Spin saturazione Transfer Difference NMR (SSTD NMR): Un nuovo strumento per ottenere Kinetic parametri di processi a scambio chimico

L'obiettivo generale di questo esperimento è ottenere i parametri cinetici e i processi di scambio chimico reciproco in piccole molecole organiche e organometalliche che risultano difficili da misurare con metodi tradizionali. Questo metodo può contribuire a comprendere la dinamica molecolare di molecole organiche e organometalliche soggette a scambio chimico, ad esempio la varianza rotazionale, l'equilibrio conformazionale, l'inversione dell'azoto, lo scambio della lignina e la tautomerizzazione.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che non è necessaria la coalescenza dei segnali in scambio e che la costante di velocità e il tempo di rilassamento vengono ottenuti nello stesso esperimento. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo durante lo studio del comportamento funzionale di complessi di ioni di platino in soluzione, rendendoci conto che le tecniche di analisi della variazione della temperatura di allineamento non erano adatte. Grazie alla nostra esperienza nello studio delle interazioni proteina-lignina mediante NMR, abbiamo capito che in effetti approcci NMR simili potevano essere applicati per studiare i processi di scambio in molecole organiche, e ciò si è rivelato vero.

Aggiungere cinque milligrammi di nn-dimetilacidoammide in un tubo NMR adatto a basse temperature e sciogliere in zero virgola sei millilitri di toluene deuterato. Per configurare gli esperimenti NMR con SSTD, inserire prima il campione nel magnete. Uno dei passaggi chiave per facilitare l'esperimento NMR è il controllo della temperatura, quindi assicurarsi che il campione si stabilizzi alla temperatura selezionata per almeno 20 minuti.

Una volta inserito il campione nel magnete, digitare EDTE nella riga di comando. Impostare la temperatura al primo valore selezionato per eseguire l'esperimento. Lasciare stabilizzare il campione alla temperatura scelta per almeno 20 minuti.

Eseguire un esperimento di NMR protonica monodimensionale sul campione come descritto nel protocollo del testo, quindi creare un nuovo set di dati di un esperimento di NMR protonica facendo clic su File, nuovo e assegnare un nome al nuovo esperimento. Nel nuovo set di dati, digitare RPAR nella riga di comando. Selezionare uno dei set di parametri STDDIFF dall'elenco.

Per selezionare la sequenza impulsistica STDDIFF, fare clic sul pulsante con i tre puntini nella riga del programma impulsistico. Prima di eseguire l'esperimento NMR SSTD, calibrare l'impulso duro protonico di 90 gradi P1. Digitare pulsecal nella riga di comando e copiare il valore dell'impulso di 90 gradi alla potenza più elevata, ovvero quello che fornisce l'impulso più breve.

Introdurre i valori per l'impulso rigido calibrato nell'esperimento mediante il comando getprosol. Successivamente impostare la durata dell'impulso, digitare P13 e inserire un valore di 50.000 microsecondi. Impostare la forma dell'impulso selettivo andando su power e facendo clic sul pulsante modifica accanto a shape, quindi selezionare la forma dell'impulso 13 e scegliere l'impulso gaussiano.

Impostare la potenza dell'impulso selettivo SP13 a 50 decibel. Digitare NS e impostarlo a otto, quindi digitare DS e impostarlo a quattro. Per acquisire l'esperimento SSTD NMR, aprire l'esperimento NMR del protone per verificare la posizione del segnale che verrà irradiato.

Per farlo, cercare l'esperimento nel browser del software, fare clic con il tasto destro sul set di dati e selezionare "visualizza in una nuova finestra". La selettività dell'irradiazione deve essere precisa per garantire il successo dell'esperimento. Assicurarsi che non vengano utilizzati prodotti chimici di correzione o che la frequenza di irradiazione possa essere impostata in modo errato.

Spostare la linea del cursore al centro del segnale da irradiare e annotare lo spostamento chimico in parti per milione. Selezionare la larghezza spettrale che verrà utilizzata nell'esperimento. In questo caso, il segnale da irradiare si trova a 2.17 parti per milione e la larghezza spettrale utilizzata è di 1.46 parti per milione.

Successivamente, passare all'esperimento NMR SSTD precedentemente creato, creare un elenco con le frequenze di irradiazione digitando FQ2LIST nella riga di comando e selezionando un elenco esistente. Modificare l'elenco delle frequenze di irradiazione come descritto nel protocollo testuale. Salvare l'elenco con un nuovo nome.

Quindi digitare FQ2LIST nella riga di comando e selezionare la lista appena creata. Per centrare l'esperimento sul segnale in esame, digitare O1P e selezionare lo spostamento chimico del segnale che verrà irradiato come centro dell'esperimento. Digitare SW per selezionare l'ampiezza spettrale.

Scegliere il valore per il tempo di rilassamento inter-scan D1. Assicurarsi che sia almeno da uno a cinque volte il valore del T1 del protone con rilassamento più lento. Digitare D1 e impostarlo a 40 secondi. Impostare il primo valore per il tempo di saturazione digitando D20 e impostandolo a 40 secondi.

Determinare automaticamente il guadagno del ricevitore digitando RGA. Creare il prossimo esperimento digitando IEXPNO. Digitare D20 e selezionare un tempo di saturazione di 20 secondi.

Quindi digitare RGA per determinare automaticamente RG. Ripetere l'ultimo passaggio per D20 pari a 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 e 0,3 secondi. Una volta create tutte le esperienze, aprire la prima e nella riga di comando digitare multizg specificando il numero di esperienze. Per elaborare i dati, aprire l'elaborazione numero uno dal set di esperienze con il tempo di saturazione più elevato.

Nella riga di comando digitare LB e impostare il valore a 1,5. Nella riga di comando digitare EFP e impostare il numero di FID uguale a uno e il numero in elaborazione uguale a due. Correggere la fase dell'esperimento cliccando sul pulsante interattivo di correzione di fase e salvarlo come esperimento 2G, quindi salvare ed uscire.

Digitare REP 1 nella riga di comando per passare al processo numero uno. Nella riga di comando digitare EFP e numero FID del processo uguale a due, numero di processo uguale a tre. Successivamente, nella riga di comando digitare punto MD e quindi REP 2 per mostrare una finestra di visualizzazione multipla con gli spettri dei processi due e tre.

Fare clic sul pulsante con il simbolo delta per calcolare gli spettri di differenza e salvarli nel processo numero quattro. Quindi uscire dalla finestra di visualizzazione multipla. Selezionare un intervallo di integrazione dal segnale a sinistra.

Integrare sempre la stessa regione nel processo numero tre e nel processo numero quattro. Una volta effettuata l'integrazione, passare alla scheda integrali in ciascun esperimento e copiare il valore assoluto dell'integrale. Ripetere la procedura per il resto degli esperimenti con diversi tipi di saturazione.

Per ottenere i parametri cinetici, estrarre innanzitutto i valori dei parametri SSTD ottenuti in funzione del tempo di saturazione. Proseguire con l'analisi dei dati come descritto nel protocollo testuale. La rotazione impedita attorno al legame ammidico differenzia i due gruppi metilici in due segnali negli spettri di risonanza magnetica protonica.

La saturazione rotazionale del gruppo metilico a 2,17 parti per milione porta alla scomparsa del suo segnale nella risonanza magnetica protonica (NMR). Saturando il gruppo metilico B a 2,17 parti per milione, il trasferimento della saturazione al gruppo metilico A a 2,16 parti per milione, dovuto alla rotazione interna, può essere osservato come diminuzione dell'intensità protonica nel segnale a 2,61 parti per milione. Il fattore parametro SSTD viene calcolato dividendo il valore dell'integrale del gruppo metilico A nello spettro di differenza per il valore dell'integrale del gruppo metilico A nello spettro originale.

Per una determinata temperatura, il grafico dei valori del parametro SSTD in funzione del tempo di saturazione ha prodotto curve esponenziali. L'analisi delle curve fornisce la costante di velocità e il tempo di rilassamento del protone del segnale misurato. I grafici del parametro SSTD in funzione del tempo di saturazione a diverse temperature hanno fornito le corrispondenti costanti di velocità e i tempi di rilassamento.

L'equazione di Eyring è stata utilizzata per calcolare i parametri termodinamici. I valori ottenuti con la NMR SSTD sono in ottimo accordo con i dati riportati mediante altre tecniche. Una volta acquisita padronanza, un insieme di esperimenti a una temperatura data per ottenere un valore della costante di velocità e del tempo di rilassamento può essere completato in circa tre ore, se eseguito correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la scelta dei solventi e delle temperature è fondamentale per ottenere buoni risultati, poiché le velocità di scambio chimico possono variare notevolmente in funzione di questi parametri. Seguendo questo procedimento, è possibile studiare anche altri processi come lo scambio chimico intermolecolare lento dal punto di vista cinetico e lo scambio della lignina; inoltre, questo metodo potrebbe essere esteso per trattare scambi multi-sito e popolazioni non equivalenti, a condizione che si apporti una modifica adeguata all'equazione.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di differenza nel trasferimento di saturazione rotazionale e di come utilizzare il trasferimento di magnetizzazione per ottenere parametri cinetici e termodinamici in molecole che subiscono scambio chimico. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di occhiali di sicurezza e guanti devono essere sempre adottate durante la preparazione del campione in questa procedura.