Name: Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara a indurre la rigenerazione acuta del muscolo scheletrico nei topi mediante iniezione di cardiotossina nel muscolo tibiale anteriore. Questo metodo riproducibile permette di studiare i meccanismi cellulari e molecolari della riparazione muscolare in vivo.

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Ringraziamo la Casa degli Animali e le Strutture di Microscopia Integrata di IGB-CNR. Questo lavoro ha beneficiato di finanziamenti per la ricerca del Settimo Programma Quadro della Comunità Europea nel progetto ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), del Ministero dell'Istruzione-Università-Ricerca (MIUR-PRIN2 010-2011) a G.M. e S.B. e PON Cluster IRMI a G.M., e la fondazione CARIPLO a G.M. e S.B.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida istituzionali per la ricerca degli animali e approvati dal Dipartimento di sanità pubblica, salute degli animali, la nutrizione e la sicurezza alimentare del Ministero della Salute italiano in conformità con la legge sulla sperimentazione animale. procedure dislocazione cervicale possono variare da istituto ad istituto sulla base di IACUC o ai suoi requisiti equivalenti. 1. cardiotossina iniezione nel muscolo tibiale anteriore <ol><li> Preparare una soluzione di 10 micron cardiotossina (CTX) di lavoro diluendo la soluzione cardiotossina magazzino in sterili fosfato-Buffered Saline (PBS) o in acqua prima di iniziare la procedura. Nota: CTX è solubile in acqua a 1 mg / mL. Preparare una soluzione stock 70 micron. Aliquota e conservare a -20 ° C. CTX usato per questo protocollo è una miscela di cardiotoxins aventi un peso molecolare di circa 7.000 Da. ATTENZIONE: Si consiglia di indossaredoppi guanti, una mascherina igienica, e occhiali di sicurezza (in alternativa agli occhiali di sicurezza, si raccomanda di lavorare sotto una cappa) e di essere molto attenti per evitare qualsiasi contatto con la soluzione, anche se diluito. </li><li> Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina (80 mg / kg e 10 mg / kg di massa corporea) o altri anestetici disponibili approvato. </li><li> Con il mouse a faccia in su, spruzzare gli arti posteriori con il 70% di etanolo. Per visualizzare la posizione esatta del muscolo tibiale anteriore (TA), con l&#39;aiuto di un bisturi, tagliare via i capelli nella parte anteriore della gamba, sotto il ginocchio. Nota: nasce Il muscolo TA dal corpo prossimale della tibia, scendendo lateralmente all&#39;osso e termina alla caviglia. La sua lunga tendine estende nel piede attraverso la caviglia (vedere Figura 1A). </li><li> Draw ~ 100 microlitri della soluzione nella siringa tirando indietro lo stantuffo lentamente. </li><li> Rimuovere le bolle d&#39;aria, mantenendo la siringa in posizione verticale (con l&#39;ago verso l&#39;alto). Tirare delicatamente lo stantuffo e tocca il lato della siringa per aiutare eventuali bolle d&#39;aria attaccate alla parte interna del tubo vengono verso l&#39;alto. Premere lentamente lo stantuffo per rilasciare grandi bolle d&#39;aria. Alcune gocce di liquido verrà fuori l&#39;ago. A questo punto, fare in modo di raccogliere il liquido di nuovo nel tubo e non disperderla, data la tossicità del cardiotossina. </li><li> Prelevare la soluzione nella siringa fino al raggiungimento della dose desiderata. Iniettare 20 ml di soluzione CTX per ogni muscolo TA. </li><li> Inserire l&#39;ago nel centro del TA seguendo la posizione dell&#39;osso tibia come guida, il tendine verso il ginocchio. Poiché il TA è un tessuto sottile, effettuare l&#39;iniezione senza andare troppo in profondità (inserire l&#39;ago 2/3 mm di profondità, a circa 10 ° a 20 ° angolo), ed evitare di andare oltre il muscolo stesso (Figura 1A). </li><li> Non estrarre l&#39;ago immediatamente dopo l&#39;iniezione, ma attendere 2 - 3 s per prevenire perditeAll&#39;età di CTX scende dal muscolo. </li><li> Dopo la procedura, posizionare la gabbia su una piastra riscaldata (a 37 ° C) fino a quando i topi sono svegli, poiché l&#39;anestetico e l&#39;etanolo utilizzato riducono la temperatura del corpo. </li></ol> Isolamento 2. tibiale anteriore Nota: I muscoli possono essere isolati in diversi momenti dopo l&#39;iniezione cardiotossina a seconda delle esigenze sperimentali. <ol><li> Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Spruzzare le zampe posteriori con il 70% di etanolo. Durante la procedura, l&#39;animale può essere fissato ad un supporto per tenerlo premuto. </li><li> Tagliare la pelle a livello del tendine prossimale (sopra il piede), inserire una delle lame delle forbici sotto la pelle, e tagliare la pelle verso l&#39;alto, in direzione del ginocchio. Con l&#39;aiuto di una pinza, tirare la pelle ed esporre il muscolo del tutto. Rimuovere con cautela tutta la pelle e il pelo dalla zona di interesse. </li><li> Eliminare la fascia pizzicando o tagliando lentamente (con °in-tip pinzette o con micro sottili forbici sezionare) all&#39;estrema periferia del muscolo sul lato opposto della tibia (Figura 1B). Una volta rotto, rimuovere delicatamente la fascia con l&#39;aiuto di una pinzetta sottile punta; evitare di danneggiare il muscolo sottostante. Nota: Come con altri muscoli e organi, il TA è coperta da fascia (fascia profonda della gamba), un sottile foglio di tessuto connettivo che si trova in profondità sotto la pelle e che deve essere rimosso per isolare facilmente il muscolo sottostante. </li><li> Visualizza la distale del tendine TA e il tendine estensore comune delle dita sopra il piede, che sono giustapposti. Il tendine del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) si trova leggermente al di sotto del tendine TA. I tendini di topi adulti sono visibili ad occhio nudo. </li><li> Rimuovere il muscolo TA seguendo una delle due seguenti tecniche: <ol><li> Tagliare entrambi i tendini con micro multa dissezione forbici e tirarli verso la parte prossimale, holding i tendini con una pinza. Separate le due tendini, tirandoli delicatamente in direzioni opposte per separare i muscoli. </li><li> Con l&#39;aiuto di una pinzetta sottile punta, separare il tendine distale TA dal tendine estensore delle dita facendo passare la punta al di sotto del tendine stesso (Figura 1C, foto in alto). Far scorrere delicatamente le pinzette sotto il TA per separarlo dai muscoli sottostanti (Figura 1C, foto in basso). </li><li> Tenere le pinzette sotto il muscolo per tenerlo leggermente sollevata, tagliare il tendine TA, e tirare delicatamente verso l&#39;alto fino a quando solo l&#39;area sotto il ginocchio è collegato (Figura 1D, foto a sinistra). Tagliare il TA di sotto del ginocchio, seguendo il bordo del muscolo con le forbici (Figura 1D, immagine destra). Nota: Se il muscolo rimane un po &#39;attaccato ai lati, utilizzare micro multa dissezione forbici per contribuire a staccarlo. Nota: Se la pinza non facilmente si adattano al di sotto del TA,è possibile che la fascia non è stato completamente rimosso, e potrebbe essere ancora visibile sulla parte superiore del muscolo. In questo caso, rimuovere completamente la fascia prima di procedere. </li></ol></li></ol> 3. Fresh Tecnica muscolare congelato <ol><li> Mettere una piccola quantità di gomma adragante o un composto adesivo congelamento simili (per esempio, Optimal taglio temperatura (OCT) composto) su una fetta di sughero. Etichettare fetta del sughero sul retro prima del congelamento, se necessario (Figura 2A). </li><li> Per ottenere sezioni trasversali del muscolo, affondare la TA nella gomma adragante inserendo il tendine distale e lasciando circa 3/4 del muscolo esterno, assicurandosi di avere il muscolo in posizione perpendicolare rispetto al tappo (Figura 2A). </li><li> Riempire una lattina di alluminio (in alternativa, una tazza di metallo o di un bicchiere di vetro), con isopentano. Sospendere la lattina di isopentano in una contenente liqui Deward azoto, non consentendo l&#39;azoto liquido entri nella lattina. Nota: Isopentano deve raggiungere la giusta temperatura (da -150 a -160 ° C) per il congelamento ottimale del tessuto. La temperatura corretta è raggiunta quando alcune particelle solide bianche formano sul fondo della lattina e isopentano diventa leggermente viscosa. Nota: Non congelare il campione prima della formazione delle particelle solide, in quanto può portare ad artefatti congelamento. D&#39;altra parte, se il isopentano diventa completamente solida, lasciarla a temperatura ambiente fino a quando non viene scongelato, facendo in modo che alcune particelle bianche sono ancora presenti. </li><li> Utilizzando pinze MIXTER, rapidamente immergere il tappo di sughero con il muscolo in isopentano, mantenendo il muscolo posizionato verso il basso, e fare in modo di liberare il tappo quando è completamente immerso nel liquido. In questo modo, mentre il campione galleggia, solo il lato opposto del tappo deve essere visibile nel liquido. </li><li> Lasciare la sample in isopentano per 1 min. </li><li> Utilizzando pinze MIXTER (o pinze simili), prendere il muscolo ed immergerlo in azoto liquido per almeno 2 minuti. </li><li> Avvolgere i campioni singolarmente in foglio di alluminio etichettati e subito metterli in ghiaccio secco (-70 ° C), o direttamente memorizzarli in una -80 ° C freezer. Nota: Durante la procedura, dai passi 3.4 a 3.7, è estremamente importante mantenere la temperatura corretta e per evitare che i campioni da scongelamento (ad esempio, durante il trasferimento al -80 ° C freezer.). L&#39;aumento dei risultati di temperatura in scongelamento incontrollata e ricongelamento dei microcristalli acqua che sono presenti all&#39;interno del tessuto e alla fine provoca la formazione di artefatti o rottura delle fibre muscolari (visualizzate nelle sezioni di tessuto come grandi buchi bianchi al centro della fibra). </li></ol> 4. Criostato sezionamento di muscoli congelati <ol><li> Regolare la temperatura della camera t criostatoo da -20 a -22 ° C. </li><li> Mettere il stub esemplare, la lama e il campione nella camera di criostato, permettendo loro di equilibrare per almeno 30 min. </li><li> Mettere una piccola quantità di composto di congelamento (ad esempio, OCT compound) sulla matrice del campione ed immergere il tappo con il campione prima che i composti solidifica congelamento. Nel frattempo, posizionare la lama nel supporto lama. </li><li> Allineare il campione e la lama utilizzando le viti fornite per orientare la porta campione con il portalama (Figura 2B). </li><li> Impostare lo spessore della sezione di 10 micron. Procedere per tagliare il tessuto. Per ogni giro della ruota motrice, del portacampioni avanza una distanza controllata verso la lama. </li><li> Posizionare le sezioni su un vetrino polarizzato (da 8 a 10 sezione per slide) (Figura 2C). </li><li> Dopo il sezionamento, conservare i campioni a -80 ° C. Nota: Il campione può essere conservato in un congelatore C -80 ° e riutilizzati per furtheR sezionamento, se adeguatamente manipolato e conservato. </li></ol> 5. routine istologica di colorazione (ematossilina e eosina Macchie) Nota: Diversi macchie istologiche possono essere eseguite su sezioni muscolari secondo l&#39;analisi. Una macchia istologico di routine per l&#39;analisi morfologica e morfometrica è il Ematossilina e eosina (H &amp; E) macchia bichromic. Il ematossilina colora i nuclei di un viola intenso. colorazione nucleare è di contrasto con eosina (rosa / rosso), che colora strutture eosinofili, come le miofibre nel citoplasma. <ol><li> Completamente asciugare diapositive congelati con sezioni per 10 - 15 minuti a temperatura ambiente, presentare le diapositive in un vassoio di colorazione, e mettere il vassoio in un trogolo colorazione. </li><li> Colorare per 1 min con ematossilina. </li><li> Posare il trogolo colorazione sotto un piuttosto debole getto d&#39;acqua di rubinetto per 10 minuti per lavare l&#39;ematossilina. </li><li> Immergere i vetrini per 5 min in etanolo al 95%, se verrà utilizzata una soluzione alcolica di eosina (saltare til passo in caso di una soluzione acquosa eosina). </li><li> Controcolorare per 1 min con la soluzione eosina. </li><li> Risciacquare con acqua per eliminare soluzione eosina eccessivo. Nota: tempistica ottimale della colorazione sia con ematossilina eosina o dovrebbe essere definito per ogni nuovo lotto. </li><li> Disidratare i campioni in una serie graduata di etanolo: 50% e 70% (alcuni secondi ciascuno). Rapidamente immergere in 95% etanolo, seguito da 2 variazioni 100% di etanolo, 5 min ciascuna. </li><li> Pioggia in 2 cambi di xilene, ogni 5 minuti o più. Questa operazione deve essere effettuata sotto una cappa chimica. </li><li> Montare i vetrini con un mezzo di montaggio xilene a base, applicando alcune gocce di mezzo di montaggio sul vetrino e coprire con coprioggetto. Il mezzo di montaggio può essere applicato anche al coprioggetto e il vetrino messo sul vetrino. <ol><li> Evitare la formazione di bolle d&#39;aria tra il vetrino e il vetrino. Per eliminare le bolle d&#39;aria, mantenere la slitta verticale (dopo il montaggio) e spremere l&#39;eccesso momedia unting e bolle d&#39;aria premendo leggermente sul vetrino con una pinza smussato (o uno strumento simile smussata). </li></ol></li><li> Mantenere i vetrini sotto il cofano per alcune ore o durante la notte per lasciare che il xilene evaporare completamente prima di procedere all&#39;analisi. </li><li> Eseguire l&#39;analisi morfologica e morfometrica delle sezioni muscolari rigeneranti H &amp; E-colorati utilizzando immagini seriali non sovrapposte di almeno una intera sezione del muscolo per il mouse. Catturare immagini con un microscopio in campo chiaro, con 20X di ingrandimento. Nota: Si consiglia un numero minimo di 5 topi per ottenere significatività statistica delle misurazioni. Nota: il software di analisi immagine è disponibile per questo scopo, come ad esempio il download gratuito del software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). </li></ol>

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<li>Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiotoxin+and+phospholipase+A+in+the+blockade+of+nerve+conduction+and+depolarization+of+skeletal+muscle+induced+by+cobra+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom.</a> Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Mann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+repair+and+fibrosis+development+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle.</a> Skelet Muscle. 1 (1), (2011).</li>
<li>Pessina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+optimized+strategies+for+inducing+fibrosis+in+vivo%3A+focus+on+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Skelet Muscle. 4 (1), 7(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un protocollo per indurre lesioni acute nel muscolo scheletrico (ovvero, l&#39;iniezione intramuscolare di CTX). È ampiamente usato come un potente strumento per studiare la dinamica di rigenerazione muscolare in vivo. Iniezione CTX induce la degenerazione delle fibre muscolari, che è causato dalla depolarizzazione della sarcolemma e la contrazione delle fibre 12, e innesca la cascata di eventi che conduce alla rigenerazione muscolare. I muscoli scheletrici sono sezionati in...

muscoli scheletrici dei mammiferi adulti sono formate da gruppi di fascicoli di cellule muscolari multinucleate (miofibre) che sono specializzati per la contrazione. Ogni myofiber è un sincizio allungato, circondato dal sarcolemma (membrana plasmatica) e miofibrille contenenti, che sono costituiti da proteine ​​contrattili regolarmente e ripetutamente organizzati (actina e miosina filamenti). Nella vita adulta e, in condizioni di riposo, i muscoli scheletrici hanno un fatturato molto basso di loro mionuclei 1; infatti, le myonuclei, che si trovano alla periferia della myofiber, sotto il sarcolemma, vengono arrestati nella fase G0 del ciclo cellulare e sono in grado di proliferare 1,2. I muscoli scheletrici hanno la peculiare capacità di rigenerare seguenti danni, raggiungendo l&#39;omeostasi dopo diversi eventi di rimodellamento tissutale che sono strettamente legati gli uni agli altri. Dopo una lesione acuta o un trauma, degenerazione è indotta, seguito da processi di rigenerazioneche coinvolgerà diverse popolazioni di cellule, tra cui una popolazione residente di cellule muscolari, le cellule satellite (SCS). Infatti, in assenza di stimoli ambientali, le cellule satelliti sono in uno stato quiescente e si trovano in una nicchia specializzata tra il sarcolemma e 3,4 lamina basale. A seguito di un infortunio o di malattia, SC si attivano, proliferare, migrare verso le aree danneggiate, e alla fine di differenziare, dando luogo a nuova formazione myofibers 5. SC attivate stabilire cross-talk con diverse popolazioni di cellule, cellule infiammatorie soprattutto, che vengono reclutati nel sito del trauma 6-8. Questo cross-talk permette alle cellule di seguire un paradigma regolamentato attraverso il quale i segnali molecolari che guidano modifiche strutturali, portando infine all&#39;omeostasi 9. Oltre SC, cellule infiammatorie e interstiziali, processi di angiogenesi, e gli eventi ri-innervazione sono anche coinvolti, che agisce in modo coordinato per riparare questo altamente organizzato e sStruttura pecialized. C&#39;è grande interesse a studiare diversi aspetti della rigenerazione muscolare, non solo di comprendere la fisiologia del muscolo, ma anche per migliorare le strategie terapeutiche che richiedono la conoscenza profonda di tutto il processo. Diversi approcci sperimentali sono attualmente disponibili per studiare l&#39;identità e funzione delle diverse popolazioni cellulari, le vie di segnalazione e dei meccanismi molecolari coinvolti. modelli murini di danno acuto rappresentano un potente strumento per studiare molti aspetti di questo processo. Diverse tecniche comunemente usato per indurre un danno muscolare acuto consentire ai ricercatori di seguire il processo di rigenerazione in vivo, dalle primissime fasi alla fine del processo. Questo protocollo descrive i passi da iniezione intramuscolare di cardiotossina veleno di serpente-derivato (CTX), che induce miolisi e innesca il processo di rigenerazione, fino all&#39;analisi di campioni di tessuto. Dopo l&#39;iniezione CTX, mice può essere sacrificato a tempi diversi a seconda delle esigenze sperimentali, ei muscoli scheletrici può essere sezionato e trattati per ulteriori analisi. Infine, si descrive il protocollo di colorazione delle sezioni di tessuto per effettuare osservazioni morfologiche e analisi quantitative di base. Questo protocollo consente lo studio della rigenerazione muscolare acuta in vivo in modo altamente riproducibile 10.

<table><tbody><tr><td>Cardiotossina da&nbsp; Naja mossambica mossambica</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per insulina BD Micro-Fine+ Ago 30 G x 8 mm - Da 0,3 mL</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Gomma adragante</td><td>MP BIOMEDICALS,LLC</td><td></td><td></td></tr> 104792 <tr><td>2-metilbutano (isopentano)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>78-78-4.</td><td></td></tr><tr><td>OCT Killik Soluzione per l'inclusione Criostato</td><td>Bio-optica</td><td>&nbsp; 05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo Feather S35</td><td>Bio-optica</td><td>&nbsp; 01-S35</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino Superfrost Plus</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>09-OPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Dumon #5 Pinze con finitura a specchio&nbsp;</td><td>2STRUMENTI BIOLOGICI</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>Forbici dritte affilate/affilate</td><td>2STRUMENTI BIOLOGICI</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Noyes dritte</td><td>2STRUMENTI BIOLOGICI</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a iride fini dritte affilate/affilate 10,5 cm</td><td>2STRUMENTI BIOLOGICI</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Bio-optica</td><td>09-00100</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprivetrino</td><td>BIOSIGMA</td><td>VBS651</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 100%</td><td>sigma-aldrich</td><td>02860-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>J.T. BAKER</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>criostato</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione di acuta muscolo scheletrico rigenerazione da cardiotossina injection

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

rigenerazione muscolare scheletrico è un processo fisiologico che si verifica nei muscoli scheletrici adulti in risposta a infortunio o malattia. rigenerazione del muscolo scheletrico lesione indotta acuta è un potente sistema modello ampiamente utilizzato per studiare gli eventi coinvolti nella rigenerazione muscolare così come i meccanismi e giocatori diversi. Infatti, una conoscenza dettagliata di questo processo è essenziale per una migliore comprensione delle condizioni patologiche che portano alla degenerazione muscolare scheletrico, e aiuta a identificare nuove strategie terapeutiche mirate. Il presente lavoro descrive un protocollo dettagliato e riproducibile per indurre la rigenerazione del muscolo scheletrico acuta nei topi attraverso una singola iniezione intramuscolare di cardiotossina (CTX). CTX appartiene alla famiglia di serpente tossine veleno e causa miolisi di miofibre, che alla fine scatena gli eventi di rigenerazione. La dinamica della rigenerazione muscolare viene valutata mediante analisi istologica delle sezioni muscolari. Il protocollo ancheillustra le procedure sperimentali per dissezione, gelati, e tagliando il muscolo tibiale anteriore, così come la routine colorazione ematossilina e eosina che è ampiamente usato per la successiva analisi morfologica e morfometrica.

H &amp; E colorazione permette la valutazione della morfologia del processo di rigenerazione in punti temporali specifici durante la rigenerazione del muscolo scheletrico. La Figura 3 mostra l'analisi andamento temporale effettuata su muscoli TA feriti di topi wild type. Muscoli sono stati isolati a 3, 7, 15, e 30 giorni dopo l'iniezione CTX, come schematizzato in Figura 3A. Immagini rappresentativi di sezioni trasversali H &amp; E-colorate mostrano le d...

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per indurre rigenerazione muscolare acuta nei topi adulti e successive manipolazioni dei muscoli, come dissezione, gelati, taglio, colorazione di routine, e myofiber analisi sezione trasversale.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere un modello murino di lesione acuta del muscolo scheletrico per studiare il processo di rigenerazione in vivo, dalle primissime fasi fino alla fine del processo. I modelli murini di lesione acuta muscolare sono uno strumento potente per studiare molti aspetti del processo di rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata riproducibilità di tutti i passaggi coinvolti.Per iniziare questa procedura, applicare alcune gocce di etanolo al 70% sull'arto posteriore di un topo anestetizzato. Per visualizzare la posizione esatta del muscolo tibiale anteriore, rimuovere i peli nella parte anteriore della parte inferiore della gamba con un bisturi. Per iniettare la soluzione di cardiotossina, aspirarne 100 microlitri nella siringa.Tenere la siringa in posizione verticale e rimuovere le bolle d'aria. Quindi, inserire l'ago al centro dell'AT dal tendine verso il ginocchio, seguendo la posizione dell'osso della tibia come guida. Eseguire l'iniezione senza andare troppo in profondità, ed evitare di andare oltre il muscolo stesso.Attendere due o tre secondi prima di estrarre l'ago per evitare la fuoriuscita di cardiotossina dal muscolo. Applicare alcune gocce di etanolo al 70% sull'arto posteriore dell'animale soppresso. Tagliare la pelle a livello del tendine prossimale, quindi inserire una delle lame delle forbici sotto la pelle e tagliare la pelle in direzione del ginocchio.Tirare su la pelle per esporre completamente il muscolo. Rimuovere con cura tutta la pelle e i peli dalla zona di interesse. Successivamente, elimina la fascia pizzicando o tagliando lentamente l'estrema periferia del muscolo.Una volta rotta, rimuovere delicatamente la fascia con l'aiuto delle pinzette a punta sottile, evitando di danneggiare il muscolo sottostante. Visualizza il tendine tibiale anteriore distale sopra il piede, quindi separa il tendine tibiale anteriore distale dal tendine estensore delle dita facendo passare la punta della pinzetta sotto il tendine. Fai scorrere delicatamente le pinzette sotto il tibiale anteriore per separarlo dal muscolo sottostante.Tieni la pinzetta sotto il muscolo per tenerlo leggermente sollevato. Tagliare il tendine tibiale anteriore e tirarlo delicatamente verso l'alto fino a quando non è attaccata solo l'area sotto il ginocchio. Successivamente, tagliare il TA sotto il ginocchio, seguendo il bordo del muscolo con le forbici.Metti una piccola quantità di gomma adragante su una fetta di sughero. Inserire il tendine distale del TA nella gomma adragante, e lasciare circa 3/4 del muscolo all'esterno, facendo attenzione ad avere il muscolo in posizione perpendicolare rispetto al tappo. Dopodiché, riempi una lattina di alluminio con isopentano.Sospendere la bomboletta di isopentano in un dewar contenente azoto liquido. Quando l'isopentano raggiunge la temperatura corretta, si formano particelle solide bianche sul fondo della lattina. Immergere rapidamente il tappo con il muscolo nell'isopentano, mantenendo la posizione del muscolo verso il basso.Mentre il campione galleggia, solo il retro del tappo dovrebbe essere visibile nel liquido. Lasciare il campione in isopentano per un minuto. Dopodiché, immergere il muscolo in azoto liquido per almeno due minuti.Quindi, avvolgere i campioni singolarmente in un foglio di alluminio etichettato e metterli immediatamente in ghiaccio secco. Durante la procedura, è estremamente importante mantenere la temperatura corretta ed evitare che il campione si scongeli. In questa procedura, posizionare il tronchetto del campione, la lama e il campione nella camera del criostato, lasciandoli equilibrare per almeno 30 minuti.Quindi, posizionare una piccola quantità di composto di congelamento sul troncone del campione e immergere il tappo con il campione nel composto OCT prima che il composto di congelamento si solidifichi. Posizionare la lama nel portalama. Posizionare il campione nel suo apposito supporto.Tagliare le sezioni con uno spessore di 10 micrometri. Quindi, posiziona le sezioni su un vetrino polarizzato. Dopo il sezionamento, conservare i vetrini a 80 gradi Celsius.In una cappa chimica, asciugare completamente all'aria i vetrini congelati con sezioni per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, inserire i vetrini in un vassoio di colorazione. Colorare le sezioni per un minuto con ematossilina.Successivamente, stendere la vasca di colorazione sotto un getto d'acqua di rubinetto abbastanza debole per 10 minuti per lavare via l'ematossilina. Successivamente, controcolorare le sezioni con una soluzione di eosina per un minuto, quindi sciacquarle con acqua per eliminare l'eccesso di soluzione di eosina. Successivamente, disidratare i campioni in una serie di etanolo graduato al 50%seguito da 70%Successivamente, immergere rapidamente i campioni in etanolo al 95%, seguito da due cambiamenti in etanolo al 100%.Eliminare i campioni in due cambi di xilene, ciascuno per almeno cinque minuti. Per montare le diapositive, applicare alcune gocce del mezzo di montaggio a base di xilene su ciascuna diapositiva e coprirla con un vetrino coprioggetto. Tenere i vetrini nella cappa aspirante per alcune ore o durante la notte.Qui è mostrato lo schema sperimentale della lesione acuta del muscolo scheletrico. Ecco le immagini rappresentative delle sezioni colorate con ematossilina ed eosina dei muscoli trattati con cardiotossina nei giorni indicati dopo l'infortunio. Un paio di fibre necrotiche, che sono racchiuse dalla linea continua nera, sono probabilmente invase dalle cellule infiammatorie.La linea tratteggiata segna un'area delle cellule mononucleate infiltranti. Una singola miofibra immatura con nucleo situato centralmente è indicata dal cerchio nero. Qui si trovano le grandi miofibre eosinofile rigenerate, con i nuclei localizzati centralmente che sono contrassegnati dai cerchi neri.Questo grafico mostra la media dei valori delle dimensioni delle miofibre nucleate centralmente nelle sezioni muscolari TA. E questo grafico mostra la distribuzione dell'area della sezione trasversale della miofibra a 6, 15 e 30 giorni dopo l'iniezione di cardiotossina. Seguendo questa procedura, le sezioni del muscolo scheletrico possono essere utilizzate per eseguire diversi protocolli istologici e di immunofluorescenza per identificare caratteristiche specifiche del tessuto muscolare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indagare sui diversi aspetti del processo di rigenerazione del muscolo scheletrico che seguono una lesione acuta.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un modello murino di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES), una modalità sicuro ed economico clinica, ai muscoli compartimento anteriore viene descritto. Questo modello ha il vantaggio di modificare un dispositivo facilmente disponibile clinica allo scopo di elicitare contrazioni muscolari mirate e specifiche nei topi.

Un modello murino della formazione muscolare da stimolazione elettrica neuromuscolare

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Iniezione percutanea intramiocardico ecocardiografia-guida rappresenta una modalità efficiente, affidabile, e il targeting per la fornitura di agenti di trasferimento di geni o cellule nel cuore murino. Seguendo la procedura descritta in questo protocollo, l'operatore può rapidamente diventare competente in questa versatile tecnica, mini-invasiva.

Ultrasound-guided transtoracica intramiocardico iniezione nei topi

Descriviamo un protocollo in vivo per misurare la dorsiflessione del piede in seguito alla stimolazione del nervo peroneo e alla contrazione del compartimento crurale anteriore dell'arto posteriore del ratto. Tali misurazioni sono uno strumento traslazionale indispensabile per valutare la patologia del muscolo scheletrico e gli approcci di ingegneria tissutale alla riparazione e alla rigenerazione muscolare.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull'evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.

Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.

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Questo protocollo descrive l'uso del modello di attività contrattile cronica di esercizio per osservare gli adattamenti indotti da stimolazione del muscolo scheletrico nell'arto posteriore del ratto.

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Descriviamo un metodo in vivo per studiare la perdita funzionale di un gene specifico nelle cellule satellitari utilizzando una combinazione di lesione mediata dalla cardiotossina del muscolo scheletrico e l'iniezione di un siRNA auto-disporsi.

Analisi della funzione cellulare satellitare durante la rigenerazione muscolare scheletrica mediante lesione cardiotossina e iniezione di siRNA auto-consegnante In Vivo

Questo protocollo descrive un semplice dispositivo che imita il metodo del rullo di Ding, stabilisce un modello di ratto di lesione muscolare scheletrica e utilizza la colorazione ematossilina-eosina per osservare la patologia del tessuto danneggiato e il test di immunoassorbimento enzimatico per rilevare i cambiamenti nei marcatori di danno sierico.

Imitazione del metodo di rotolamento di Ding sulla lesione muscolare indotta da Notexin nei ratti

Il protocollo qui presentato consente l'identificazione e l'analisi ad alta dimensionalità delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici mediante citometria di massa a singola cellula e la loro purificazione mediante FACS per studi approfonditi della loro funzione. Questo approccio può essere applicato per studiare le dinamiche di rigenerazione in modelli di malattia e testare l'efficacia degli interventi farmacologici.

Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità

Impara a indurre la rigenerazione acuta del muscolo scheletrico nei topi mediante iniezione di cardiotossina nel muscolo tibiale anteriore. Questo metodo riproducibile permette di studiare i meccanismi cellulari e molecolari della riparazione muscolare in vivo.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

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