia e delle malattie infiammatorie.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante la quantificazione dell'attività perossidasi specifica per l'enzima in popolazioni purificate di leucociti.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili tramite la fluorescenza di APF e la citometria a flusso, consentendo la valutazione dell'effetto dei composti sull'attività perossidasi.
- Analisi: Genera dati misurabili di intensità fluorescente che permettono il confronto tra sottopopolazioni cellulari positive per la perossidasi (neutrofili, monociti, eosinofili) in condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega l'attività perossidasi ai meccanismi delle malattie infiammatorie, favorendo la continuità preclinica quando combinata con la marcatura dei marker di superficie cellulare.
- Riutilizzo aziendale: L'arricchimento standardizzato dei leucociti e il rilevamento basato su APF costituiscono una piattaforma riutilizzabile per diversi programmi mirati alle patologie infiammatorie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione dell'obiettivo isolando l'attività della perossidasi in specifiche linee cellulari di leucociti.
- Valore operativo: Offre un protocollo economico e rapido che richiede strumentazione minima (centrifuga, vortex, citometro a flusso).
- Valore strategico: Riduce i tempi di riduzione del rischio biologico consentendo una valutazione rapida e iterativa della modulazione dell'obiettivo in campioni di leucociti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio di inibitori della MPO/EPO fornendo precocemente dati funzionali sull'attività in cellule fisiologicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei leucociti, nella citometria a flusso e nella chimica dei sonde fluorescenti.
- È subordinato all'accesso a centrifughe, vortex, cappe a flusso laminare e citometri a flusso dotati di canali di fluorescenza appropriati.
- Necessita della standardizzazione delle soluzioni operative di APF e di perossido di idrogeno tra diversi laboratori per ottenere risultati riproducibili.
- L'adattamento a specie non umane richiede la validazione dell'espressione della perossidasi e dell'efficienza della colorazione con APF nei sottogruppi di leucociti bersaglio.
- È limitato al rilevamento dell'attività perossidasi alogenante; non misura altre funzioni dei leucociti se non abbinato ad altri saggi.
