Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

L'obiettivo generale di questo protocollo di acquisizione dell'affinità è isolare complessi proteici endogeni da cellule di mammifero. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare e molecolare, come ad esempio quali proteine si formano insieme in moduli funzionali fisicamente collegati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono osservare contemporaneamente numerose interazioni fisiche associate alla proteina bersaglio di interesse.

Coltiva da uno a otto grammi di cellule come descritto nel protocollo di testo. Versare il terreno di coltura in un bicchiere grande. Quindi, metti il piatto di coltura sul ghiaccio in una grande vaschetta rettangolare.

Aggiungere 20 millilitri di soluzione salina ghiacciata 1x tamponata con fosfato, o PBS, alla piastra di coltura e rilasciare le cellule dalla piastra utilizzando un raschietto cellulare di grandi dimensioni. Trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri pre-raffreddata con ghiaccio. Aggiungi altri 10 millilitri di 1x PBS ghiacciato allo stesso piatto.

Raccogliere le cellule rimanenti e trasferirle nella provetta da 50 millilitri. Ripeti questo processo per ogni piatto. Le sospensioni cellulari di diverse piastre possono essere combinate per ridurre il numero di campioni e i rifiuti di plastica.

Quindi, centrifugare i campioni per cinque minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, versare con cura il surnatante. Risospendere ogni pallina in dieci millilitri di 1x PBS ghiacciato.

Consolidare i pellet risospesi fino a cinque per tubo da 50 millilitri. Lavare i tubi vuoti con 10 millilitri di PBS. Aggiungere la soluzione ai campioni consolidati e centrifugare come prima.

Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet in 10 millilitri di 1x PBS ghiacciato. Togliere lo stantuffo da una siringa da 20 millilitri e metterlo da parte. Tappare l'ugello della siringa, posizionare la siringa all'interno di un tubo da 50 millilitri e trasferirvi la sospensione cellulare.

Centrifugare per cinque minuti a 1000 x g, quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante con una pipetta a punta fine collegata a un sistema di trappola a vuoto fino a quando lo strato superiore di cellule inizia ad essere aspirato. Ciò si traduce in un pellet a celle umide.

Aprire la siringa, inserire lo stantuffo e far gocciolare le cellule direttamente in un grande becher di plastica riempito di azoto liquido contenuto in un bagno di azoto liquido in una scatola di polistirolo. Immergere con forza le cellule rimanenti dalla siringa. Quindi, versare le cellule congelate in provette da 50 millilitri.

Tappare le provette senza stringere per consentire l'evaporazione dell'azoto liquido in eccesso. Tienili per una notte a 80 gradi Celsius. Stringere completamente i tappi il giorno successivo.

Le celle congelate possono essere conservate in questo modo a 80 gradi Celsius fino alla criomacinazione. Rimuovere le perle di cella dal congelatore a 80 gradi Celsius e metterle in un portaprovette da 50 millilitri in un bagno di azoto liquido. Pre-raffreddare un barattolo da 50 millilitri, due palline da 20 millimetri e il coperchio del barattolo in un secchiello del ghiaccio rettangolare pulito contenente azoto liquido.

Inoltre, pre-raffreddare un isolante in PTFE. Usa un set di dischi o una manica e un disco. Posizionare l'apposito contrappeso sul mulino.

Usando una pinza, posizionare le due sfere di macinazione da 20 millimetri preraffreddate e le celle congelate all'interno della giara di macinazione preraffreddata. Aggiungere l'azoto liquido nel barattolo fino a metà pieno, posizionare il coperchio sul barattolo e trasferire il gruppo al macinino. Bloccare il gruppo in posizione ed eseguire tre cicli di fresatura, utilizzando un programma di 400 giri/min, tre minuti, rotazione inversa ogni minuto e nessuna interruzione dell'intervallo.

È fondamentale sentire le sfere sferragliare durante la fresatura, questo indica che le sfere si stanno scontrando e polverizzando il materiale. La mancata udienza di questo suono significa che la fresatura non è in corso. Al termine dei tre cicli di macinazione, riportare il vasetto in azoto liquido e lasciarlo riposare momentaneamente a raffreddare.

Rimuovere con cautela il coperchio. Rimuovere le palline con una pinza e trasferire la polvere in un tubo da 50 millilitri pre-raffreddato utilizzando una spatola pre-raffreddata. Si noti che l'aggiunta di azoto liquido al barattolo può aiutare a rimuovere la polvere incrostata sulle palline.

Per la preparazione dell'estratto cellulare, pesare 100 milligrammi di polvere cellulare in una provetta per microfuge preraffreddata da 1,5 o due millilitri. Tarare una bilancia analitica con il tubo di microfuga vuoto. Erogare la polvere cellulare nella provetta utilizzando un cucchiaio o una spatola raffreddati con azoto liquido.

Controllare la massa della polvere erogata all'interno della provetta sulla bilancia analitica prima di riportare la provetta in azoto liquido. Aprire la provetta con la polvere cellulare e lasciarla riposare a temperatura ambiente per un minuto per rilasciare la pressione all'interno della provetta ed evitare il congelamento immediato del tampone di estrazione quando viene aggiunto alla polvere. Aggiungere al tubo 400 microlitri di estrattore, integrato con inibitori della proteasi.

Agitare brevemente il tubo e poi trattenere il ghiaccio. Utilizzare un ultrasuonatore a micro punta per dare al campione un breve impulso a bassa energia e disperdere eventuali aggregati. Chiarificare l'estratto per centrifugazione.

Infine, rimuovere il surnatante e procedere all'acquisizione dell'affinità. Per prelavare il mezzo di affinità, posizionare i tubi contenenti perle paramagnetiche accoppiate ad anticorpi sul magnete. Le perle si accumuleranno sul lato del tubo in pochi secondi, consentendo la rimozione della soluzione di conservazione.

Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di estrazione alle perline. Agitare brevemente a velocità media per mescolare. Inoltre, fai girare le provette in una mini centrifuga per raccogliere tutto il contenuto sul fondo della provetta.

Quindi posizionare i tubi sul magnete e aspirare la soluzione. Avviare la cattura di affinità trasferendo l'estratto di cellule chiarificato nelle provette contenenti il terreno di affinità prelavato e il vortice brevemente. Incubare le provette per 30 minuti a quattro gradi Celsius mescolando delicatamente e continuamente su una ruota rotante.

Le perle devono rimanere sospese per tutta l'incubazione. Aspirare il surnatante e lavare le perle tre volte con un millilitro di tampone di estrazione a freddo. Per eluire le proteine, aggiungere il tampone del campione della pagina SDS senza agente riducente, per mitigare il rilascio di catene anticorpali dalle sfere.

Incubare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente con agitazione. Raccogliere e salvare il surnatante, quindi sottoporre i campioni alla pagina SDS, seguita dalla colorazione delle proteine utilizzando tecniche standard. Le singole bande proteiche possono essere asportate per l'identificazione, oppure l'intero campione può essere caratterizzato in un'unica analisi mediante elettroforie del campione solo brevemente.

Il materiale che comprende il mezzo insolubile utilizzato per la cattura dell'affinità può influenzare il proteoma recuperato. Qui sono mostrate le perle magnetiche, l'agarosio impregnato di ferro e l'agarosio tradizionale. Ogni terreno è stato accoppiato ad anticorpi anti-FLAG M2 e utilizzato per catturare la fosfatasi alcalina batterica marcata con FLAG e aggiunta in estratti prodotti da cellule HEK 293 criofresate.

Le microsfere magnetiche su scala micron hanno mostrato il profilo più pulito, indicando un livello relativamente basso di adsorbimento proteico non specifico. Il metodo della lisi cellulare può anche influenzare il proteoma recuperato. Qui, un complesso proteico endogeno è stato sottoposto a cattura di affinità da estratti cellulari criomacinati o sonicati.

Sono stati osservati meno contaminanti ad alta massa quando l'estratto cellulare è stato prodotto da polvere di cellule criofresate. Anche se i supporti magnetici possono presentare un fondo inferiore rispetto ad altri supporti, l'anticorpo stesso può facilitare l'adsorbimento della contaminazione falsamente positiva, soprattutto in assenza del suo antigene bersaglio. Per determinare il legame di fondo apportato dal mezzo magnetico anti-FLAG quando i paratopi anticorpali sono, o non sono occupati, sono stati condotti esperimenti di cattura di affinità simulata utilizzando estratti di cellule HEK 293T in presenza o assenza di un peptide FLAG spike-in 3x.

In assenza del suo epitopo affine, il terreno alfa FLAG cattura un livello rilevabile di proteine di fondo che possono essere evitate in modo competitivo con il peptide 3x FLAG ed eluse in misura maggiore dal tampone campione della pagina SDS. Una specie contaminante dominante è stata osservata tra i 37 e i 50 kilodalton. In presenza di un epitopo concorrente, sia le eluzioni basate su FLAG 3x che quelle basate su SDS sono relativamente libere dal legame proteico di fondo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare con attenzione, rapidità e precisione. Tieni traccia delle tue procedure e delle eventuali variazioni osservate, per scoprire quali passaggi sono più critici per i tuoi risultati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettrometria di massa, la centrifugazione rateo-zonale e la microscopia elettronica per analizzare la composizione della miscela, il suo livello di omogeneità e le dimensioni e la forma dei complessi macromolecolari costituenti.

Dopo il suo sviluppo, la cattura dell'affinità ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare le composizioni dei complessi proteici fisiologici con dettagli senza precedenti, che rimane uno sforzo di ricerca globale in corso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le cellule mammiliane per la criomacinazione e come eseguire la cattura di affinità di una proteina di interesse.