Name: Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per luso in gene terapia farmacologica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Scopri come valutare l'efficacia e la tossicità di RNA mirati alla produzione di HIV-1 per la terapia genica. Questo metodo consente lo screening simultaneo di shRNA, siRNA, ribozimi e decoy RNA con tempi rapidi.

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Il lavoro qui presentato è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (concede DCB-120266, PPP-133.377 e 348.967 HBF-a AG).

1. Cellule e trasfezioni <ol><li> Culture cellule HEK 293T in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Preparare una sospensione 2 x 10 5 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare. Aggiungere 500, 100 e 1.000 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, 96 e 12 pozzetti, per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, rispettivamente (Figura 2A). </li><li> Mescolare delicatamente i piatti e li incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Crescere le cellule a 50-70% di confluenza. </li><li> Secondo un piano di trasfezione, preparare diluizioni di RNA di prova e dei loro controlli in provette da 1,5 ml (micro esempio, la figura 2B). <ol><li> Per il saggio di produzione virale, preparare un 10 ng / ml di diluizione di HIV-1 plasmide di espressione e aggiungere 10 microlitri in ciascun tubo. Successivo preparare 5 micron diluizioni di RNA di prova e un RN controllo negativoA. Aggiungere 2,5 o 10 ml di ogni RNA di prova e la diluizione di controllo negativo ai corrispondenti tubi per 25 o 100 concentrazioni finali nm. </li><li> Per il test di vitalità cellulare, preparare 5 pM diluizioni di RNA di prova e 10 mg / ml di diluizione dell&#39;RNA controllo positivo, a basso peso molecolare Poly I: C. Aggiungere 2 ml di RNA test o diluizioni di controllo RNA positivi ai corrispondenti tubi per 100 nm o concentrazioni finali ml 200 mg /, rispettivamente. </li><li> Per il saggio attivazione del sistema immunitario, aggiungere 20 ml di RNA test o diluizioni di RNA di controllo positivo previste al punto 1.3.2. ai corrispondenti tubi di 100 nm o 200 mg / ml concentrazione finale rispettivamente. Nota: Per il test di RNA plasmidi di espressione, preparare 10 ng / diluizioni microlitri al posto dei 5 micron diluizioni di RNA di prova, dando importi finali di 25 e 100 ng per passo 1.3.1. e 100 ng per passi 1.3.2. e 1.3.3. </li></ol></li><li> Aggiungere 50, 25 o 75 ml di DMEM ad ogni provetta trasfezione per prod viraleuzione, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. Per i saggi di produzione virale, portare le cellule e tubi trasfezione preparati per un 3 (BSL3) laboratorio di livello di bio-sicurezza prima del passaggio successivo. </li><li> Aggiungere 2 ml di trasfezione reattivo sequenzialmente i tubi di trasfezione e incubare 15 a 20 minuti per consentire di formare complessi. Vedere la tabella dei materiali per la specifica del reagente di trasfezione da utilizzare. </li><li> Aggiungere la miscela di trasfezione da ciascuna goccia a goccia alle posizioni corrispondenti nelle piastre di coltura cellulare tubicino. Agitare delicatamente e incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Misura HIV-1 di produzione (sezione 2), la vitalità cellulare (sezione 3) e l&#39;attivazione immunitaria (sezione 4) nelle piastre di coltura cellulare (Figura 2C). </li></ol> 2. Assay La produzione virale <ol><li> Rimuovere le piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti da incubatore e mescolare delicatamente le piastre all&#39;interno della coltura cellulare BSL3cappuccio. Trasferire 150 pl di surnatante da ogni pozzetto ad un corrispondente bene in una piastra inferiore 96 pozzetti piatta, che sarà utilizzato per quantificare HIV-1 di produzione. Nota: saggi titolazione virale comuni includono misurando l&#39;espressione della proteina del capside di HIV-1 (p24) by enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) 20, quantificando RNA virale mediante trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) 21 e misurando l&#39;attività di HIV-1 RT enzima. I passaggi da 2.2 a 2.5 spiegare i metodi per quantificare l&#39;HIV-1 RT attività 13,15,16. </li><li> Trasferimento 5 ml di surnatante in pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, contenente 25 ml di una perturbazione virale cocktail 15 (Tabella 1). Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire la piastra ad una workstation radioattività. Nota: Step 2.2. è necessaria solo se una workstation radioattività non è disponibile in laboratorio BSL3. Se le piastre non devono essere rimossi dallaboratorio BSL3, procedere al punto 2.3. e aggiungere 50 ml di radioattivi / virale perturbazione cocktail (Tabella 1) al posto dei 25 ml di cocktail radioattivi. </li><li> Preparare una radioattivo cocktail 15 (Tabella 1), e aggiungere 25 ml a ciascun pozzetto di surnatante virale e cocktail interruzioni. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Spot 5 ml di miscela di reazione su piazze corrispondenti in una fibra di vetro Di Etile Amino etilico (DEAE) carta filtermat e consentire le macchie asciugare per 10 minuti. Spot la miscela di reazione su ogni altro quadrato in modo che non esistono due campioni Boarder direttamente l&#39;un l&#39;altro. Ciò consente di evitare cross-over tra i campioni per determinare i conteggi per minuto (cpm) al punto 2.6. </li><li> Lavare le carte 5X per 5 minuti con 2x salina citrato di sodio (SSC) tampone (Tabella 1), seguito da due 1 min lavaggi con etanolo al 95%. Lasciare le carte a secco e sigillarli in sacchetti di campionamento. </li><li> Clip portacampionari containing la carta filtermat in una cassetta ed inserire la cassetta in un contatore a scintillazione micropiastra. Impostare il contatore di leggere CPM per 32 P, con la data di riferimento previsto per la partita di [32 P] dTTP utilizzato nell&#39;esperimento. Selezionare quali campioni da letto utilizzando la mappa piatto e avviare il contatore. </li><li> Per qualsiasi metodo titolazione virale, dividere i valori ottenuti per ciascun RNA test il controllo negativo adiacente e moltiplicare tale valore per 100 per ottenere la percentuale di inibizione di HIV-1 di produzione per ciascun replicato degli RNA prova. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova, a diverse concentrazioni è fornita in figura 3. </li></ol> 3. vitalità cellulare Assay <ol><li> Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall&#39;incubatore e aggiungere 20 ml di 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromide) diluito in tampone fosfato di Dulbecco ( DPBS) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre Fo 3 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato con detergente (1% NP-40, 4 mM HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto ed incubare le piastre per 2 ore a RT. </li><li> Determinare l&#39;assorbanza a 570 nm in uno spettrofotometro per micropiastre. </li><li> Calcolare il metabolismo MTT relativo per ciascun controllo e test di RNA positivo dividendo il valore ottenuto per ciascun campione per il controllo trasfezione adiacente. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova e un controllo positivo è fornito in Figura 4. </li></ol> 4. Immune attivazione del test <ol><li> Rimuovere le piastre da 12 pozzetti da incubatore e aspirare il terreno di coltura. Lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS e aggiungere 70 ml di tampone di lisi freddo 22 (tra cui proteasi e fosfatasi inibitori, Tabella 1) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Trasferimento lisati cellulari per tubi micro e veloce congelarli immergendo iltubi in azoto liquido. Consentire ai campioni di scongelare e ripetere per altri 2 cicli di gelo e disgelo, per un totale di 3. </li><li> Centrifugare i lisati per 15 minuti a 4 ° C, 15.700 xg, per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in nuovi tubi micro e determinare la concentrazione di proteine ​​con il metodo 23,24 Coomassie blu (Bradford). </li><li> Risoluzione 75 mg di proteine ​​di ogni campione in un gel di poliacrilammide denaturante al 10% e trasferimento su membrana di nitrocellulosa come precedentemente descritto 25,26. </li><li> Dopo elettroforesi e trasferimento ad una membrana, rivelare bande proteiche incubando la membrana Ponceau S (Tabella 1) per 1 min seguita da lavaggio con acqua bidistillata. Utilizzare le bande e scaletta proteine ​​come guida per tagliare la membrana 80 e 55 kDa. Nota: Nel passo 4.4 campioni possono essere eseguiti su 16 x 18 cm 2 gel scorrimento a 34 kDa, in modo che sia facile da tagliare la membrana nelle posizioni specificate e non tagliare ilbande di interesse. In alternativa, alcuni gel possono essere eseguiti con gli stessi campioni per evitare di tagliare la membrana. </li><li> Lavare la colorazione Ponceau S con soluzione salina Tris tamponata contenente 0,05% di Tween 20 (TBST, Tabella 1). Aggiungere TBST con latte non grasso 5% per coprire completamente le membrane. Incubare le membrane a temperatura ambiente con agitazione per 1 ora. </li><li> Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di albumina sierica bovina (BSA) e anticorpi diluito a 1 su 1.000 contro ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), per i primi, basso e intermedio pezzi della membrana, rispettivamente. </li><li> Lavare le membrane 5X per 5 minuti con TBST e incubare in TBST con latte 5% senza grassi e di capra anti-coniglio anticorpi secondari perossidasi (diluito a 1 su 5.000) per 1 ora. </li><li> Lavare il membrane 5x per 5 minuti con TBST e applicare la soluzione elettrochemiluminescenza (ECL) per visualizzare le bande in film, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Dopo visualizzare le bande proteiche su film, lavare i pezzi intermedia ea valle della membrana per 10 minuti con una soluzione di anticorpi stripping. Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di BSA e anticorpi contro PKR totale (a 1 a 500) e IRF3 (a 1 su 1.000), per la metà e pezzi di fondo, rispettivamente. Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio per la membrana PKR (centro). </li><li> Lavare il pezzo inferiore della membrana 5x per 5 minuti con TBST e incubare la membrana in TBST con 3% BSA per 1 ora con un anticorpo contro actina (diluito 1 a 5000). Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio. Un esempio dei risultati che confrontano diversi RNA di prova e un controllo positivo viene fornito nella Figura 5. Vedere la tabella di materiali per i anticorpi specifici da utilizzare. </li></ol>

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<li>Chang, L. J., Liu, X., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+siRNAs+targeting+multiple+highly+conserved+RNA+sequences+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1.</a> Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).</li>
<li>Daniels, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li>
<li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li>
<li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
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<li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li>
<li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+or+stimulation%3F+siRNA+delivery+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;HIV-1 test di produzione, definita è stata effettuata utilizzando cellule HEK293T (Figura 2) ed è simile a dosaggi utilizzati per lo screening HIV-1 RNA per ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, siRNA 30, e U1i RNA siti 11,31 bersaglio. Utilizzando diversi metodi per quantificare l&#39;HIV-1 di produzione, la maggior parte degli studi hanno misurato la produzione virale 48 ore dopo la co-trasfezione di HIV-1 RNA plasmide con candidati. Dopo la produzione di...

Una limitazione di corrente trattamenti HIV-1 è che devono essere somministrati cronicamente per prevenire la progressione della malattia. Trapianto di HIV-1 resistenti linfociti T, o cellule staminali ematopoietiche, ha il potenziale per fornire un controllo a lungo termine della replicazione dell&#39;HIV-1 in assenza di terapia farmacologica 1,2 e può anche essere un approccio efficace per raggiungere un HIV-1 cura 3. Un modo per rendere le cellule resistenti alla replicazione dell&#39;HIV-1 è quello di inserire uno o più geni che codificano per anti-HIV-1 RNA o peptidi nelle cellule di un individuo infetto durante un trapianto autologo 4. Diversi candidati-HIV-1 anti-geni sono stati progettati con alcuni studi clinici che entrano in combinazioni di due o tre 5 6, per prevenire lo sviluppo di HIV-1 resistenza a qualsiasi singolo gene. Anti-HIV-1 RNA sono tra i primi candidati per la terapia genica combinazione a causa del loro basso potenziale per suscitare risposte immunitarie e perchésono trascritti da sequenze geniche molto brevi. Alcuni-HIV-1 anti-RNA sono stati progettati per colpire l&#39;ingresso e l&#39;integrazione virale. Tuttavia, la maggior parte degli RNA anti-HIV-1 Target passaggi post-integrazione nel ciclo di vita virale (Figura 1). Inibitori post-integrazione includono RNA decoy, mira le HIV-1 Tat proteine ​​regolatrici o Rev 1, e RNA antisenso a base, il targeting siti diversi in HIV-1 RNA, come ribozimi 7, 8 e shRNAs U1i RNA 9. I metodi che sono stati utilizzati per confrontare l&#39;efficacia di anti HIV-1-RNA includono il monitoraggio replicazione virale in cellule trasdotte con i geni codificanti per RNA candidati e misurando la produzione virale in cellule trasfettate con plasmidi esprimenti RNA candidati e uno di HIV-1 plasmide di espressione 10 -13. Abbiamo usato in precedenza un test di produzione di HIV-1 per lo screening HIV-1 RNA per il nuovo ribozima siti bersaglio 13-15. Questi metodi sono stati dal raffinato per ottimizzare il formato di un RNAmolecola interferenze espresso dal DNA plasmide come shRNA o consegnato come siRNA sintetico 16. Il test misura la produzione di virus maturi dalle cellule 293T umane embrionali renali (HEK), e può essere utilizzato per confrontare gli effetti degli inibitori che colpiscono fasi post-integrazione nel ciclo di replicazione dell&#39;HIV-1 (Figura 1). Per gli inibitori che colpiscono fasi di pre-integrazione, sono necessari test alternativi come una prova di infettività delle cellule TZM-bl 17 per valutare l&#39;efficacia antivirale. I principali problemi di sicurezza per la fornitura di anti-HIV-1 RNA nella clinica includono potenziali effetti fuori bersaglio sulla RNA umani o proteine, e l&#39;attivazione dei sensori del sistema immunitario innato. Per valutare la tossicità di anti-HIV-1 siRNA, abbiamo utilizzato un test di vitalità cellulare in diverse linee cellulari 16. Abbiamo anche misurato attivazione dei doppi sensori immuni RNA incagliati, RNA proteina chinasi attivata R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), nonché expressione dell&#39;interferone stimolato gene, p150 ADAR1. Questi saggi possono essere usati per confermare che l&#39;efficacia anti-HIV-1 RNA non è dovuto ad effetti indiretti sulla vitalità cellulare o attivazione del sensore immunitaria. Sono anche utili per escludere RNA candidati potenziali tossicità di ulteriore sviluppo. Nelle seguenti protocolli, le procedure per identificare nuovi RNA terapeutici e ottimizzare il formato di quelli esistenti sono descritti. I metodi sono utili per gli inibitori della post-integrazione a base di screening di RNA di HIV-1 replicazione e potrebbero essere adattati per lo screening altri inibitori post-integrazione, come ad esempio piccole molecole di targeting Rev esportazione mediata di RNA virale 18 o CRISPR / sistemi Cas progettato per indirizzare integrato HIV-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, 96 pozzetti, 24 pozzetti, 6 pozzetti.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Micro provette Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>reagente di trasfezione per RNA sintetici</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>reagente di trasfezione per plasmidi di espressione di RNA</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>modello di RNA poli(A)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 Primer DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE carta filtrante&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione per micropiastre</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Compresse tampone per lisi</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>Inibitori della proteasi e della fosfatasi</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Camera di corsa in gel</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Cella di trasferimento semi-secca</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Scala proteica EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di stripping degli anticorpi</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>PI32106</tr><tr><td>anticorpo</td><td></td><td></td> ADAR1 <td>del Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>anticorpo fosfo-T446-PKR</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo fosfo-S396-IRF3</td><td>Anticorpo</td><td></td> Cell Signaling 4947 <td></td></tr><tr><td>PKR</td><td>del Dr. A. Hovanessian</td>Anticorpo IRF3 Anticorpo Cell Signaling 11904 Anticorpo actina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>capra marcata con perossidasi anti-coniglio</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>capra marcata con perossidasi anti-topo</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della efficacia e la tossicità degli rna targeting hiv-1 produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Le terapie a piccoli RNA mirate alle fasi di post-integrazione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 sono tra i migliori candidati per la terapia genica e hanno il potenziale per essere utilizzate come terapie farmacologiche per l'infezione da HIV-1. Gli inibitori post-integrazione includono ribozimi, RNA a forcina corta (sh), piccoli RNA interferenti (si), RNA di interferenza U1 (U1i) e aptameri di RNA. Molti di questi sono stati identificati utilizzando saggi di co-trasfezione transitoria con un plasmide di espressione di HIV-1 e alcuni sono avanzati agli studi clinici. Oltre alle misure di efficacia, i piccoli RNA sono stati valutati per il loro potenziale di influenzare l'espressione degli RNA umani, alterare la crescita e/o la differenziazione cellulare e suscitare risposte immunitarie innate. Nei protocolli qui descritti, viene descritta una serie di saggi di trasfezione transitoria progettati per valutare l'efficacia e la tossicità delle molecole di RNA che mirano alle fasi post-integrazione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1. Abbiamo utilizzato questi saggi per identificare nuovi ribozimi e ottimizzare il formato di shRNA e siRNA che hanno come bersaglio l'RNA dell'HIV-1. I metodi forniscono una serie rapida di saggi utili per lo screening di nuovi RNA anti-HIV-1 e potrebbero essere adattati per lo screening di altri inibitori post-integrazione della replicazione dell'HIV-1.

Uno schema generale delle procedure è mostrata in figura 2 con un piano trasfezione esempio per tre RNA di prova e un RNA di controllo fornito in Figura 2B. Per i saggi di produzione e vitalità cellulare virali, la lettura per ciascun costrutto test è normalizzata a un controllo negativo. Replicati vengono trasfettati in serie, in modo che ogni RNA test viene normalizzato al suo controllo negativo adiacente. Questo viene fatto per evitare dati imprecisi ...

Vengono descritti i metodi per valutare l'efficacia e la tossicità delle molecole di RNA che mirano alle fasi post-integrazione del ciclo di replicazione dell'HIV-1. Questi metodi sono utili per lo screening di nuove molecole e l'ottimizzazione del formato di quelle esistenti.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare l'efficacia e la tossicità di nuove RNA mirate alla produzione dell'HIV-1. Questo metodo può contribuire a identificare nuove molecole di RNA per terapie geniche o farmacologiche contro l'HIV-1, come RNA a forcina corta o RNA interferenti piccoli, ribozimi e RNA trappola. Il vantaggio principale di questa tecnica è che diversi nuovi design di RNA possono essere analizzati contemporaneamente con tempi di risposta rapidi.Sebbene questo metodo sia stato progettato per valutare nuovi farmaci a base di RNA o terapie geniche contro l'HIV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come molecole di piccole dimensioni o applicazioni CRISPR. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo impostando esperimenti per analizzare un elevato numero di ribozimi per i loro effetti anti-HIV. Per iniziare, preparare una sospensione di cellule renali embrionali umane 293T a due volte 10 alla quinta cellule per millilitro in DMEM con 10%FPS e 1%penicillina-streptomicina.Aggiungere 500, 100 e 1.000 microlitri di sospensione cellulare rispettivamente nei pozzetti delle piastre a 24, 96 e 12 pozzetti per i saggi di produzion

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Intervista: HIV-1 DNA provirale escissione Utilizzando un ricombinasi Evolved

Nanoparticelle di indinavir, ritonavir, atazanavir e efavirenz sono stati realizzati con macinazione ad umido, omogeneizzazione e ultrasuoni. Queste nanoformulations, denominati collettivamente nanoformulated terapia antiretrovirale (NanoArt), valutata macrofagi basato consegna della droga. Monociti-macrofagi derivati ​​NanoArt assorbimento, ritenzione e rilascio prolungato sono stati determinati. Questi studi preliminari suggeriscono il potenziale di Nanoarte per uso clinico.

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Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

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Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

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Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l'uso in gene terapia farmacologica

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