Name: Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri come misurare i tassi di ossidazione del glucosio e degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto in lavoro. Questo metodo permette di studiare l'adattamento metabolico cardiaco in tempo reale.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Dettagli Il protocollo precedente i metodi per quantificare simultaneamente il flusso di substrato attraverso l&#39;ossidazione del glucosio e ossidazione degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto di lavoro. Le misurazioni possono essere sovrapposte ai parametri funzionali cardiaci registrati per determinare il rapporto tra substrati metabolismo e lavoro cardiaco in condizioni basali e di stress (variazione del carico di lavoro, ischemia-riperfusione, ecc ...). E &#39;anche possibile valutare come il rappor...

rilevanza clinica Nel cuore dei mammiferi, vi è una forte relazione positiva tra il flusso dei substrati attraverso vie metaboliche ossidative, la produzione di ATP e il lavoro cardiaco 1. Nel corso degli ultimi due decenni, l&#39;indagine del legame intricato tra il metabolismo e la funzione cardiaca ha portato a riconoscere che le alterazioni nel metabolismo cardiaco sono una causa per la disfunzione contrattile e forse patologico rimodellamento strutturale nel contesto di diversi tipi di malattie cardiache 2-4. Pertanto, si prevede che la nostra comprensione dei meccanismi che regolano rimodellamento metabolica del cuore sottolineato porterà alla identificazione di bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento di insufficienza cardiaca 5-7. La recente pubblicazione di una dichiarazione scientifica della American Heart Association su &quot;Valutare Cardiac Metabolism&quot;, sottolinea il crescente interesse della comunità scientifica per tsuo campo di ricerca 8. Ma mentre i progressi tecnologici nel campo dell&#39;imaging cardiaco permettono ora per una valutazione rapida e accurata della morfologia e funzione cardiaca, lo studio in vivo del metabolismo cardiaco rimane limitata e gravoso: Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e tomografia ad emissione di positroni (PET) può essere utilizzati per seguire cardiaca metabolismo del fosfato ad alta energia e l&#39;attività ciclo di Krebs, ma queste tecniche sono afflitti da costi di gestione elevati e dalla loro incapacità di determinare il contributo di vari substrati al metabolismo ossidativo in condizioni di stato stazionario 9 .Per questa data l&#39;ex vivo lavoro di preparazione cuore rappresenta la sola e unica tecnica a disposizione per studiare, simultaneamente e in tempo reale, funzione contrattile e del flusso dei substrati nelle vie metaboliche ossidative 7,9. Il seguente protocollo prefigge di fornire orientamenti nella preparazione e utilizzo di reagenti utilizzati per determinare il rattoes di utilizzo substrati, nel cuore isolato di ratto di lavoro. L&#39;isolato Apparato Cuore di lavoro per roditori Anche se la tecnica è quasi mezzo secolo di vita, il lavoro di preparazione isolato cuore di ratto rimane un metodo di scelta per la ricerca cardiovascolare. Come per la preparazione del cuore Langendorff, cuore roditore lavoro offre un modo relativamente semplice, affidabile e poco costoso per misurare una vasta gamma di parametri cardiaci indipendentemente dagli effetti confondenti di altri organi, neurormonali e altri fattori circolanti. Ma a differenza cuore Langendorff-perfuso, cuore lavorando continua a svolgere lavoro cardiaco quasi fisiologica, un prerequisito per la generazione di flusso metabolico ossidativo a livelli che sono rilevanti per le condizioni in vivo. Ciò si ottiene fornendo il buffer perfusione del ventricolo sinistro (LV) attraverso una cannula collegata all&#39;atrio sinistro, e come riempie e contratti LV, latampone viene espulso attraverso la linea aortica contro un post-carico determinata pressione idrostatica. Il design dell&#39;apparato perfusione originariamente descritto da Neely e colleghi 10 è stato successivamente migliorato da Taegtmeyer, orli e Krebs 11, ma è cambiato molto poco da allora. Come descritto nel l&#39;apparato originale, funzione contrattile può essere valutata attraverso la determinazione della gittata cardiaca, utilizzando non più di cilindri graduati e un cronometro per misurare aortica e coronarica flussi 10,11. Diversi fornitori offrono ora sistemi completi di roditori di lavoro del cuore di perfusione. Queste apparecchiature disponibili in commercio possono essere acquisite con flowprobes, trasduttori di pressione, un catetere pressione-volume e tutta l&#39;attrezzatura necessaria per l&#39;acquisizione dati funzionali cardiaca e analisi. I produttori forniscono ampie sessioni di documentazione e formazione per familiarizzare il nuovo utente con le loro attrezzature. Diversi articoli di revisione anche i protocolli di dettaglio sul strum cuore di lavoroentazione e l&#39;uso di cateteri per misurare la funzione cardiaca nei roditori 12-15. Per questo motivo, ci sarà solo brevemente menzionare il set-up dell&#39;apparato perfusione e l&#39;apparecchio di controllo. Il presente protocollo piuttosto mira a completare le informazioni già disponibili con una descrizione dei metodi che possono essere implementate per misurare simultaneamente i tassi di glucosio e di catena lunga ossidazione degli acidi grassi, i due principali substrati energetici fornendo nel cuore normale. Descriviamo qui tutti i passi necessari per l&#39;uso di substrati energetici radiomarcati per la valutazione del metabolismo ossidativo miocardica, dalla preparazione dei reagenti e tamponi per il recupero e l&#39;elaborazione dei campioni, l&#39;analisi dei dati. Principi del metodo Cardiomyocytes generano la maggior parte della loro energia per la contrazione della fosforilazione ossidativa degli acidi grassi (acidi grassi a lunga catena principalmente) e carboidrati (glucosE e lattato). Il cuore è molto limitato riserve energetiche e si basa su un costante rifornimento di questi substrati energetici fornendo dalla circolazione. Il catabolismo del glucosio attraverso la via glicolitica produce piruvato che viene poi decarbossilata dal piruvato deidrogenasi della membrana mitocondriale interna. Gli acidi grassi a catena lunga, estratti da albumina o lipoproteine ​​circolanti trigliceridi, vengono dapprima attivati ​​in molecole acil-CoA nel citosol e successivamente trasportati all&#39;interno della matrice mitocondriale attraverso la navetta carnitina per entrare nel pathway beta-ossidazione. Le molecole acetil-CoA prodotti dal catabolismo di glucosio e acidi grassi alimentano il ciclo di Krebs per generare gli equivalenti riducenti (NADH e FADH2) che sono usati dalla catena di trasporto degli elettroni per costruire la forza proton-motrice attraverso la membrana mitocondriale interna e generare ATP attraverso l&#39;attività di ATP sintasi. Acqua e biossido di carbonio sono i sottoprodotti finali dile reazioni enzimatiche che avvengono all&#39;interno del ciclo di Krebs. La fornitura di 14 C e 3 H- substrati radiomarcati (ad esempio 14 glucosio C-radiomarcato e acido oleico 3 H-radiomarcato) al cuore lavorare isolato sarà di conseguenza portare alla produzione di 14 CO 2 e 3 H 2 O che può essere quantitativamente recuperato dall&#39;effluente coronarica. La raccolta di 14 CO 2 viene effettuata mantenendo cuore isolato e perfuso in una camera sigillata e immediatamente recuperare l&#39;effluente coronarica quando esce cuore. Una colonna piccola scambiatrice di anioni viene utilizzato per separare e recuperare 3 H 2 O dall&#39;effluente coronarica. La radioattività dei campioni trattati viene misurata con un contatore a scintillazione liquida, e con la consapevolezza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzato, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nelossidazione Percorsi di 16,17.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 resina, forma di cloruro, 100 - 200 maglie secche, 500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>Questo articolo può essere sostituito acquistando direttamente la forma di idrossido (vedi riferimento sotto), ma questo costerà quasi 8 volte di più</td></tr><tr><td>resina AG 1-X8, forma di idrossido, 100 - 200 maglie secche, 100 g</td> di <td>Bio-Rad</td><td>1432445</td><td>L'acquisto di questo articolo consente di bypassare la conversione della resina a scambio anionico dalla forma cloruro alla forma di idrossido (vedi sezione 1.2 del protocollo)</td></tr><tr><td>Supporto per filtro sottovuoto per microanalisi in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>Corrosivo. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per una manipolazione e una conservazione adeguate.</td></tr><tr><td>Tubo di dispersione di gas con cilindro stropicciato</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Siero bovino Albumina senza acidi grassi, polvere</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>Si consiglia l'uso di un BSA sgrassato con carbone, poiché altri processi di purificazione come il frazionamento a freddo dell'etanolo possono lasciare residui tossici per il cuore.</td></tr><tr><td>Oleato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>Materiale radioattivo. Segui le linee guida dell'ufficio per la sicurezza delle radiazioni del tuo istituto per l'ordinazione e la gestione.</td></tr><tr><td>Tubo a membrana per dialisi, diametro 29 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>Materiale radioattivo. Segui le linee guida dell'ufficio per la sicurezza delle radiazioni del tuo istituto per l'ordinazione e la gestione.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>Sostanza controllata su USDEA Schedule III</td></tr><tr><td>3-0 Silk Black Braid</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Hyamine Hydroxide</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>Altamente tossico e provoca gravi ustioni. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per una manipolazione e una conservazione appropriate</td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione in vetro da 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25E</td><td>Utilizzare fiale in vetro per il recupero quantitativo di 14CO2</td></tr><tr><td>20 ml Fiale a scintillazione in HDPE</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>Utilizzare le fiale in HDPE per il recupero quantitativo di 3H2O</td></tr><tr><td>Rosso Tappi a manicotto</td><td>in gomma Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit 20 mL fiale a scintillazione; Ago BD</td></tr><tr><td>PrecisionGlide riutilizzabile 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>Utilizzare per iniettare acido perclorico attraverso il tappo del manicotto di gomma della trappola CO2</td></tr><tr><td>Acido perclorico, 60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>Altamente corrosivo e può agire come ossidante e/o causare un rischio di esplosione. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per una corretta manipolazione e conservazione</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Lana di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean Detersivo in polvere</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>Per la pulizia di vetreria, parti in plastica e tubi</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Detergente enzimatico attivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-115</td><td>Per la pulizia di superfici "difficili da raggiungere" (tubi, vetreria) contaminate da residui di acidi grassi-BSA</td></tr></tbody></table>

metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro rat

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Il cuore dei mammiferi è un grande consumatore di ATP e richiede un costante rifornimento di substrati energetici per la contrazione. Non sorprendentemente, alterazioni del metabolismo miocardico sono stati collegati allo sviluppo della disfunzione contrattile e insufficienza cardiaca. Pertanto, svelare il legame tra il metabolismo e la contrazione dovrebbe far luce su alcuni dei meccanismi che regolano l&#39;adattamento cardiaca o disadattamento negli stati di malattia. Il lavoro di preparazione cuore isolato di ratto può essere utilizzata per seguire, contemporaneamente ed in tempo reale, la funzione contrattile cardiaca e flusso di energia fornire substrati in vie metaboliche ossidative. Il presente protocollo intende fornire una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per la preparazione e l&#39;utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione per glucosio e gli acidi grassi, l&#39;energia principale fornendo substrati del cuore. I metodi utilizzati per l&#39;analisi dei campioni e l&#39;interpretazione dei dati vengono anche discussi.In breve, la tecnica si basa sulla fornitura di 14 C-glucosio radiomarcato e un acido grasso a catena lunga radiomarcato 3 H- al cuore ex vivo battere via normotermica perfusione cristalloide. 14 CO 2 e 3 H 2 O, sottoprodotti finali di le reazioni enzimatiche coinvolte nella utilizzazione di questi substrati energetici fornendo, vengono poi quantitativamente recuperati dall&#39;effluente coronarica. Con la conoscenza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzati, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nei percorsi di ossidazione. funzione contrattile del cuore isolato può essere determinato in parallelo con l&#39;apparecchio di controllo appropriate e direttamente correlato ai valori flusso metabolico. La tecnica è estremamente utile per studiare il rapporto metabolismo / contrazione in risposta a varie condizioni di stress, come alterazioni nella pre e dopo carico e ischemia, un farmaco o un circulafattore ting, o alla alterazione dell&#39;espressione di un prodotto genico.

Due esperimenti di rappresentanza sono descritte nelle figure seguenti. In entrambi i casi, il cuore di 16 settimane di età maschio Sprague Dawley di ratto è stato isolato e perfuso in posizione di lavoro con tampone KH preparato secondo il protocollo precedente. In ogni esperimento, il cuore è stato sottoposto ad una condizione di stress di influenzare lavoro cardiaco. funzione contrattile cardiaca è stata valutata mediante registrazione continua della pressione differenziale attraverso...

Il seguente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione del glucosio e degli acidi grassi nel cuore di ratto funzionante isolato. Vengono inoltre discussi i metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere misurazioni in tempo reale simultanee dei tassi miocardici di ossidazione del glucosio e di ossidazione degli acidi grassi, nonché della funzione contrattile cardiaca in un cuore di ratto isolato e funzionante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiovascolare, ad esempio in che modo il cuore si adatta metabolicamente a cambiamenti acuti della richiesta energetica e come queste risposte siano alterate in condizioni patologiche.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce al ricercatore un controllo totale sulle variabili ambientali, come la natura e le concentrazioni di substrati, farmaci o ormoni somministrati al cuore. La relatrice sarà Bhavisha Bakrania, ricercatrice post-dottorato del centro di risorse cardiovascolari Reno presso l'Università del Mississippi Medical Center. Per iniziare, avviare la pompa per preparare l'apparato di perfusione e ossigenare il buffer.Dopo aver preparato i materiali, anestetizzare un ratto e prepararlo per l'intervento chirurgico. Rimuovere i peli dall'addome ed eseguire un'incisione mediana con estensione laterale. Spostare lo stomaco e l'int

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Biologia

L'obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

De novo lipogenesi e acido ossidazione β-grassi costituiscono importanti vie metaboliche in epatociti, percorsi che sono perturbate in diversi disordini metabolici, tra cui malattia del fegato grasso. Qui mostriamo isolamento di epatociti primari di topo e descriviamo la quantificazione di ossidazione degli acidi β-grassi e lipogenesi.

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

La glicolisi è un marcatore metabolico determinante in molteplici sistemi biologici. Il monitoraggio della glicolisi misurando il flusso extracellulare di H+ è comune, ma richiede una correzione quantitativa e inequivocabile. Qui, dimostriamo come raccogliere e correggere i dati del flusso extracellulare per distinguere tra fonti respiratorie e glicolitiche di acidificazione extracellulare.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Lo studio del metabolismo sta diventando sempre più rilevante per la ricerca immunologica. Qui presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la glicolisi e la respirazione mitocondriale negli splenociti di topo e nei linfociti T e B.

Un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti

Qui introduciamo un metodo per utilizzare un catetere ottico intra-ventrico nei cuori perfusi per eseguire la spettroscopia di assorbimento attraverso la parete cardiaca. I dati ottenuti forniscono informazioni solide sulla tensione dell'ossigeno tissutale, nonché sull'utilizzo del substrato e sul potenziale della membrana contemporaneamente con misure di prestazione cardiaca in questa onnipresente preparazione.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio muscolare è importante per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo. Questo protocollo presenta la valutazione dell'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione nel muscolo scheletrico maturo isolato e incubato quando delinea l'impatto di vari interventi fisiologici sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.

Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Descriviamo una configurazione sperimentale per la somministrazione di metaboliti iperpolarizzati marcati con 13C in modalità di perfusione continua a un cuore di topo perfuso isolato. Un approccio di acquisizione dedicato a 13C-NMR ha permesso la quantificazione dell'attività enzimatica metabolica in tempo reale e un'analisi multiparametrica 31P-NMR ha permesso la determinazione del contenuto di ATP tissutale e del pH.

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

Scopri come misurare i tassi di ossidazione del glucosio e degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto in lavoro. Questo metodo permette di studiare l'adattamento metabolico cardiaco in tempo reale.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

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