Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l'uso in gene terapia farmacologica

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare l'efficacia e la tossicità di nuovi RNA mirati alla produzione di HIV-1. Questo metodo può aiutare a identificare nuove molecole di RNA per l'utilizzo del gene HIV-1 o della terapia farmacologica, come forcine corte o piccoli RNA interferenti, ribozimi e richiami di RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che diversi nuovi disegni di RNA possono essere sottoposti a screening simultaneo con un tempo di consegna rapido.

Sebbene questo metodo sia stato progettato per valutare nuovi farmaci a RNA o terapie geniche per l'HIV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come piccole molecole o compiti CRISPR. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo avviando esperimenti per lo screening di un gran numero di ribozimi per gli effetti anti-HIV. Per iniziare, preparare una sospensione di cellule 293T del rene embrionale umano a due volte da 10 alla quinta cellula per millilitro in DMEM con il 10% di FPS e l'1% di penicillina streptomicina.

Aggiungere 500, 100 e 1.000 microlitri di sospensione cellulare a ciascuno dei pozzetti di piastre da 24, 96 e 12 pozzetti rispettivamente per la produzione virale, la vitalità cellulare e i saggi di attivazione immunitaria. Agitare delicatamente le piastre e incubarle per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica al 50%-70% di confluenza. Per il test di produzione virale, preparare una diluizione di 10 nanogrammi per microlitro di un plasmide di espressione dell'HIV-1 e aggiungere 10 microlitri a ciascuna provetta del test.

Successivamente, preparare cinque diluizioni micromolari di RNA di prova e un RNA di controllo negativo. Quindi aggiungere 2,5 microlitri o 10 microlitri di ciascun RNA del test e diluizione del controllo negativo alle provette corrispondenti per concentrazioni finali di 25 nanomolari o 100 nanomolari. Per il saggio di vitalità cellulare, preparare cinque diluizioni micromolari di RNA di prova e una diluizione di 10 milligrammi per millilitro di RNA di controllo positivo, poli(I:C) a basso peso molecolare Aggiungere due microlitri di RNA di prova o di diluizioni di RNA di controllo positivo alle provette corrispondenti per concentrazioni finali di 100 nanomolari o 200 microgrammi per millilitro, rispettivamente.

Per il test di attivazione immunitaria, aggiungere 20 microlitri di RNA di prova o diluizioni di RNA di controllo positivo, come preparato per il test di vitalità cellulare, alle provette corrispondenti per concentrazioni finali di 100 nanomolari o 200 microgrammi per millilitro, rispettivamente. Quindi aggiungere 50, 25 o 75 microlitri di DMEM a ciascuna provetta di trasfezione rispettivamente per la produzione virale, la vitalità cellulare e i saggi di attivazione immunitaria. Per i saggi di produzione virale, portare le cellule e le provette di trasfezione preparate in un laboratorio di livello di biosicurezza tre, o BSL-3, prima della fase successiva.

Aggiungere due microlitri del reagente di trasfezione in sequenza alle provette di trasfezione e incubare da 15 a 20 minuti per consentire la formazione di complessi. Aggiungere l'intera miscela di trasfezione da ciascuna microprovetta goccia a goccia nelle posizioni corrispondenti nelle piastre di coltura cellulare. Agitare delicatamente e incubare le piastre per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Per eseguire il test di produzione virale, dopo aver rimosso le piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti dall'incubatore, trasferirle nella cappa di coltura cellulare BSL-3. Agitare delicatamente le piastre e quindi trasferire 150 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto a un pozzetto corrispondente in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti da utilizzare per quantificare la produzione di HIV-1. Trasferire cinque microlitri di surnatante nei pozzetti corrispondenti in una piastra da 96 pozzetti contenente 25 microlitri di un cocktail di interferenza virale.

Dopo aver incubato la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente, trasferire la piastra in una stazione di lavoro per la radioattività. Quindi, prepara un cocktail radioattivo e aggiungi 25 microlitri a ciascun pozzetto di surnatante virale e cocktail di disturbo. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due ore.

Posizionare cinque microlitri della miscela di reazione sui quadrati corrispondenti in un tappetino filtrante in fibra di vetro/carta DEAE e lasciare asciugare le macchie per 10 minuti. Utilizzare 2 tamponi SSC per lavare le cartine cinque volte per cinque minuti ciascuna, seguite da due lavaggi di un minuto con etanolo al 95%. Lasciare asciugare le carte prima di sigillarle in sacchetti per campioni.

Agganciare i sacchetti per campioni contenenti la carta del tappetino filtrante in una cassetta e inserire la cassetta in un contatore di scintillazione per micropiastre. Quindi avvia il contatore. Per qualsiasi metodo di quantificazione virale, dividere i valori ottenuti per ciascun RNA del test per il controllo negativo adiacente e moltiplicare questo valore per 100 per ottenere la percentuale di inibizione della produzione di HIV-1 per ogni replicazione degli RNA del test.

Per eseguire un test di vitalità cellulare, dopo aver rimosso le piastre da 96 pozzetti dall'incubatore, aggiungere 20 microlitri da cinque milligrammi per millilitro MTT e DPBS a ciascun pozzetto. Quindi incubare le piastre per tre ore a 37 gradi Celsius. Aggiungere 150 microlitri di isopropanolo acidificato con detersivo a ciascun pozzetto e incubare le piastre a temperatura ambiente per due ore.

Quindi utilizzare uno spettrofotometro per micropiastre per determinare l'assorbanza a 570 nanometri. Calcolare il metabolismo MTT relativo per ogni controllo positivo e testare l'RNA dividendo il valore ottenuto per ciascun campione per il controllo di trasfezione adiacente. Per il test di attivazione immunitaria, dopo aver rimosso le piastre a 12 pozzetti dall'incubatore, aspirare il terreno di coltura e utilizzare DPBS per lavare delicatamente le cellule due volte.

Quindi aggiungere 70 microlitri di tampone di lisi fredda contenente inibitori della proteasi e della fosfotasi in ciascun pozzetto e incubare le piastre su ghiaccio per 10 minuti. Trasferire i lisati cellulari in microprovette e congelarli rapidamente immergendo le provette in azoto liquido. Dopo aver lasciato scongelare i campioni, congelarli-scongelarli altre due volte, per un totale di tre cicli di congelamento-scongelamento.

Quindi, centrifugare i lisati a 15, 700 volte g e 4 gradi Celsius per 15 minuti per pellettare i detriti cellulari. Quindi, dopo l'elettroforesi e il trasferimento su una membrana, rivelare le bande proteiche incubando la membrana in Ponceau S per un minuto. Quindi lavarlo con acqua bidistillata.

Usa le bande e la scala proteica come guida per tagliare la membrana a 80 e 55 kilodalton. Ora, utilizzare TBS con TWEEN 20 allo 0,05% o TBST per lavare via la colorazione Ponceau S. Aggiungere TBST con il 5% di latte scremato fino a coprire completamente le membrane e incubarle a temperatura ambiente agitando per un'ora.

Trasferire le membrane in TBST con il 3% di BSA e anticorpi diluiti 1:1, 000 per ADAR, fosforo-PKR e fosforo-IRF3 rispettivamente per i pezzi superiore, medio e inferiore della membrana. Incubare a 4 gradi Celsius agitando per una notte. La mattina seguente, utilizzare TBST per lavare le membrane cinque volte per cinque minuti ciascuna, prima di passare a TBST con latte scremato al 5% e anticorpi secondari anti-coniglio di capra marcati con perossidasi 1:5.000 per un'ora.

Dopo aver visualizzato le bande proteiche sui film, utilizzare una soluzione di stripping per lavare i pezzi centrale e inferiore della membrana per 10 minuti, prima di incubare il pezzo centrale della membrana negli anticorpi PKR e il pezzo inferiore negli anticorpi IRF3. Come controllo positivo, sondare la membrana inferiore con anticorpi contro l'actina secondo il protocollo di testo. Uno schema generale dei saggi è mostrato qui con un esempio di piano di trasfezione per tre RNA di prova e un RNA di controllo.

Per i saggi di produzione virale e di vitalità cellulare, la lettura per ciascun costrutto di test viene normalizzata a un controllo negativo. Utilizzando il saggio di produzione di HIV-1 in cellule trasfettate con un plasmide che esprime il ceppo NL4-3 di HIV-1, è stata calcolata la percentuale di attività RT nelle cellule co-trasfettate con uno dei siRNA mostrati qui, rispetto alle cellule trasfettate con un siRNA nonsenso del substrato di Dicer lungo, per identificare la lunghezza ottimale delle molecole di interferenza dell'RNA che hanno come bersaglio un sito conservato nell'RNA dell'HIV-1. Utilizzando i siRNA più efficaci identificati, è stato determinato il metabolismo percentuale di MTT per le cellule trasfettate.

Lungo l'RNA a doppio filamento, la poli(I:C) riduce la vitalità cellulare solo alla dose più alta. Non è stata osservata alcuna riduzione significativa della vitalità cellulare per i siRNA che hanno come bersaglio il sito 1498 nell'RNA dell'HIV-1, indipendentemente dalla loro lunghezza. Come dimostrato qui dal Western blot, lo stesso insieme di RNA è stato valutato nel test di attivazione immunitaria.

In condizioni in cui la poli(I:C) ha attivato l'espressione di ADAR1-p150 e ha indotto la fosforilazione di PKR e IRF3, non è stato possibile osservare alcun effetto significativo su alcun marcatore di inattivazione per nessuno degli RNA del test. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare preparati di alta qualità sia di RNA che di DNA per la trasfezione.

Inoltre, includere i controlli negativi e positivi adeguati. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'infezione da HIV delle cellule trasdotte, possono essere utilizzati per valutare l'efficacia e la tossicità a lungo termine di potenziali candidati anti-HIV. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ci ha permesso di identificare un sito bersaglio accessibile e conservato nell'RNA dell'HIV e di ottimizzare i formati di ribozimi, shRNA e siRNA che lo colpiscono.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare rapidamente nuovi candidati RNA mirati alla produzione di HIV per l'efficacia utilizzando il test di produzione virale e la potenziale tossicità utilizzando i test di attivazione immunitaria e vitalità cellulare. Non dimenticare che lavorare con l'HIV e i nucleotidi radiomarcati può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come l'utilizzo di laboratori certificati per la biosicurezza e la radioattività.