Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere misurazioni in tempo reale simultanee dei tassi miocardici di ossidazione del glucosio e di ossidazione degli acidi grassi, nonché della funzione contrattile cardiaca in un cuore di ratto isolato e funzionante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiovascolare, ad esempio in che modo il cuore si adatta metabolicamente a cambiamenti acuti della richiesta energetica e come queste risposte siano alterate in condizioni patologiche.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce al ricercatore un controllo totale sulle variabili ambientali, come la natura e le concentrazioni di substrati, farmaci o ormoni somministrati al cuore. La relatrice sarà Bhavisha Bakrania, ricercatrice post-dottorato del centro di risorse cardiovascolari Reno presso l'Università del Mississippi Medical Center. Per iniziare, avviare la pompa per preparare l'apparato di perfusione e ossigenare il buffer.

Dopo aver preparato i materiali, anestetizzare un ratto e prepararlo per l'intervento chirurgico. Rimuovere i peli dall'addome ed eseguire un'incisione mediana con estensione laterale. Spostare lo stomaco e l'intestino per accedere alla vena cava inferiore ed iniettare 200 unità USP di Eparina.

Attendere da cinque a 10 secondi, quindi utilizzare le forbici per tagliare il diaframma e i lati della gabbia toracica per esporre il contenuto della cavità toracica. Successivamente, afferrare delicatamente il cuore con la mano ed escindere insieme cuore e polmoni. Tagliare al livello dell'aorta discendente, avendo cura di non danneggiare l'arco aortico e l'aorta ascendente nel corso dell'operazione.

Trasferire immediatamente il cuore e i polmoni in una piastra per dissezione riempita con buffer KH ghiacciato. Dopo che il cuore ha smesso di battere, imparare a lavorare rapidamente in modo da poterlo riavviare entro uno o due minuti. A questo punto, immergere il cuore e i polmoni in una nuova piastra contenente buffer KH ghiacciato.

Eliminare rapidamente eventuali grandi pezzi di tessuto polmonare, quindi recidere l'aorta discendente appena al di sopra dell'arco aortico. Per i passaggi seguenti, adottare le necessarie precauzioni per l'uso di sostanze radioattive. Successivamente, utilizzando una pinzetta, aprire con cura l'aorta e far scivolare il cuore sul cannello.

Si abbia molta attenzione a non oltrepassare la via aortica con una cannula, poiché ciò potrebbe causare ipoperfusione del cuore e danni alle valvole aortiche. Ora fissare il giunto con una clip microchirurgica e avviare la perfusione di Langendorff del cuore. Senza fretta, fissare l’aorta alla cannula aortica utilizzando un filo di seta 3-0 e rimuovere la clip microchirurgica.

Quindi individuare la vena polmonare e rimuovere i tessuti non cardiaci secondo necessità. Lasciare una quantità sufficiente di tessuto per fissare l'atrio sinistro alla cannula. La cannullazione dell'atrio sinistro è il secondo passaggio più critico del protocollo, poiché un'inserzione impropria della cannula o la presenza di perdite indebolirà le contrazioni e comprometterà la quantificazione dei tassi metabolici.

Successivamente, preparare la cannula per la linea dell'atrio sinistro, esattamente come fatto per la cannula destra. Quindi, con una pinzetta, afferrare delicatamente l'apertura della vena polmonare e far scivolare il cuore sulla cannula atriale. Spostare i tessuti secondo necessità, senza piegare l'aorta né sforzare eccessivamente il cuore.

Quindi fissare la cannula con un punto di sutura in seta 3-0. Infine, aprire la linea atriale mentre contemporaneamente si commuta la linea aortica in modalità funzionante. Se del tampone fuoriesce dall'atrio sinistro, chiudere la linea atriale e riportare il sistema in modalità Langendorff.

Quindi utilizzare ulteriori punti di sutura per fissare meglio la cannula e provare a passare nuovamente alla modalità di lavoro. Se l'esperimento prevede la misurazione diretta della funzione del ventricolo sinistro mediante catetere, iniziare praticando una puntura all'apice del ventricolo sinistro con un ago da 26 gauge, inserire un catetere per la misurazione pressione-volume e allineare il fusto con l'asse longitudinale del ventricolo sinistro. Successivamente, posizionare l'elettrodo distale E1 appena al di sotto della valvola aortica, adiacente al margine endocardico, e posizionare l'elettrodo prossimale E4 appena all'interno della parete ventricolare.

Ora sigillare il cuore in una camera con giacca d'acqua. Successivamente iniziare a monitorare i parametri funzionali nel software. Una volta che i parametri di base sono stabili da almeno cinque minuti, iniziare la registrazione dei dati.

Per misurare il flusso coronarico, registrare il tempo necessario per raccogliere 20 millilitri di effluente. Quindi prelevare due millilitri di effluente in una siringa attraverso il rubinetto a tre vie e scartare il resto. Trasferire immediatamente il campione di due millilitri in una provetta per microcentrifuga e prelevare un'aliquote di mezzo millilitro per determinare la velocità di ossidazione del glucosio.

Conservare il resto sul ghiaccio. Continuare a prelevare periodicamente campioni di effluente coronarico e prima di terminare, iniettare 10 microlitri di soluzione salina ipertonica nella linea atriale, subito prima che essa si attacchi alla cannula.

Utilizzare la risposta a questo bolo per calcolare la conduttanza parallela al fine di determinare con precisione il volume cardiaco. Successivamente, rimuovere il sigillo dalla camera cardiaca ed estrarre il catetere dal VS. Quindi staccare il cuore dalle cannule e immergerlo in tampone KH freddo con ghiaccio. Ora asciugare rapidamente il cuore con un tovagliolo di carta e misurare il suo peso fresco.

Dopo aver pesato, procedere a dissezionare i campioni di tessuto richiesti e quindi congelare il tessuto rimanente utilizzando pinze raffreddate con ghiaccio secco. In preparazione, caricare viali di vetro per scintillazione con un millilitro di idrossido di hyamine 10x. Prepararne uno per ciascun campione di effluente coronarico e due per i controlli.

Non appena viene caricato un flaconcino del campione, posizionarlo direttamente in un flaconcino per scintillazione già utilizzato. Per l'analisi, chiudere con cura il flaconcino con un tappo di gomma e utilizzare della parafilm per sigillare il flaconcino. A questo punto, utilizzando una siringa da un millilitro con un ago lungo da 23 gauge, iniettare 200 microlitri di acido perclorico al 60% attraverso il tappo di gomma.

Lasciare riposare tutti i flaconcini campione per tutta la notte. Il giorno successivo, recuperare con attenzione ogni provetta con una pinzetta e lavarne il fondo direttamente sui flaconcini aperti con un millilitro di cocktail di scintillazione per recuperare tutto l'idrossido di hyamine. Quindi aggiungere altri nove millilitri di cocktail di scintillazione a ciascun flaconcino.

Per ottenere l'attività specifica, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di profusione in due delle provette. Agitare ora vigorosamente le provette e lasciarle riposare per almeno sei ore prima di effettuare le misurazioni. Per determinare i tassi di ossidazione dell'oleato miocardico, preparare innanzitutto una colonna a scambio anionico per ogni campione.

Caricare semplicemente le estremità di tre siringhe da tre millilitri con ovatta di vetro. Quindi aggiungere la sospensione acquosa della resina fino al segno dei due millilitri in ciascuna colonna, utilizzando una pipetta trasferibile. Successivamente, lavare la resina facendo passare due millilitri di acqua ultrapura attraverso ciascuna colonna per tre volte.

Quindi posizionare i vial per scintillazione sotto le colonne e caricare le colonne con mezzo millilitro di effluente coronarico. Per la misurazione del fondo, utilizzare invece il buffer di perfusione. A questo punto, eluire le colonne successivamente con mezzo millilitro, un millilitro e infine due millilitri di acqua ultrapura.

Scartare le colonne. Quindi aggiungere 13 millilitri di cocktail di scintillazione nei vial. Aggiungere 0,5 millilitri di buffer di perfusione direttamente in due vial riempiti con 13 millilitri di cocktail di scintillazione liquido per la determinazione dell'attività specifica.

Agitare vigorosamente le provette, lasciarle riposare per almeno sei ore e quindi effettuare le misurazioni. I cuori sono stati isolati da due ratti di 16 settimane e sottoposti a diverse condizioni di stress. Per un cuore, è stato simulato un aumento acuto del carico di lavoro incrementando il post-carico del 40% e aggiungendo epinefrina al buffer di perfusione.

La frequenza cardiaca è aumentata immediatamente di oltre il 50% con l'induzione del salto di lavoro. La potenza cardiaca è aumentata di oltre il 40% al salto di lavoro, fenomeno accompagnato da un incremento sia della velocità di ossidazione del glucosio sia di quella dell'oleato. L'aumento relativo rispetto alla linea di base per l'ossidazione del glucosio è stato notevole.

L'altro cuore è stato sottoposto a 15 minuti di ischemia globale e 30 minuti di riperfusione. In queste condizioni sperimentali, una pressione del polso quasi normale è stata ripristinata alcuni minuti dopo l'inizio della riperfusione. Entro 10 minuti, la potenza cardiaca è aumentata rapidamente a valori superiori a quelli pre-ischemici, per poi tornare a valori prossimi al basale.

Ciò è risultato da un aumento dell'ossidazione dell'oleato. Mentre l'ossidazione del glucosio è ripresa rapidamente fino all'attività pre-ischemica. Una volta acquisita padronanza, l'isolamento del cuore fino alla prima riperfusione in modalità di lavoro può essere eseguito in meno di cinque minuti se effettuato correttamente.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi dell'espressione di RNA e proteine per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio l'effetto di un farmaco o di una condizione di stress sui percorsi di segnalazione molecolare. Non dimenticare che lavorare con traccianti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale completi, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.