Rapid One-step enzimatica Sintesi e All-acquosa Purificazione di trealosio analoghi

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sintetizzare e purificare rapidamente analoghi del trealosio che hanno possibili applicazioni che vanno dalla rilevazione di batteri patogeni alla conservazione di materiali biologici. Questo è un metodo veloce e ad alto rendimento che fornisce l'accesso agli analoghi del diascoride trealosio. Questi composti hanno varie applicazioni consolidate ed emergenti nella ricerca biomedica e biotecnologica.

Questo metodo consiste in una sintesi enzimatica in un solo passaggio e in una purificazione completamente acquosa. Insieme, queste procedure aiutano ad affrontare alcuni degli svantaggi delle sintesi chimiche tradizionali degli analoghi del trealosio che possono essere lunghe, a bassa resa e sfavorevoli per l'ambiente. Le implicazioni di questo metodo possono estendersi allo studio e alla diagnosi della tubercolosi perché analoghi modificati del trealosio sono stati utilizzati per l'imaging del microbatterio tubercolosi, l'agente eziologico della tubercolosi.

Questo metodo può anche aiutare ad accelerare la sintesi e la valutazione di analoghi del trealosio per altre possibili applicazioni, come la conservazione di prodotti biologici e l'uso come dolcificanti non calorici. Prima di iniziare la procedura, preparare una coltura notturna di E.coli che esprime TreT. Per iniziare la procedura di espressione di TreT, porre 750 millilitri di terreno di crescita della TB in un pallone di coltura Fernbach da 2.800 millilitri e sterilizzarlo in autoclave.

Aggiungere l'ampicillina al brodo per ottenere una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro. Procurarsi delle cuvette per la spettroscopia UV-vis e riempire una cuvetta con il brodo del pallone come un bianco. Quindi, aggiungere tre millilitri della coltura notturna di E.coli che esprime TreT preparata nel pallone.

Incubare il pallone a 37 gradi Celsius agitando a 200 giri/min. Controllare periodicamente l'assorbanza del brodo a 600 nanometri rispetto al bianco del brodo. Quando il valore di assorbanza a 600 nanometri è compreso tra 0,5 e 1,0, aggiungere 750 microlitri di arabinosio al pallone per indurre l'espressione di TreT.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius durante la notte agitando a 200 giri/min. Quindi, metti la coltura in una bottiglia da centrifuga in polipropilene da un litro e centrifuga la coltura a 4.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in soluzione salina tamponata con fosfato da 15 millilitri.

Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga conica e centrifugare nelle stesse condizioni. Quindi scartare il surnatante e, se necessario, conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius. Sciogliere una mini compressa di inibitore della proteasi in 20 millilitri di tampone di lavaggio.

Aggiungere la soluzione di inibitore della proteasi al pellet e agitare la miscela per risospendere il pellet. Trasferire la sospensione in un becher da 100 millilitri. Successivamente, sonicare la sospensione per lisare le cellule posizionando la sonda a circa un centimetro dal fondo del becher.

Mettere il lisato in una provetta conica di metallo e centrifugare il lisato a 15.000 volte G a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Filtrare il lisato con un filtro per siringa. Isolare TreT mediante cromatografia liquida di proteine veloci e valutare la purezza con la pagina SDS.

Quindi scambiare TreT in tampone Tris mediante dialisi durante la notte a quattro gradi Celsius per formare la soluzione TreT per la sintesi dell'analogo del trealosio. Raccogliere il bianco dal lavaggio in dialisi. Determinare la concentrazione di TreT mediante spettroscopia UV-VIS rispetto al bianco di dialisi.

Per iniziare la sintesi del 6-Azido-trealosio utilizzando TreT su una scala da 20 a 30 milligrammi, posizionare 0,08 millimoli di 6-Azido-glucosio, 0,16 millimoli di UDP-glucosio e 0,08 millimoli di dicloruro di magnesio in una provetta conica da 15 millimetri. Aggiungere il buffer TreT e Tris. Diluire la miscela con tampone Tris secondo necessità per ottenere una concentrazione enzimatica di 300 microgrammi per millilitro in un volume finale di quattro millilitri.

Tappare e capovolgere il tubo per sciogliere i solidi. Incubare la miscela di reazione per un'ora a 70 gradi Celsius agitando a 300 giri/min. Durante l'incubazione, mettere tre millilitri di acqua deionizzata in un'unità di filtro centrifugo da 10 kilodalton e centrifugare a 3.000 volte G fino a quando tutto il liquido è nella provetta.

Ripetere il lavaggio altre due volte per garantire un risciacquo accurato dell'unità filtro. Al termine della reazione, raffreddare la miscela a temperatura ambiente con ghiaccio. Quindi trasferire la miscela di prodotto nell'unità filtrante centrifuga.

Sciacquare la provetta di reazione con un millilitro di acqua deionizzata tre volte e trasferire ogni risciacquo nell'unità filtrante centrifuga. Centrifugare la miscela a 3.000 volte G fino a quando tutto il liquido è passato nella provetta. Aggiungere tre millilitri di acqua deionizzata all'unità filtrante e centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni.

Ripetere il risciacquo secondo necessità per massimizzare il recupero del prodotto. Aggiungere tre grammi di resina a scambio ionico a letto misto al filtrato. Mescolare il composto con una barretta di cottura a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver mescolato, decantare e filtrare il surnatante. Sciacquare la resina con cinque millilitri di acqua deionizzata e filtrare il risciacquo. Ripetere l'operazione secondo necessità per massimizzare il recupero del prodotto e combinare tutti i filtrati.

Concentrare il filtrato combinato. Quindi, per verificare la presenza di precursori di 6-GlcAz non reagiti, preparare una piastra TLC in gel di silice con macchie di 6-GlcAz, 6-TreAz, il prodotto concentrato e un co-spot. Sviluppare la piastra con una miscela di n-butanolo, etanolo e acqua deionizzata.

Una volta che la piastra è asciutta, visualizza le macchie immergendo la piastra in acido solforico al 5% ed etanolo e riscaldando la piastra su una piastra calda a temperatura alta per circa cinque minuti. Se si osserva un'assenza di reazione del precursore, purificare la miscela di prodotto su una colonna di esclusione dimensionale e ripetere l'analisi TLC. Una volta ottenuto l'analogo puro del trealosio, rimuovere l'acqua per ottenere il prodotto essiccato di 6-TreAz.

Lo stereo dell'enzima TreT unisce selettivamente l'analogo del glucosio e l'UDP-glucosio per formare il corrispondente analogo del trealosio. L'ambito della reazione include modifiche stereochimiche deossifluoro, tio e azido. Tuttavia, i sostituenti nella posizione quattro sul ring sono meno ben tollerati.

Utilizzando questa procedura, l'analogo del glucosio 6-GlcAz è stato convertito quantitativamente nell'analogo del trealosio 6-TreAz in meno di 60 minuti, come confermato da TLC. Il prodotto puro è stato isolato con il metodo di purificazione a scambio ionico non cromatografico in dialisi a rotazione e caratterizzato mediante NMR in HPLC. La soluzione pura di 6-TreAz è stata quindi utilizzata per eseguire la marcatura azidica del batterio modello M.smegmatis.

La successiva marcatura dei fluorofori mediante una reazione chimica a scatto con gli azidi della superficie cellulare ha mostrato che M. smegmatis con un trasportatore funzionale del trealosio era stato marcato con successo con gli azidi, mentre il ceppo senza lo era. Una volta padroneggiata, la reazione di catalizzazione TreT e la successiva purificazione possono essere eseguite da una a quattro ore a seconda del numero di fasi di risciacquo utilizzate per massimizzare il recupero della produzione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il prodotto di reazione deve sempre essere analizzato mediante NMR e TLC o HPLC per confermarne la purezza e la struttura.

Seguendo questa procedura, l'analogo del trealosio sintetizzato può essere valutato o impiegato come sonda di imaging batterico, tracciante metabolico, inibitore enzimatico o agente stabilizzante di biomolecole. Questo metodo fornisce ai ricercatori un modo per preparare analoghi del trealosio con modifiche come isotopi stabili o etichette di radioisotopi. Nel complesso, i composti accessibili attraverso questo metodo dovrebbero essere utili nella ricerca sulla tubercolosi e in altre aree di ricerca biomedica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere e purificare l'enzima TreT, utilizzare TreT per sintetizzare gli analoghi del trealosio in un solo passaggio e purificare i prodotti analoghi del trealosio.