Name: Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri la manipolazione della ploidia negli embrioni di zebrafish con il trattamento di shock termico HS2. Questo metodo semplice promuove la diploidizzazione per studi genetici e generazione di linee consanguinee.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R21 HD068949-01 e RO1 GM065303.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in base alla University of Wisconsin - Madison e Istituzionale cura degli animali e le linee guida Comitato Usa (IACUC) (University of Wisconsin - Madison numero Assurance A3368-01). 1. Selezione femmine per Raccolta Egg tramite accoppiamento interrotta NOTA: i protocolli di fecondazione in vitro basati basano su l&#39;estrusione di uova mature dalle femmine tramite pressione manuale 9. protocolli precedenti hanno usato le femmine direttamente dai carri armati o in coppia accoppiamenti senza le femmine in fase di comportamento rilascio di uova, ma solo una piccola parte di queste donne (circa il 20% o meno, a seconda della linea di pesce zebra) produrre uova indurito e competenti che la pressione manuale. In una procedura di miglioramento, le femmine sono pre-ordinati per la deposizione delle uova con l&#39;osservazione visiva diretta, seguita da immediata interruzione di accoppiamento. Questa procedura è molto efficace, come quasi tutte le femmine pre-selezionati attraverso questo interrotto accoppiamento rendimento passo uova indurito e competentisu pressione manuale. <ol><li> Il pomeriggio prima dell&#39;esperimento, istituito coppie di accoppiamento del ceppo zebrafish desiderato in scatole di accoppiamento zebrafish standard. Mantenere maschi nella stessa camera come femmine separati ancora fisicamente da loro, sia attraverso una divisione scatola di accoppiamento o mettendo il maschio in un inserto deposizione delle uova e la femmina all&#39;interno dell&#39;inserto. </li><li> La mattina di questo esperimento, rimuovere la partizione fisica, ponendo sia il maschio e la femmina all&#39;interno dello stesso inserto deposizione delle uova, così inizia che l&#39;accoppiamento. </li><li> Visivamente serbatoi contenenti coppie di accoppiamento per rilevare l&#39;estrusione di uova durante l&#39;accoppiamento naturale. Ai primi segni di estrusi a base di uova, separate per uomini e donne di interrompere la riproduzione. Dopo la separazione dai maschi, mantenere le femmine preselezionati separatamente o pool nello stesso serbatoio. Utilizzare più femmine a seconda del numero di embrioni desiderati (tipicamente 50-150 uova / femmina). </li></ol> 2. Preparazione di una soluzione di sperma NOTA: IVF rElies sull&#39;esposizione di uova mature per una soluzione di sperma. Questa soluzione può essere trattata, per generare zigoti diploidi (che in seguito al trattamento HS2 diventare embrioni tetraploide) o UV-trattati, per generare zigoti aploidi (che in seguito al trattamento HS2 diventano omozigoti embrioni diploidi). Precedente protocolli di preparazione degli spermatozoi hanno suggerito l&#39;uso di tubi capillari per raccogliere milt dalla regione anale dei maschi dal vivo, ma questo era un processo inefficace come solo una piccola frazione dei maschi ha prodotto milt 9. Il protocollo presentato di seguito si basa invece sulla preparazione degli spermatozoi dai testicoli sezionati tranciate, che conduce a risultati più affidabili. <ol><li> Preparare la soluzione di Hank anticipo come soluzione per un periodo di un Hank, comprendente tutti i componenti (Solutions 1, 2, 4 e 5), tranne la soluzione di bicarbonato di sodio (soluzione 6). Preparare Soluzione 6 fresca e aggiungere alla premiscela mattino dell&#39;esperimento (Tabella 1). Per rendere la soluzione Hanks &#39;(soluzione finale, preparare la mattina delprocedura di fecondazione in vitro), unire 990 ul di Premix di Hank e 10 ml di appena fatto Soluzione 6. </li><li> Eutanasia maschi da sovraesposizione al tricaine come soluzione 0,016% in acqua condizionata. <ol><li> Preparare tricaine come soluzione di riserva di 0,2% in acqua (tampone a pH 7.0 con 1M Tris pH 9,0) e conservare a 4 ° C. Aggiungere 8 ml di soluzione tricaine magazzino per 100 ml di acqua in un bicchiere, e utilizzare una rete per trasferire i maschi alla soluzione tricaine. </li><li> Utilizzare l&#39;equivalente di testicoli per un maschio per innesto doveva essere fecondato in un volume di soluzione di Hank corrispondente a 100 microlitri per maschio (es testicoli da 10 maschi raccolti in 1 ml di soluzione di Hank, concimare 10 innesti con 100 microlitri / frizione). </li><li> Confermare l&#39;eutanasia dalla cessazione dei movimenti branchie per 15 minuti. Dopo l&#39;eutanasia, rimuovere i maschi dal bicchiere con un cucchiaio. Sciacquare i maschi brevemente con acqua condizionata e asciugarle delicatamente mettendo brevemente in diverse sedi di unatovagliolo di carta. </li></ol></li><li> Per rimuovere i testicoli, primi decapitare eutanasia maschi con le forbici dissezione o una lama di rasoio, e fare un taglio longitudinale lungo l&#39;addome con dissezione scissors.Under un microscopio da dissezione con una sorgente di luce riflessa, rimuovere gli organi interni con dissettore. Estrarre ciascuna delle masse testicoli con una pinza e metterli dentro la provetta contenente la soluzione di Hank. NOTA: Testes possono essere identificati come ciascuna delle due strutture allungate di aspetto traslucido trovati accanto alle pareti del corpo e che convergono vicino alla cloaca. Testicoli possono rimanere 2-3 minuti su una superficie della piastra di Petri dopo la dissezione e prima di metterli nella soluzione del Hank. </li><li> Rilasciare lo sperma nella soluzione per tranciatura testicoli con una spatola stretta e / o leggermente pipettando su e giù per 5-6 volte i testicoli in soluzione con una micropipetta 1.000 microlitri punta, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Lasciare depositare il testicoli detriti. </li><li> Conservare la soluzione sperma in ghiaccio, dove può mantenere la sua potenza fino a 2-3 ore. Se procedere al UV-trattamento della soluzione di sperma, trasferire la soluzione in una provetta pulita lasciando i pezzi di testicoli dietro. </li></ol> 3. Il trattamento UV NOTA: trattamento UV è utilizzata per reticolare DNA degli spermatozoi in modo da renderla inattiva nell&#39;embrione. Questo passo viene utilizzato solo per la produzione di embrioni gynogenetic diploide gynogenetic aploidi o omozigoti. soluzione di sperma per il trattamento UV deve essere separato da pezzi di testicoli (passo 2,4), come grandi pezzi possono proteggere lo sperma di trattamento UV. <ol><li> Trasferire la soluzione sperma di un pozzo asciutto e pulito di una lastra di vetro depressione seduto su un letto di ghiaccio (ad esempio ghiaccio all&#39;interno di una piastra di Petri). Utilizzare un massimo di 1 ml di soluzione di spermatozoi per lastra di vetro pure. </li><li> Esporre la soluzione sperma UV collocando la lastra di vetro depressione sul letto di ghiaccio sotto una lampada UV. Trattare la soluzione sperma per 90 sec con una 115 V (60 Hz, 0.68A) lampada UV ad un 19 cm (7,5 pollici) di distanza. Con la fine di un puntale, mescolare delicatamente la soluzione ogni 30 secondi durante il trattamento UV (utilizzare un puntale pulito ogni 30 sec). </li><li> Usando una punta della pipetta pulita e micropipetta, trasferire la soluzione sperma trattato per una nuova provetta. Conservare in ghiaccio fino al momento della fecondazione in vitro (non più di 2-3 ore dall&#39;estrazione). </li></ol> 4. Estrusione Manuale di uova mature NOTA: Le femmine ottenuti dalla interruzione della accoppiamenti naturali si trasformano facilmente le uova sotto anestesia e pressione manuale. Durante questa procedura, il trattamento tricaine deve essere attentamente controllato per evitare la sovraesposizione che può impedire il recupero delle femmine. <ol><li> Anestetizzare le femmine di esposizione alla luce per soluzione tricaine: femmine di trasferimento con una rete di tricaine soluzione in acqua condizionata (fatta con l&#39;aggiunta di 8 ml di 0,2% soluzione madre Tricaine a 100 ml di acqua pesci condizionata) per circa 2-5 minuti, fino alla fermata di pesce il movimento Gill. </li> &lt;li&gt; Non appena una donna si ferma il movimento Gill, utilizzare un cucchiaio per raccogliere e sciacquare brevemente in acqua condizionata. Sempre con il cucchiaio per spostare il pesce, asciugarla delicatamente mettendo brevemente e ripetutamente su diverse località di un tovagliolo di carta, quindi trasferirla a secco 10 centimetri piatto pulito, del diametro di Petri. Approccio il pesce con il cucchiaio nella anteriori alla direzione posteriori, per evitare potenzialmente danneggiare l&#39;opercolo branchiale. </li><li> Utilizzare salviette di laboratorio o dei tessuti molli per asciugare delicatamente ulteriormente l&#39;area pinna anale, per evitare le uova rilasciate da prematuramente essere attivato da acqua. Smorzare le dita leggermente con acqua (per evitare che si attacchino alle squame di pesce), mettere un dito di una mano sulla schiena del femminile come supporto, e con un dito dell&#39;altra mano applica una leggera pressione lungo l&#39;addome della femmina fino a quando le uova diventano estruso. </li><li> Utilizzare una spatola stretta per spostare le uova dal corpo della femmina. Posizionare la femmina indietro in una vasca con acqua condizionata per il recupero. <br/&gt; Nota: Una volta che le uova vengono estrusi mentre la femmina è sdraiata su un lato del suo corpo, che può essere capovolto e il processo ripetuto sul suo lato opposto per ottenere le uova aggiuntivi. Per assicurare il pieno recupero della femmina, si applicano solo pressione manuale leggera sull&#39;addome, ed eseguire la procedura dal branchia arresto del movimento per tornare a acqua in meno di 2 min. </li><li> Attivare (con l&#39;esposizione di acqua) e fertilizzare (con lo sperma soluzione aggiunta) uova simultaneamente ed entro 90 secondi dopo l&#39;estrusione (vedi sezione 5). </li></ol> 5. fecondazione in vitro NOTA: la fecondazione in Zebrafish incroci naturali è esterno, a seconda del rilascio simultaneo e l&#39;attivazione da acqua di uova e sperma durante l&#39;accoppiamento. In imita fecondazione in vitro questo processo esponendo le uova soluzione spermatozoi in presenza di acqua. Volume dell&#39;acqua è originariamente piccola (1 ml) al fine di aumentare la concentrazione di spermatozoi efficace. Binding da parte dello spermatozoo si verifica entro 15-20 secondi 10 &lt;/ Sup&gt;, e il volume d&#39;acqua possono essere aumentati. Chorion sollevamento contribuisce ulteriormente alla stretta di sincronizzazione della frizione limitando la finestra per la competenza per l&#39;associazione degli spermatozoi 11,12. Gli embrioni risultanti pertanto mostrano in gran parte simultanee cicli di divisione cellulare durante le fasi di scissione precoce. <ol><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di spermatozoi (corrispondente alla equivalente di testicoli da un maschio - vedere parte 2) alla frizione delle uova estrusi su una piastra di petri. Agitare delicatamente la punta della pipetta utilizzata per aggiungere la soluzione di sperma tra le uova di mescolare lo sperma e le uova insieme, facendo attenzione a non sollevare la punta dalla superficie della piastra di Petri per evitare danni uova. </li><li> Immediatamente attivare le uova con l&#39;aggiunta di 1 ml di soluzione embrionale medio (E3) (acqua condizionata è anche accettabile come sostituto per l&#39;E3 nelle parti da 5 a 7) e di nuovo mescolare delicatamente le uova e lo sperma agitando delicatamente con la punta della pipetta. Avviare un timer per avviare la tempistica relativa alla fecondazione. </li&gt; <li> A 1 MPF nel volume 1 ml, inondare la piastra con E3. Prima di continuare, lasciare indisturbati fino 10-12 MPF per consentire l&#39;attivazione delle uova, tra cui l&#39;espansione completa chorion. </li></ol> 6. Trattamento shock termico NOTA: Una scossa di calore applicata in embrione precoce inibisce centriolo la duplicazione, risultando in un complemento incompleta di centrioli per guidare la formazione del fuso durante il successivo ciclo cellulare 2. L&#39;assenza di mandrino a sua volta provoca la mancanza di formazione solco 13. <ol><li> Dopo l&#39;espansione dei chorions (10-12 MPF), versare gli embrioni dalla piastra di Petri in un colino da tè. Sciacquare la piastra di Petri con una bottiglia di lavaggio con E3 al fine di raccogliere eventuali rimanenti embrioni nel colino da tè. </li><li> Posizionare il colino da tè con gli embrioni all&#39;interno di un bicchiere in un bagno di pre-riscaldato con E3 a 28,5 ° C. Pre-equilibrare la coppa ed E3 per la temperatura del bagno d&#39;acqua, e assicurarsi che ci sia abbastanza E3 in modo che tutti gli embrioni nel tèsetaccio sono esposti al mezzo. </li><li> Al 22 MPF, rimuovere il colino da tè dal bagnomaria 28,5 ° C, per breve tempo macchia è su un tovagliolo di carta per rimuovere l&#39;umidità in eccesso, e posizionarlo all&#39;interno di un bicchiere E3 simile preriscaldato in un bagno di calore a 41,4 ° C. </li><li> Al 24 MPF, trasferire il colino da tè di nuovo alla E3 nel bagno d&#39;acqua a 28,5 ° C dopo una breve assorbente. Al 29 MPF, utilizzare una bottiglia di lavaggio con E3 per trasferire gli embrioni dal colino del tè di 10 cm Piatto Petri. </li></ol> 7. La selezione per gli embrioni con un One-ciclo Citochinesi Stall <ol><li> Durante il periodo di tempo 35-45 MPF, sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce trasmessa, selezionare quegli embrioni che sono in fase di scissione simmetrica nella fase 2-cellule, e che sono quindi fecondati. Rimuovere gli embrioni che non sono sottoposti a scissione delle cellule. </li><li> Continua osservando gli embrioni fecondati, selezionati per la normale divisione cellulare durante il primo ciclo cellulare, e durante il secOND ciclo cellulare (50-65 MPF). </li><li> Ordina gli embrioni in base alle seguenti categorie (Figura 2C): 4 celle ( &quot;no stallo&quot;, in 2: Standard Disposizione 2 per un embrione di 4 celle); 3 celle ( &quot;stallo parziale&quot;, in un aberranti 2 celle più piccole: 1 grande arrangiamento delle cellule); e 2 celle ( &quot;stallo&quot;, embrioni esibendo un ritardo di un ciclo delle cellule in 1: 1 arrangiamento identica a quella di un embrione 2-cell). Ordinare gli embrioni in fase di stallo in un piatto fresco di Petri. NOTA: In questa fase, gli embrioni in 2: disposizione 2 corrispondono a quelle in cui durante il secondo ciclo cellulare né blastomeri ha subito uno stallo divisione cellulare; embrioni in un aberrante 2 celle più piccole: 1 grande arrangiamento cellulare corrispondono a quelli in cui shock termico provocato uno stallo del ciclo cellulare durante il secondo ciclo cellulare in una blastomeri, ma non l&#39;altro; ed embrioni &quot;stallo&quot; in 1: Disposizione 1 corrispondono a quelli in cui nel secondo ciclo cellulare sia blastomeri sottoposti la divisione cellulare desideratostalla. embrioni in fase di stallo dovrebbero riprendere la scissione delle cellule durante il periodo successivo ciclo cellulare (65-80 MPF). La disposizione di blastomeri può essere variabile, a causa dei segnali incomplete del ciclo cellulare precedente per stabilizzare il mandrino 2,14, ma la maggior parte embrioni formerà un blastula relativamente normale che può subire normale sviluppo. </li><li> Lasciare embrioni di sviluppare nella piastra di Petri, con un limite di 80 embrioni per 10 cm piatto. A 24 HPF, osservare gli embrioni per determinare se hanno una normale morfologia caratteristica di embrioni diploidi diploidi o omozigoti 6 (normale misura dell&#39;estensione asse (Figura 3A, 3C)), a differenza di ridotta estensione dell&#39;asse maggiore spessore del corpo caratteristico haploids (Figura 3B)), e / o valutare diploidization utilizzando marcatori genetici pigmento a 36 MPF, come oro o albino e altri tali dosaggi (Figura 3 e si veda sotto) 2,6,9. </li&gt; <li> Rimuovere eventuali embrioni che sembrano avere una morfologia aploidi, o che hanno lisato o esporre altri difetti grossolanamente anormale. NOTA: Se lo si desidera, consentire gli embrioni di sviluppare fino a 5 giorni dopo la fecondazione, pur continuando a rimuovere gli embrioni lisati o grossolanamente anomali su base giornaliera e l&#39;aggiunta di fresco E3 per aggiornare la media. NOTA: Sopravvivere embrioni possono anche essere coltivate dopo che l&#39;inflazione vescica natatoria il giorno 5 con il trasferimento ad un sistema d&#39;incubazione e l&#39;alimentazione in condizioni standard. </li></ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li>
<li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li>
<li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+%28Paralichthys+olivaceus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li>
<li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li>
<li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+C+%22The+zebrafish%3A+Genetics+and+genomics.+Vol.+60+Methods+in+Cell+Biology%22">The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology</a>. Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. , Academic Press. 43-70 (1999).</li>
<li>Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li>
<li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li>
<li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPelegri%2C+F+%22The+Zebrafish%3A+Genetics+and+Genomics+Vol.+60+Methods+in+Cell+Biology%22">The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology</a>. Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. , Academic Press. 1-20 (1999).</li>
<li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg%3A+localization+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li>
<li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+a+sperm+meets+an+egg%3A+block+to+polyspermy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li>
<li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defending+the+zygote%3A+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li>
<li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li>
<li>Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li>
<li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li>
<li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li>
<li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank%27s+saline+containing+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Mar.+Biol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li>
<li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+Y%2C+W%2C+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li>
<li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li>
<li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li>
<li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPelegri%2C+F+%22Met.+Cell+Biol.+Vol.+104%22">Met. Cell Biol. Vol. 104</a>. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. , 83-120 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

passaggi critici E &#39;fondamentale per lavorare in condizioni di effettivo fecondazione in vitro. Per assicurare una buona scorta di uova mature (step 1), le femmine impostati per l&#39;accoppiamento non avrebbe dovuto essere istituito nel croci di accoppiamento per almeno 5 giorni e dovrebbe apparire gravide. Durante l&#39;interruzione di allevamento, un osservatore può monitorare 15-30 carri armati in modo adeguato per la prima apparizione di estrusione uovo naturale. Interruzione di accopp...

Questo protocollo permette la manipolazione di ploidia in embrioni di zebrafish, come ad esempio la generazione di diploidi omozigoti gynogenetic da aploidi gynogenetic (Figura 1) o la produzione di tetraploidi. Questo risultato è ottenuto inducendo un ritardo nella citochinesi corrispondente precisamente a un ciclo cellulare (Figura 2A, 2B). La chiave di ritardo di un ciclo in citocinesi è ottenuta mediante trattamento con shock termico. Il protocollo standard di shock termico (HS) come originariamente descritto da Streisinger e colleghi coinvolto un impulso temperatura durante il periodo di 13-15 MPF, risultando in un unico ciclo di divisione cellulare stallo durante il primo ciclo cellulare 1. L&#39;efficienza di questo protocollo è stato recentemente migliorato dalla scansione dei primi cicli cellulari con una finestra temporale scorrevole di trattamento shock termico. Questa scansione individuato un punto secondo momento per una scossa di calore, ancora all&#39;interno del primo ciclo cellulare (22-24 MPF), che si traduce in un più alto tasso di embryo con un ciclo di divisione cellulare di stallo, che in questo caso riguarda il secondo ciclo cellulare 2. L&#39;osservazione che le manipolazioni sperimentali durante il primo ciclo cellulare interferiscono con la divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare e provocano DNA duplicazione di contenuti è stata riportata anche in altre specie di pesci 3,4. Ci riferiamo a questo protocollo modificato come Heat Shock 2 (HS2 - il termine &quot;2&quot; indica che l&#39;impulso di calore avviene in un punto temporale entro il metodo HS standard e che il ritardo del ciclo cellulare causata da HS2 si verifica durante il secondo ciclo cellulare ). Questi studi hanno dimostrato che la base di arresto citochinesi dopo shock termico è l&#39;inibizione della duplicazione centriole durante l&#39;impulso di calore, che influenza la formazione del fuso e induzione solco nella seguente ciclo cellulare. Risultati HS2 rendimenti di arresto del ciclo cellulare si avvicinano al 100%, e tassi di ploidia duplicazione fino a 4 volte superiore rispetto HS di serie 2. ingegno embrioni trattatiha shock termico durante cella ciclismo blastomeri presentano molti effetti deleteri, suggerendo che shock termico colpisce di più processi necessari per la divisione cellulare 2. D&#39;altra parte, se lo shock termico è applicato prima dell&#39;inizio del ciclo cellulare (periodo 0-30 MPF), sembra avere effetti coerenti con interferenza specifico con duplicazione centriolo e non sembra influenzare altri processi cellulari essenziali 2 . Questi studi hanno dimostrato che il tempo prima dell&#39;inizio della divisione blastomere sembra essere un periodo di sviluppo suscettibili di utilizzare shock termico come strumento per manipolare specificamente ploidia attraverso l&#39;inibizione centriolo. La causa di fondo della selettività apparente per shock termico sulla duplicazione centriolo è sconosciuta, ma può essere correlato a una degradazione selettiva delle sottostrutture centrosoma osservati in condizioni di stress termico in alcuni tipi di cellule, come i leucociti 5. la sincronizzazione temporale di embrionale deluppo è ottenuta tramite fecondazione in vitro (IVF). L&#39;uso di sperma non trattata durante i risultati di fecondazione in embrioni diploide che al momento HS2 indotto un ciclo cytokinesis stallo diventare tetraploide. L&#39;uso di sperma UV-trattati, che porta legami crociati che inattivano il suo DNA, risultati in embrioni aploidi gynogenetic 6, che su HSII indotto un ciclo cytokinesis stallo diventare diploidi gynogenetic 2. A causa del conseguente tutta la duplicazione del genoma, le diploidi gynogenetic ultime siano omozigoti ad ogni singolo locus in tutto il genoma. Per brevità, ci riferiamo a gynogenetic embrioni aploidi come &quot;aploidi&quot;, e omozigoti embrioni diploidi gynogenetic come &quot;diploidi omozigoti&quot;. Se vitale e fertile, diploidi omozigoti possono essere utilizzate per avviare le linee sterili e letali-libera. omozigosi diretta indotta da HS2 dovrebbe anche essere facilmente incorporato in analisi genetica o schermi genetici, dal momento che diploidi omozigoti dalle femmine che sono portatori eterozigoti di Mutzioni tariffe espositive di omozigosi a (50%) e alti rapporti fissi 2. Il seguente protocollo descrive passaggi per eseguire HS2 e indurre la duplicazione ploidia con piena omozigosi. Per la produzione tetraploide, soluzione sperma dovrebbe essere trattata. Per la produzione diploide omozigote, lo sperma deve essere inattivato per il trattamento UV. Inoltre, come descritto nella discussione, marcatori pigmento visibili possono anche essere utilizzati per facilitare l&#39;identificazione di diploidi omozigoti. Compagno di Zebrafish principalmente durante i primi 3 hr di inizio del loro ciclo di luce 7, e adulti e le uova sono sensibili ai ritmi circadiani 8, quindi per ottenere i migliori risultati della procedura di fecondazione in vitro dovrebbe avvenire entro questo periodo di tempo.

<table><tbody><tr><td>Scatole di accoppiamento per pesci zebra</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3Sigma</td><td></td> <td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>Approvato dalla FDA (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>per preparare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>per preparare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Rete da pesca (maglia fine) (4-5 pollici)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>disponibile in ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Cucchiaio</td><td></td><td></td> di plastica <td>disponibile nella maggior parte dei negozi standard</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>disponibile da Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Stereoscopio da dissezione (con sorgente di luce trasmessa)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Sorgente di luce riflettente (bracci LED)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>o piastre</td></tr><tr><td>di Petri equivalenti Diametro</td><td></td><td></td> di 10 cm <td>qualsiasi produttore Tubi</td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 ml</td><td></td><td></td><td>qualsiasi produttore</td></tr><tr><td>Secchiello per</td><td></td><td></td> <td>il ghiaccioqualsiasi produttore</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>qualsiasi produttore</td></tr><tr><td>Puntali per pipette 1.000 &; </td><td></td><td></td> l <td>qualsiasi maker</td></tr><tr><td>Spatola stretta</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di vetro a depressione</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td><td>disponibile presso Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>UVP</td><td>modello XX-15 (cat No. UVP18006201)</td><td>disponibile presso Fisher Scientific. Sebbene non siano state osservate da noi con questo modello, è stato osservato che alcune sorgenti UV subiscono una diminuzione dell'intensità nel tempo (in tal caso, vedere Modifiche e risoluzione dei problemi)</td></tr><tr><td>Occhiali</td><td></td><td></td> UV <td>qualsiasi produttore</td></tr><tr><td>Asciugamani</td><td></td><td></td> di carta <td>qualsiasi produttore</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>disponibile da Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Timer cronometro</td><td></td><td></td><td>qualsiasi maker</td></tr><tr><td>Bottiglia di lavaggio</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>disponibile da Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Colino</td><td></td><td></td> da tè <td>disponibile nei negozi di cucina</td></tr><tr><td>becher, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>disponibile da Fisher Scientific</td></tr><tr><td>bagnomaria (2)</td><td></td><td></td><td>qualsiasi produttore, con accurary a 0,1 C (es. Shel Lab H2O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione 1</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra vedi sopra</td><td>8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml ddH2O. Conservare a 4°C.</td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione 2</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td>0,358 g Anidro Na2HPO4, 0,6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione 4</td>: <td>vedi sopra</td>, <td>vedi sopra, 0,72</td><td>g di CaCl2 in 50 ml di ddH2O. Conservare a 4°C.</td></tr><tr><td>Hank's Premix</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td>aggiungere, nel seguente ordine: 10,0 ml Soluzione 1; &nbsp; 1,0 ml Soluzione 2; &nbsp; 1,0 ml Soluzione 4; &nbsp; 86,0 ml ddH2O; &nbsp; 1,0 ml Soluzione 5. Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione 6</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td>0,33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Preparare fresco la mattina della procedura di fecondazione in vitro.</td></tr><tr><td>Soluzione di Hank (soluzione finale)</td><td>vedi sopra</td><td>vedi sopra</td><td>Combine 990 &mu; l di Hank' s Premix e 10 &mu; l di soluzione 6 appena preparata (NaHCO3 solution)</td></tr></tbody></table>

manipolazione ploidia di embrioni di zebrafish con heat shock 2 trattamento

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipolazione di ploidia permette trasformazioni utili, come diploidi a tetraploidi, o aploidi a diploidi. Nella rerio Danio zebrafish, in particolare la generazione di diploidi gynogenetic omozigoti è utile in analisi genetica perché permette la produzione diretta di omozigoti da un&#39;unica madre eterozigote. Questo articolo descrive un protocollo modificato per la duplicazione di ploidia base ad un impulso di calore durante il primo ciclo cellulare, Heat Shock 2 (HS2). Attraverso l&#39;inibizione della duplicazione centriole, questo metodo si traduce in una precisa stalla divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare. La precisione di un ciclo di divisione stallo, accoppiato ad inalterato duplicazione del DNA, si traduce in tutta la duplicazione del genoma. Protocolli associati a questo metodo includono uovo e la raccolta dello sperma, il trattamento UV di sperma, la fecondazione in vitro e impulso di calore per provocare una sola cella di ritardo divisione del ciclo e la duplicazione di ploidia. potrebbe essere applicata una versione modificata di questo protocolloper indurre cambiamenti di ploidia in altre specie animali.

Nonostante la unicellulare ciclo citochinesi stallo, la replicazione del DNA avviene normalmente in tali embrioni, causando la duplicazione del contenuto di DNA dell&#39;embrione (Figura 1). Il protocollo Streisinger Heat Shock (standard HS) comporta un impulso di calore durante il periodo di 13-15 minuti dopo la fecondazione (MPF) e induce principalmente cytokinesis arresto nel corso della prima divisione cellulare embrionale a 35 MPF 1,2, mentre il metodo de...

Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.

Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è promuovere la diploidizzazione nell'embrione di zebrafish in stadi precoci attraverso l'inibizione della citocinesi corrispondente a un ciclo cellulare embrionale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica, ad esempio identificando geni coinvolti in caratteri adulti o riproduttivi, generando linee consanguinee o effettuando altre manipolazioni genetiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è semplice ma efficace nel promuovere la diploidizzazione, consentendo l'omozigotizzazione diretta di alleli presenti in un singolo individuo eterozigote.Il pomeriggio precedente l'esperimento, preparare coppie di riproduzione della ceppa di zebrafish desiderata in scatole standard per l'accoppiamento di zebrafish con divisori per separare maschi e femmine. La mattina dell'esperimento, rimuovere la partizione fisica in modo che inizi la deposizione delle uova. Ispezionare visivamente i serbatoi contenenti le coppie di riproduzione per rilevare l'estroflessione delle uova durante l'accoppiamento naturale.Alle prime manifestazioni di espulsione delle uova, separare il maschio dalla femmina per

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo è un metodo per la generazione di embrioni di zebrafish gynogenetic diploide (embrioni il cui unico contributo genetico proviene dalla madre), bloccando la seconda divisione meiotica subito dopo la fecondazione con luce ultravioletta-inattivato sperma. Embrioni EP non sono completamente omozigoti per ricombinazione durante la prima divisione meiotica, tuttavia sono omozigoti a tutti i loci che non sono stati separati dalle loro centromero dalla ricombinazione.

Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

Qui riportiamo un protocollo per misurare lo stress ossidativo negli embrioni viventi di zebrafish. Questa procedura consente di rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sia nei tessuti embrionali interi che nelle popolazioni di singole cellule. Questo protocollo realizzerà analisi sia qualitative che quantitative.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

Il pesce zebra è un potente sistema modello per la biologia dello sviluppo e la ricerca sulle malattie umane grazie alla loro somiglianza genetica con i vertebrati superiori. Questo protocollo descrive una metodologia per creare embrioni aploidi di zebrafish che possono essere utilizzati per strategie di screening in avanti per identificare mutazioni recessive in geni essenziali per l'embriogenesi precoce.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

Questo protocollo fornisce istruzioni passo dopo passo su come generare embrioni di pesce zebra parabiotico di diversi background genetici. Se combinato con le impareggiabili capacità di imaging dell'embrione di zebrafish, questo metodo fornisce un mezzo straordinariamente potente per studiare le funzioni autonome delle cellule rispetto a quelle non autonome delle cellule per i geni candidati di interesse.

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

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Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

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Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.

Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di mutanti materni che accoppia una linea di knock-in stabile zpc:cas9 con la consegna mediata da Tol2 di cassette di espressione di sgRNA.

Generazione di mutanti materni utilizzando zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Scopri la manipolazione della ploidia negli embrioni di zebrafish con il trattamento di shock termico HS2. Questo metodo semplice promuove la diploidizzazione per studi genetici e generazione di linee consanguinee.

Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

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