Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di promuovere la diploidizzazione nell'embrione precoce di zebrafish attraverso l'inibizione della citochinesi corrispondente a un ciclo cellulare embrionale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica, ad esempio attraverso l'identificazione di geni coinvolti nei caratteri adulti o riproduttivi, la generazione di linee consanguinee o altre manipolazioni genetiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice ma efficace nel promuovere la diploidizzazione, consentendo l'omozigosi diretta degli alleli presenti in un singolo individuo eterozigote.

Il pomeriggio prima dell'esperimento, allestisci coppie di accoppiamento del ceppo di pesce zebra desiderato in scatole standard per l'accoppiamento del pesce zebra con divisori per separare maschi e femmine. La mattina dell'esperimento, rimuovere la partizione fisica per iniziare la deposizione delle uova. Ispezionare visivamente le vasche contenenti coppie di accoppiamento per rilevare l'estrusione delle uova durante l'accoppiamento naturale.

Ai primi segni di estrusione delle uova, separare il maschio e la femmina per interrompere la riproduzione. Tenete le femmine preselezionate separatamente o raggruppate nella stessa vasca. Utilizzare più femmine a seconda del numero di embrioni desiderati.

Per preparare una soluzione di sperma dai testicoli di pesce zebra, dopo aver confermato l'eutanasia secondo il protocollo di testo, rimuovere i maschi dal becher. Utilizzare acqua condizionata per sciacquarli brevemente e asciugarli leggermente posizionandoli brevemente su più punti di carta assorbente. Usa le forbici da dissezione o una lama di rasoio per decapitare il pesce e fare un taglio longitudinale lungo l'addome.

Quindi, sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce riflessa, utilizzare una pinza da dissezione per rimuovere gli organi interni. Estrarre ciascuna delle masse dei testicoli e trasferirle in una provetta da microcentrifuga con soluzione di matassa. Per rilasciare lo sperma nella soluzione, utilizzare una spatola stretta per tagliare i testicoli o utilizzare una punta da 1.000 microlitri e pipettare su e giù cinque o sei volte nella soluzione, evitando la formazione di bolle d'aria.

Quindi lasciare che i detriti dei testicoli si depositino. Conserva la soluzione di sperma in ghiaccio dove può mantenere la sua potenza per due o tre ore. Se si procede al trattamento con sperma UV, trasferire la soluzione di sperma in una provetta da microcentrifuga pulita lasciando dietro di sé i detriti di sperma.

Per eseguire il trattamento UV degli spermatozoi, trasferire fino a un millilitro di soluzione di sperma in un pozzetto pulito e asciutto di una lastra di vetro a depressione posta su un letto di ghiaccio. Posizionare il letto di ghiaccio con la piastra di depressione sotto una lampada UV a una distanza di 19 centimetri dalla fonte di luce e trattare la soluzione di sperma a 115 volt per 90 secondi. Con l'estremità di un puntale della pipetta non utilizzato, mescolare delicatamente la soluzione ogni 30 secondi durante il trattamento UV.

Utilizzando un puntale pulito su una micropipetta, trasferire la soluzione di sperma trattata in una nuova provetta per microcentrifuga. Conservare in ghiaccio per non più di due o tre ore fino al momento del bisogno per la fecondazione in vitro. Dopo aver anestetizzato la femmina di pesce zebra secondo il protocollo di testo, non appena il pesce smette di muoversi nelle branchie, utilizzare un cucchiaio per raccogliere il pesce e utilizzare acqua condizionata per sciacquarlo brevemente.

Con il cucchiaio che si sposta dalla parte anteriore a quella posteriore del pesce per evitare di danneggiare l'opercolo branchiale, posizionare brevemente e ripetutamente il pesce su più punti di un tovagliolo di carta per asciugarlo leggermente. Quindi trasferirlo in una capsula di Petri pulita di 10 centimetri di diametro. Utilizzare salviette da laboratorio o tessuti molli per asciugare ulteriormente delicatamente l'area della pinna anale per evitare che le uova rilasciate vengano attivate prematuramente dall'acqua.

Quindi, dopo aver leggermente inumidito le dita con acqua, posizionare un dito di una mano sulla schiena della femmina come supporto e con il dito dell'altra mano, applicare una leggera pressione lungo l'addome della femmina fino a quando le uova non vengono estruse. È fondamentale che gli ovuli estrusi non incontrino acqua in eccesso per evitare che si attivino prematuramente, impedendo loro di essere fecondati dagli spermatozoi. Usa una spatola stretta per allontanare le uova dal corpo della femmina.

Quindi rimetti la femmina in una vasca con acqua condizionata per il recupero. Entro 90 secondi dall'estrusione dell'uovo, aggiungere 100 microlitri di soluzione di sperma agli ovuli estrusi in una capsula di Petri. Agitare delicatamente la punta della pipetta tra gli ovuli per mescolare lo sperma e gli ovuli, facendo attenzione a non sollevare la punta dalla superficie della capsula di Petri per evitare danni agli ovuli.

Attivare immediatamente gli ovuli aggiungendo circa un millilitro di terreno embrionale o E3 e mescolare nuovamente delicatamente gli ovuli e lo sperma utilizzando la punta di una pipetta per agitare. Iniziare i tempi relativi alla fecondazione. A un minuto dalla fecondazione nel volume di un millilitro, utilizzare E3 per allagare la piastra.

Lasciare indisturbati gli ovuli fecondati fino a 10-12 minuti dopo la fecondazione o l'MPF per consentire l'attivazione dell'uovo, compresa l'espansione completa del corion. Dopo l'espansione dei corioni, versare gli embrioni della capsula di Petri in un colino da tè. Quindi utilizzare un flacone di lavaggio con E3 per sciacquare la capsula di Petri per raccogliere le uova rimanenti nel colino.

Metti il colino da tè con gli embrioni all'interno di un becher in un bagno preriscaldato con E3 a 28,5 gradi Celsius. Pre-equilibrare il becher e l'E3 alla temperatura del bagnomaria e assicurarsi che ci sia abbastanza E3 in modo che tutti gli embrioni nel colino siano sommersi. A 22 MPF, rimuovere il colino da tè dal bagnomaria, quindi tamponarlo brevemente su un tovagliolo di carta per rimuovere l'umidità in eccesso e posizionarlo all'interno di un becher E3 preriscaldato in modo simile in un bagno di calore a 41,4 gradi Celsius.

Il passaggio chiave della procedura è lo shock termico che induce un ritardo di un ciclo nella divisione cellulare e quindi trattiene la duplicazione del genoma. A 24 MPF, tamponare brevemente il colino e trasferirlo nuovamente nell'E3 in un bagno d'acqua a 28,5 gradi Celsius. Quindi, a 29 MPF, utilizzare un flacone di lavaggio con E3 per trasferire gli embrioni dal colino da tè a una piastra di Petri da 10 centimetri.

Tra i 35 e i 45 MPF, al microscopio da dissezione con una sorgente di luce trasmessa, selezionare gli embrioni che stanno subendo una scissione simmetrica nello stadio a due cellule e che sono stati quindi fecondati. Rimuovere gli embrioni che non sono in fase di scissione cellulare. Continuare ad osservare gli embrioni fecondati selezionati per la normale divisione cellulare durante il primo ciclo cellulare e durante il secondo ciclo cellulare.

Ordina gli embrioni in base alle seguenti categorie. Quattro cellule o nessuno stallo nello standard di disposizione due a due per un embrione di quattro cellule, tre cellule o stallo parziale in una disposizione aberrante di due cellule più piccole a una grande disposizione di cellule e due cellule o embrioni in stallo. Ordina gli embrioni in stallo in una piastra di Petri fresca.

Lasciare sviluppare fino a 80 embrioni nella capsula di Petri. A 24 ore dalla fecondazione o HPF, osservare gli embrioni per determinare se hanno una morfologia normale caratteristica degli embrioni diploidi o omozigoti diploidi. In contrasto con la ridotta estensione dell'asse, un aumento dello spessore del corpo caratteristico degli aploidi.

Inoltre, a 36 HPF, valutare la diploidizzazione utilizzando marcatori genetici di pigmenti e altri saggi come golden o albino. Infine, rimuovere gli embrioni che sembrano avere una morfologia aploide o che si sono lisati o mostrano altri difetti grossolanamente anormali. Il metodo derivato qui dimostrato, denominato HS2, utilizza uno shock termico durante il periodo da 22 a 24 MPF e induce l'arresto della citochinesi durante la seconda divisione cellulare embrionale a 50 MPF.

Durante lo stallo, la sintesi continua del DNA porta gli embrioni a subirne la diploidizzazione da aploide a diploide o da diploide a tetraploide. Gli embrioni trattati con HS2 possono mostrare una varietà di disposizioni di blastomeri, tra cui nessuno stallo in cui nessuno dei due blastomeri mostra un ritardo, uno stallo parziale in cui uno dei due blastomeri è ritardato e uno stallo in cui entrambi i blastomeri mostrano ritardi. La morfologia degli embrioni può essere determinata a 24 HPF con una morfologia normale caratteristica degli embrioni diploidi o omozigoti diploidi o la morfologia dell'asse corporeo più corta e più larga caratteristica degli embrioni aploidi.

Se opportunamente selezionati per un ritardo del ciclo di una cellula, tutti gli embrioni dovrebbero mostrare una normale morfologia diploide. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Tuttavia, ci vorrà più tempo per elaborare più frizioni.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di separare le femmine in tempo, sezionare accuratamente i testicoli, evitare il contatto prematuro delle uova estruse con l'acqua e mantenere il corretto tempismo delle covate fecondate. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come gli screening genetici in avanti, al fine di rispondere a ulteriori domande, come quali geni sono coinvolti in specifiche funzioni biologiche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica per esplorare i tratti rilevanti per i tratti giovanili, adulti e intergenerazionali nel pesce zebra.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il trattamento termico per indurre la diploidizzazione nel pesce zebra. Non dimenticare che lavorare con la luce UV può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare occhiali di sicurezza protettivi dai raggi UV.