Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.

L'obiettivo generale di questo modello è quello di consentire il monitoraggio simultaneo di più saggi chemiotassici o la visualizzazione dei molteplici eventi di segnalazione di una singola cellula chemiotassante. I biologi cellulari di Overdeck hanno sviluppato diversi approcci per quantificare il comportamento chemioterapico delle cellule. Fino a poco tempo fa, eravamo in grado di rispondere a domande chiave nel campo della chemiotassi, come ad esempio come monitorare contemporaneamente più test di chemiotassi.

Il vantaggio principale di questa tecnologia è quello di applicare il principio della microfluidica per generare ingredienti altamente riproducibili e affidabili per più saggi di chemiotassi simultanei ad alta risoluzione in tempo reale. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Xi Wen, un post-doc del nostro laboratorio. Per montare il supporto, utilizzare prima le leve per posizionare la base in posizione verticale in modo che le leve possano inclinarsi verso l'utente.

Quindi, rivestire brevemente la superficie del vetro da 41 millimetri con etanolo al 70% e utilizzare una salvietta per rimuovere con cura l'etanolo. Inserire il vetro nella base del supporto e posizionare un vetrino coprioggetto quadrato da 2 millimetri rivestito in BSA sopra il vetro. Quindi, inserire il piccolo O-ring nella parte inferiore dell'alloggiamento del wafer e montare l'alloggiamento del wafer nella base del supporto, con il foro ellittico sul retro dello strumento.

Tirare in avanti il livello interno della base del supporto in posizione orizzontale per bloccare l'alloggiamento del wafer in posizione. Utilizzare uno spolverino ad aria compressa per soffiare eventuali detriti dall'interno dell'alloggiamento del wafer. Quindi aggiungere 4 millilitri di RPMI 1640 medium, integrati con 0,1% BSA, all'alloggiamento.

A questo punto, montare il chip del dispositivo di analisi della mobilità cellulare rivestito BSA al centro dell'alloggiamento del wafer con la faccia strutturale a contatto con il vetro e con il segno di posizionamento sul retro. Montare le due sporgenze sulla guarnizione di gomma nei fori per fissare la guarnizione alla parte inferiore del wafer clamp e montare l'O-ring grande sulla parte superiore dell'alloggiamento del wafer. Quindi montare il wafer clamp con il foro del sensore sul retro e tirare la leva esterna della base dell'alloggiamento in avanti in posizione orizzontale per bloccare il wafer clamp in posizione.

Una volta assemblato il supporto, posizionare il fondo del supporto su una scatola luminosa per verificare che non ci siano bolle d'aria nei pozzetti. Quindi rimuovere il coperchio, trasferire il gruppo sulla piastra sulla parte superiore dell'unità del dispositivo di analisi della mobilità cellulare e fissare il blocco sensore al supporto. Per eseguire il test di mobilità cellulare, in primo luogo sospendiamo cellule HL60 differenziate in terreno RPMI 1640 integrato con BSA e una concentrazione di due volte dieci al sesto di cellule per millilitro.

Quindi, collegare l'unità del dispositivo di analisi della mobilità cellulare al computer per l'acquisizione dell'immagine e accendere entrambi i dispositivi. Quindi, apri il software del dispositivo di analisi della mobilità cellulare. Nel pannello di controllo dell'immagine della telecamera, utilizzare le linee orizzontali e verticali per regolare la posizione del supporto in tempo reale e centrare il dispositivo nel pannello dell'immagine della telecamera.

Quindi selezionare il canale uno per spostare la telecamera sul canale selezionato e utilizzare Sposta a sinistra o Sposta a destra per regolare la coordinata X della telecamera in modo da centrare il campo visivo orizzontalmente. Per regolare verticalmente l'immagine al centro dello schermo, ruotare la manopola di posizione sul pannello frontale del dispositivo di analisi della mobilità cellulare. Sul pannello di controllo del riscaldatore, impostare la temperatura del supporto su 37 gradi Celsius e la temperatura della piastra su 39 gradi Celsius.

Per controllare la temperatura utilizzando il sensore termico collegato al supporto, fare clic su Calore per avviare il riscaldamento, quindi su Supporto. Nel pannello di ripresa, immettere 15 secondi per l'intervallo e 30 minuti per l'ora per impostare rispettivamente gli intervalli e la durata del test della chemiotassi. Per motivi di sicurezza, selezionare il riscaldatore spento alla fine della scatola di tiro.

Quindi, salva il file, inserisci le specifiche dell'esperimento nel pannello memo e verifica che il dispositivo sia stato centrato in tutti i canali. Ora rimuovi tutto il tampone dal supporto e otto microlitri di tampone dal terzo pozzetto dalla parte superiore del primo canale. Utilizzando una siringa, iniettare due microlitri di cellule nel secondo pozzetto nello stesso canale, monitorando lo schermo in tempo reale per controllare il numero e il flusso di cellule durante l'iniezione.

Quando le cellule sono allineate, aggiungere immediatamente gli otto microlitri di tampone al pozzetto e ripetere l'iniezione cellulare nei canali da due a sei, come appena dimostrato. Dopo che tutte le cellule sono state aggiunte, aggiungere due millilitri di tampone al supporto e aggiungere un microlitro di chemioattrattivo al terzo pozzetto dall'alto nei canali appropriati. Infine, avvia l'acquisizione dell'immagine.

In questo esperimento rappresentativo, le cellule HL60 iniziano la chemiotassi in un percorso rettilineo immediatamente dopo l'iniezione del chemioattrattivo e continuano per tutti i 60 minuti del saggio, coerentemente con i risultati della simulazione di stabilità del gradiente. Il tracciamento del percorso di viaggio e della morfologia delle cellule consente la misurazione quantitativa e il successivo confronto dei comportamenti della chemiotassi, utilizzando un indice di chemiotassi che include la lunghezza totale del percorso, la direzionalità, la velocità e la rotondità delle cellule. L'applicazione di un colorante fluorescente, in combinazione con il chemioattrattivo, consente di stabilire una relazione lineare tra la concentrazione di chemioattrattivo e l'intensità del colorante fluorescente monitorata.

Inoltre, in risposta alla stimolazione chemioattrattiva applicata in modo uniforme, le cellule HL60 mediano una robusta traslocazione di membrana della proteina chinasi tattile GFP D1.In un gradiente chemioattrattivo, le cellule HL60 reclutano attivamente la chinasi nella parte posteriore del bordo d'attacco. Una volta padroneggiato, questo processo può essere completato in 30 minuti se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante seguire rigorosamente le istruzioni del produttore sul gruppo del supporto e monitorare l'iniezione della cella.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della chemiotassi per esplorare la possibilità di saggi multipli di chemiotassi, come un monogenismo ditiostilostilio o altri tipi di sistemi cellulari di mammiferi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare l'unità, eseguire saggi di chemiotassi simultanei o visualizzare contemporaneamente più eventi di segnalazione nelle cellule chemiotassanti.