Name: La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a preparare fette oblique del midollo spinale da topi P2-P11 per la stimolazione delle radici ventrali. Questa tecnica consente l'identificazione affidabile dei motoneuroni e lo studio delle cellule ventrali innervate dai collaterali assonali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer per il loro aiuto nel prendere le fotografie. Gli autori ringraziano anche Arjun Masukar e Tobias Bock per la correzione del manoscritto. sostegni finanziari sono stati forniti dalla Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), il NIH-NINDS (R01NS077863), il Thierry Latran Foundation (OHEX Project), l&#39;associazione francese per la miopatia ( concessione numero 16026) e target SLA sono ringrazia. Felix Leroy è stato il destinatario di un &quot;Contratto di Dottorato&quot; presso l&#39;Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive europee (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e la legislazione francese, e sono state approvate dal comitato etico Paris Descartes University. 1. midollo spinale Fetta Preparazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni giornaliere o un giorno di anticipo. Se tenuto durante la notte, bolla con 95% O 2 e il 5% di CO 2 e conservare in frigo in bottiglie ben chiusi. <ol><li> Preparare bassa Na + fluido artificiale cerebrospinale (ACSF): 3 mm KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mm di saccarosio, 26 mm NaHCO 3, 0,8 mm CaCl 2, 8 mm MgCl 2, 25 mM di glucosio, acido ascorbico 0,4 mm, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvato. Bubble con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,4). Dal momento che Na-kynurenate è spesso difficile da sciogliere, assicurarsi di acquistare quello elencato nella tabella dei materiali. </li><li> Preparare Solu K-gluconatozione: 130 mm K-gluconato, 15 mm KCl, 0,05 mm EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM di glucosio, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvato, portato a pH 7,4 con KOH. </li><li> Preparare ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO 3, 25 mM glucosio, 0.4 mM acido ascorbico, 2 mM Na-piruvato. Bubble con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,4). </li><li> Prima dell&#39;inizio della dissezione, sciogliere 2% agar in 80 ml della soluzione di K-gluconato e mantiene caldo a 60 ° C. </li></ol></li><li> intracardiaca perfusione <ol><li> Eseguire questa preparazione sui topi maschi e femmine, di età compresa da P2 a P11. </li><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di 0,1 ml di 25 mM di sodio pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> L&#39;utilizzo di aghi o nastro, immobilizzare il mouse sul dorso su un grande piatto di Petri riempita di silicone. Utilizzare un Microscopio di dissezionee per il resto della dissezione. </li><li> Tenendo la punta dello sterno, sollevare il torace e tagliare la membrana usando forbici sottili. Quindi aprire il petto su entrambi i lati da taglio attraverso le costole per esporre il cuore. </li><li> Tagliare l&#39;atrio destro prima di pungere il ventricolo sinistro con un ago 27G. </li><li> Profumato con ghiacciata basso Na + ACSF. Dopo 30 sec, bassa Na + ACSF va visto scorre fuori dell&#39;atrio. Bassa quantità di sodio impediscono alle cellule di chiodare e riducono la morte cellulare durante la dissezione. </li><li> Tenere premuto l&#39;ago nel cuore sotto il microscopio da dissezione fino fegato diventa giallo quando il sangue viene drenato. </li></ol></li><li> Dissezione del midollo spinale <ol><li> Decapitare l&#39;animale e metterlo sul suo stomaco. </li><li> Rimuovere rapidamente la pelle del dorso (Figura 1A1). Fare due tagli attraverso le spalle e scendendo la gabbia toracica (Figura 1A2). Poi tagliare il cordone, come low possibile nella sezione caudale per isolare la colonna vertebrale con l&#39;inizio delle nervature dalla parte inferiore dell&#39;animale. Vibrazione di nuovo l&#39;animale e rimuovere le viscere ancora attaccato alle costole. </li><li> Trasferire la colonna vertebrale ad un altro, più piccolo di silicio pieno capsula di Petri e utilizzare 4 perni di insetti per tenerlo dorsale rivolta verso l&#39;alto (Figura 1A). </li><li> Continuamente profumato l&#39;animale con ACSF CarboGen-gorgogliare (a circa 4 ° C) durante l&#39;esecuzione di una laminectomia del lato dorsale, ed esponendo il midollo spinale dalla fine rostrale (Figura 1B). Per fare ciò, inserire la punta di forbici sottile tra l&#39;osso e il midollo spinale e tagliare l&#39;osso a poco a poco dalla fine rostrale, facendo attenzione a stare lontano dalla sostanza bianca. Alternate su ciascun lato mentre con una pinzetta per tenere lontano il gruppo di osso già tagliato (Figura 1B1). </li><li> Utilizzando le più piccole forbici primavera disponibili e pinzette, sollevare la dura e tagliaresu entrambi i lati sostenendo la parte allentata della dura per evitare di danneggiare il midollo spinale con le forbici. Tagliare lungo l&#39;asse rostro-caudale. NOTA: La dura è una membrana continua trasparente semi; a questa età la pia madre è troppo fragile e si sfaldi durante la dissezione e taglio (Figura 1B2). </li><li> Una volta che la dura madre è uso rimosso un vetro smussato o punta di plastica per spingere delicatamente il cavo sul lato sinistro della scanalatura formata dalla colonna vertebrale mezzo taglio, e tagliare le radici ventrali e dorsali sul lato destro, partendo dal lato rostrale , lontano da dove entrano il cavo (alcuni mm almeno, Figura 1B2). </li><li> Ripetere l&#39;operazione sul lato sinistro, sempre passando da rostrale a caudale. Se mancino, partire dal lato sinistro e poi spostarsi verso il lato destro. </li></ol></li><li> Incorporare in agar <ol><li> Infilare il cavo della colonna vertebrale. Utilizzare un perno insetto più piccolo da definireil cavo con dorsale superficie e rimuovere delicatamente qualsiasi pezzo di membrana ancora collegato ad esso (Figura 1C1). </li><li> Una volta puliti, tagliare entrambe le estremità (Figura 1C2). Inserire un perno insetto piegato nella parte anteriore del cavo di manipolare il cordone e notare il suo orientamento (freccia in Figura 1C2). Poi il trasferimento del midollo spinale a una soluzione K-gluconato ghiacciata. NOTA: Questa soluzione imita la composizione intracellulare del QCS e impedisce alle cellule di morire di shock osmotico una volta che i motoneuroni saranno tagliati 26. </li><li> Una volta che il midollo spinale è all&#39;interno della soluzione intracellulare, prendere il bicchiere con l&#39;agar dal bagno secco e raffreddarlo su una miscela di acqua e ghiaccio. </li><li> Continuate a mescolare mentre la misurazione della temperatura. Quando la temperatura raggiunge i 38 ° C immergere il midollo spinale, tenendolo per il perno di insetti e posizionarlo lato rostrale verso il basso. Assicurarsi che il midollo spinale è come straight possibile, lontano dalle pareti, parte caudale leggermente verso l&#39;alto (Figura 1D1). </li><li> Lasciare il bicchiere nella miscela di acqua e ghiaccio per consentire l&#39;agar solidificare il più rapidamente possibile. Assicurarsi che rimanga al suo posto e che il cavo è più diritta possibile (Figura 1D1). </li></ol></li><li> Affettare <ol><li> Dopo solidificazione, tagliare il blocco agar contenente il midollo spinale in modo tale che la base del blocco è ad un angolo di 35 ° con la parte lombare del cavo (freccia in Figura 1D2). La superficie dorsale deve essere rivolto lontano dalla base (Figura 1D2). NOTA: Questo è un passo fondamentale nella procedura, per mantenere la continuità delle piscine motoneurone alle radici ventrali da cui escono. </li><li> Incollare il blocco nella camera del vibratome con colla cianoacrilato. Immergerlo in soluzione K-gluconato e aggiungere slushed soluzione K-gluconato congelato per mantenereil bagno fresco (al di sotto di 2 ° C). </li><li> Tagliare 350 - 400 micron di spessore fette di regione lombare (identificabili dalla sua curvatura e diametro maggiore). Nel suo corretto orientamento (vedi 1.4.1.), Utilizzare la lama per tagliare dalla dorsale alla superficie ventrale e rendere fette continuamente più rostrale. In genere, ci sono 4-5 fette adatti con radici ventrali si estendono o più di 2 mm. Utilizzare i seguenti parametri: 10 ° angolo, frequenza di vibrazione di 70 Hz e 10 mm / min velocità di taglio. </li></ol></li><li> incubazione <ol><li> Trasferire le fettine di ACSF a 34 ° C. Dopo circa 30 minuti, raffreddare le fette fino a RT e iniziare la sessione di registrazione. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione A1:. La rimozione della pelle del dorso per esporre la colonna dorsale A2:Taglio delle spalle e le costole per liberare la dorsale della colonna B1:. Colonna vertebrale appuntato sulla capsula di Petri silicone-riempita (lato dorsale fino, lato caudale sinistra) B2:. Lo stesso con il midollo spinale esposto e sezionato C1:. Midollo spinale isolato . (lato rostrale sinistra) C2: midollo spinale pronto per essere incorporato (fino lato ventrale, lato rostrale a sinistra). Nota il perno di insetto più piccolo sul lato rostrale D1:.. Midollo spinale nel bicchiere agar (lato rostrale Dow, lato ventrale rivolto verso il basso) D2: Tagliare blocco di agar con il midollo spinale incorporato. Nota l&#39;angolo di 35 ° le forme del midollo spinale con la base del blocco e l&#39;ampliamento lombare (freccia). Barre di scala 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Posizionamento del Slice nella Camera NOTA: Veradici ntral sono di dimensioni variabili. <ol><li> Preparare una scatola di vari pipette con puntali di diametro da 40 a 170 micron in anticipo. Per preparare pipette di aspirazione, preparare molte pipette con un lungo cono. Con un coltello diamante, effettuare un taglio in posizioni diverse. Poi sotto un microscopio da dissezione, romperlo colpendo la punta con una pinzetta. </li><li> Rimuovere la camera dal microscopio registrazione e posizionarlo sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Selezionare una slice che contiene una radice ventrale lunghezza sufficiente (2 mm o più) per essere montato su un elettrodo di stimolazione di aspirazione. Selezionare il corretto orientamento della fetta con le radici ventrali verso l&#39;alto (Figura 2A) e delicatamente tagliare l&#39;agar intorno alle radici ventrali lasciando il resto del agar intorno fetta (Figura 2B). NOTA: Perché la agar è più solido rispetto alle fetta, questo permetterà i fili di ancoraggio della fetta di riposare sul agar, piuttosto che sulla fetta e quindi l&#39;unanchor non danneggia il tessuto. Assicurarsi che i fili della ancoraggio della fetta sono sopra la piscina motoneuroni (in rosso nella figura 2C). </li><li> Montare la camera posteriore sul microscopio e continuamente profumato camera di registrazione con ACSF ad una velocità di 1 - 2 ml / min, a temperatura ambiente. Usando una pipetta di vetro riempito con ACSF e collegato ad una siringa, succhiare uno della radice ventrale (freccia in Figura 2C). Al fine di ottenere una buona stimolazione della radice ventrale, la punta della pipetta deve essere stretto intorno alla radice ventrale. Un polo dovrebbe essere l&#39;elettrodo stimolante e l&#39;altro nella vasca (o connesso al riferimento elettrodo patch-bloccaggio). </li><li> Ottenere registrazione patch-clamp della cellula-tipo desiderato e registrare l&#39;effetto di stimolazione della radice ventrale come descritto previsouly 10. <ol><li> Qui, utilizzare un amplificatore per l&#39;acquisizione dati. Filtro registrazioni cellule intere a 3 kHz. Digitalizzare a 10 kHz. Compensare resistenza ponte in curreModalità nt morsetto. </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figura 2. ventrale Root Preparazione A: fetta midollo spinale lombare incorporato nel agar con la radice ventrale rivolto verso l&#39;alto. B: la fetta del midollo spinale lombare con le radici ventrali liberati dal agar C:. Fetta midollo spinale lombare con un elettrodo stimolante strettamente collocato intorno alle radici ventrali (freccia) . Si noti la posizione delle cellule Renshaw che esprimono fluorescenza rossa nel chrna2-Cre del mouse 28 incrociata con la giornalista del mouse R26 Tom 17. Barre scala 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li>
<li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li>
<li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li>
<li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417(2007).</li>
<li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li>
<li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals%3A+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li>
<li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li>
<li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86(1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li>
<li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G%2893A-Low%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li>
<li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li>
<li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li>
<li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li>
<li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li>
<li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li>
<li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li>
<li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li>
<li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li>
<li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gower%27s+tract+and+spinal+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li>
<li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatr+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li>
<li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li>
<li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-%2C+T-%2C+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li>
<li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

affettare obliqua del midollo spinale è importante in quanto consente per la stimolazione unilaterale delle piscine del motoneurone e cellule Renshaw in un unico segmento vertebrale in modo affidabile, completa e specifica. Inoltre, consente una rapida identificazione, elegante e non ambigua dei motoneuroni registrati. Successivamente, si metterà in evidenza i vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di preparazione fetta, e poi ci sottolineare le insidie ​​più comuni da evitare durante l&#39;esecuzione di qu...

Storicamente, le registrazioni del motoneurone utilizzando sharp-elettrodi sono stati condotti in vivo su animali di grossa taglia come gatti o topi 1 o su un isolato intero midollo spinale nei topi 2. L&#39;emergere della tecnica di registrazione patch-clamp nel corso del 1980, chiamato per l&#39;accesso diretto al motoneurone somas come guarnizioni doveva essere raggiunto sotto la guida visiva. Così, il midollo spinale preparazione fetta è stato raggiunto facilmente a partire dai primi anni 1990 3. Tuttavia, la preparazione fetta precoce spesso non consentiva la stimolazione delle radici ventrali. Per quanto a nostra conoscenza, solo due studi hanno riportato la stimolazione successo delle radici ventrali a fette trasversali, e nessuno è stato ottenuto da topi 4,5. In questo articolo presentiamo una tecnica per ottenere valide fette del midollo spinale di topi neonati (P2 - P11) in cui la piscina motoneuroni conserva le sue radici ventrali partenza assoni. Sfogola stimolazione della radice ral innesca potenziale d&#39;azione antidromic di nuovo nelle somas della piscina motoneuroni in uscita dalla stessa radice ventrale. Si eccita anche gli obiettivi collaterali motoneurone, altri motoneuroni 6-10 e le cellule Renshaw 11-13. Dal momento che solo motoneuroni inviano i loro assoni le radici ventrali, usiamo la registrazione dei potenziali d&#39;azione antidromic come un modo semplice e definitivo per physiologicaly identificare motoneuroni 10. Oltre a utilizzare criteri elettrofisiologici e morfologici potenzialmente non inclusivi o fuorvianti per confermare l&#39;identità del motoneurone, recenti studi sui motoneuroni del midollo spinale anche invocato noioso e che richiede tempo post hoc colorazioni 16. Tale identificazione viene solitamente eseguita solo su un campione delle cellule registrate. Altre strategie di identificazione basano su linee di topi in cui i motoneuroni esprimono fluorescenza endogena <sup&gt; 17-19. Tuttavia, utilizzando i marcatori geneticamente codificate può essere difficile in giovane età, quando l&#39;espressione marcatore è ancora variabile o se lo studio richiede già utilizzando una linea di topi transgenici. In alternativa, azione antidromic potenziali registrazioni possono essere effettuate sistematicamente su tutti i topi dall&#39;insorgenza della registrazione cellule. Gli sperimentatori che lavorano su intatti i preparativi del midollo spinale nel gatto, ratto e nel topo, hanno usato in modo affidabile queste tecniche di identificazione dal 1950 1,2,20,21. In condizioni ottimali, siamo stati in grado di suscitare potenziali d&#39;azione antidromic praticamente da tutti i motoneuroni registrati. Inoltre, la stimolazione della radice ventrale può essere utilizzata per eccitare affidabile altre motoneuroni 22,23 o loro bersagli. le cellule Renshaw 10,24,25. Vi presentiamo qui le applicazioni della stimolazione della radice ventrale, sotto forma di azione antidromic potenziali registrazioni dal motoneurone somas, così come l&#39;eccitazione delle cellule Renshaw.

<table><tbody><tr><td>Na-chinurenato</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>si dissolve meglio di altre marche</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Qualità Biologica</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucosio&nbsp;</td>Acido ascorbico <td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>acido gluconico</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di cesio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici a molla - 2,5 mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>utilizzare solo per il taglio della dura, potrebbe danneggiarsi se si tagliano le ossa</td></tr><tr><td>Stimolatore</td><td>A-M Systems</td><td>Stimolatore a impulsi isolato Modello 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Microtomo vibrante Campden</td><td>7000 - Modello 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

la preparazione di oblique spinal cord fette per ventrale root stimolazione

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

registrazioni elettrofisiologiche da fette del midollo spinale hanno dimostrato di essere una tecnica preziosa per indagare su una vasta gamma di questioni, dal cellulare alla proprietà della rete. Mostriamo come preparare fette oblique vitali del midollo spinale di topi giovani (P2 - P11). In questa preparazione, i motoneuroni mantengono le loro assoni che esce dalle radici ventrali del midollo spinale. La stimolazione di questi assoni suscita back-propaganti potenziali d&#39;azione che invadono il somas motoneurone ed eccitanti collaterali del motoneurone nel midollo spinale. La registrazione dei potenziali d&#39;azione antidromic è un modo immediato, definitivo ed elegante per caratterizzare l&#39;identità del motoneurone, che supera gli altri metodi di identificazione. Inoltre, stimolando le collaterali motoneurone è un modo semplice e affidabile per eccitare i bersagli collaterali dei motoneuroni nel midollo spinale, come altri motoneuroni o Renshaw cellule. In questo protocollo, vi presentiamo le registrazioni antidromic dal motoneurone somas così come l&#39;eccitazione delle cellule Renshaw, derivante dalla stimolazione della radice ventrale.

La conferma di motoneuroni identità utilizzando Potenziali antidromica azione cellulare il targeting Motoneuroni si trovano nel corno ventrale (visibile in rosso nella Figura 2C). Inizia da fascio di assoni che formano la radice ventrale e salire fino a quando il fascio si disperde completamente e si comincia a vedere...

Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare sezioni oblique del midollo spinale che permettano la stimolazione delle radici ventrali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'identificazione dei motoneuroni per la stimolazione delle radici ventrali e lo studio delle cellule ventrali innervate dai collaterali assonici dei motoneuroni. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando avevamo bisogno di un modo affidabile per stimolare le cellule ventrali.I principianti di questo metodo potranno incontrare difficoltà a causa della complessità nell'eseguire correttamente le diverse fasi della dissezione. Iniziare perfundendo un topo da P2 a P11 con ACSF a basso contenuto di sodio. Dopo aver decapitato il topo e rimosso la pelle sulla schiena, effettuare due tagli attraverso le spalle e lungo la gabbia toracica.Quindi, tagliare il midollo spinale il più in basso possibile nella sezione caudale per isolare la colonna vertebrale e le costole dalla parte inferiore dell'animale. Capovolgere la colonna vertebrale e rimuovere le viscere ancora attaccate alle costole. Trasferire la colonna vertebrale in un altro piatto di Petri più piccolo, riempito di silicone.Aggiungere ACSF freddo e insufflare carbogeno, quindi utilizzare quattro puntine da insetto per fissare il tessuto con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Eseguire quindi una laminectomia del lato dorsale inserendo prima la punta di un paio di forbici fini tra l'osso e il midollo spinale e tagliando l'osso a partire dall'estremit&agrave; rostrale, avendo cura di mantenere una certa distanza dalla sostanza bianca. Alternare i tagli su ciascun lato, utilizzando pinzette per trattenere la striscia ossea gi&agrave; recisa.Successivamente, utilizzare pinzette piccole per sollevare la dura e forbici piccole per tagliare lungo l'asse rostro-caudale su entrambi i lati. La rimozione della dura è un passaggio fondamentale. Vale sicuramente la pena impiegare alcuni minuti in più per eseguire questa operazione accuratamente.Dopo aver rimosso la dura, utilizzare una punta di vetro smussata per spingere delicatamente il midollo verso il lato sinistro della scanalatura formata dalla colonna vertebrale tagliata a metà. Quindi tagliare le radici ventrali e dorsali dal lato illuminato il più lontano possibile dal punto in cui entrano nel midollo. Ripetere l'operazione sul lato sinistro, procedendo sempre da rostrale a caudale.Dopo la dissezione, estrarre delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale. Quindi utilizzare un piccolo ago per insetti per fissare il midollo con la superficie dorsale rivolta verso l'alto. Rimuovere con cura eventuali frammenti di membrana aderenti.Dopo averlo pulito, tagliare entrambe le estremità del cordone e inserire un ago per insetti piegato nella parte anteriore del cordone per indicarne l'orientamento. Successivamente, trasferire il midollo spinale in una soluzione intracellulare fredda di ghiaccio. Poi, raffreddare l'agar fuso precedentemente preparato su una miscela di ghiaccio e acqua.Mescolare l'agar mentre si misura la temperatura. Quando la temperatura dell'agar raggiunge i 38 gradi Celsius, tenere il midollo spinale con il perno per insetti e immergerlo nell'agar, con il lato rostrale verso il basso. Assicurarsi che il midollo spinale sia il più dritto possibile, lontano dalle pareti, con la parte caudale leggermente rivolta verso l'alto.Lasciare il becher nella miscela di ghiaccio e acqua per consentire al agar di solidificare intorno al cordone il più rapidamente possibile. Dopo la solidificazione, tagliare il blocco di agar contenente il midollo spinale in modo che la base del blocco formi un angolo di 35 gradi con la parte lombare del cordone. La superficie dorsale deve essere rivolta lontano dalla base.Incollare il blocco nella camera del vibratomo utilizzando colla a base di cianoacrilato. È fondamentale montare correttamente il blocco per mantenere la continuità dei gruppi motori con le radici ventrali attraverso cui fuoriescono. Immergere il blocco in soluzione di gluconato di potassio.Impostare i parametri del vibratomo. Successivamente, tagliare fette spesse da 350 a 400 micron della regione lombare, riconoscibile per la sua curvatura e diametro maggiore. Trasferire le fette idonee nell'ACSF a 34 gradi Celsius.Normalmente, ci sono quattro o cinque sezioni adeguate con radici ventrali che si estendono per due millimetri o più. Dopo circa 30 minuti a 34 gradi Celsius, raffreddare le sezioni a temperatura ambiente, quindi iniziare la sessione di registrazione. Preparare in anticipo una scatola contenente diverse pipette con diametri delle punte compresi tra 40 e 170 micron.Per preparare le pipette per sezionamento, selezionare pipette con un lungo restringimento. Quindi, utilizzando un coltello al diamante, effettuare tagli in diverse posizioni e, sotto un microscopio stereoscopico, rompere la punta di ciascuna pipetta colpendola con pinzette. Successivamente, rimuovere la camera dal microscopio di registrazione e posizionarla sotto un microscopio stereoscopico.Selezionare una sezione che contenga una radice ventrale di lunghezza sufficiente da poter essere montata su un elettrodo di stimolazione a suggente. Montare la sezione, orientandola con le radici ventrali verso l'alto, quindi tagliare delicatamente l'agar intorno alle radici ventrali lasciando intorno alla sezione il resto dell'agar e posizionare la griglia per mantenere il campione premuto verso il basso. Rimontare la camera sul microscopio e perfondere continuamente la camera di registrazione con ACSF a un flusso di uno-due millilitri al minuto a temperatura ambiente.Utilizzando una pipetta di vetro riempita con ACSF e collegata a una siringa, aspirare una delle radici ventrali. Per ottenere una buona stimolazione della radice ventrale, la punta della pipetta deve aderire strettamente alla radice ventrale. Effettuare la registrazione in tecnica patch-clamp del tipo cellulare desiderato e registrare l'effetto della stimolazione della radice ventrale come descritto in precedenza.Questa immagine mostra i risultati della registrazione in voltage-clamp. Le registrazioni dei pannelli superiori provengono da motoneuroni diversi rispetto a quelli nei pannelli inferiori. Il pannello superiore mostra la risposta antidromica di un motoneurone a una stimolazione di un volt in rosso e a una stimolazione di cinque volt in nero.Il tracciato inferiore mostra la risposta del potenziale d'azione ortodromico a una stimolazione di 20 volt in rosso e a una stimolazione di 30 volt in nero. I puntini neri indicano il momento dello stimolo. Le doppie frecce evidenziano la differenza nelle latenze tra i potenziali d'azione ortodromici e antidromici.Qui vengono mostrate le registrazioni in modalità "current clamp". Il pannello superiore mostra la risposta antidromica a stimolazioni di 10 volt e 15 volt, rispettivamente in rosso e nero. Il pannello inferiore mostra la risposta ortodromica a stimolazioni di 25 e 40 volt, rispettivamente in rosso e nero.Anche in questo caso, sono indicati i tempi dello stimolo e le differenze nelle latenze. Questa immagine del pool di cellule di Renshaw è stata acquisita utilizzando un condensatore obliquo e un obiettivo 20x. Si notino gli assoni dei motoneuroni che si fondono nella radice ventrale, come mostrato dalla freccia.Questa immagine della stessa regione è stata acquisita utilizzando un obiettivo 40x. Le cellule di Renshaw putative sono indicate con delle teste di freccia. Qui viene mostrata una registrazione in voltage-clamp di una cellula di Renshaw a seguito della stimolazione della radice ventrale, indicata dal punto nero.Il QX-314 nella soluzione intracellulare ha impedito alla cellula di generare potenziali d'azione e le risposte alla glicina e al GABA sono state bloccate rispettivamente da 3 micromolar di gabazina e da un micromolare di stricnina. Il tracciato rosso rappresenta la media dei tracciati grigi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 o 30 minuti.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre il preparato in un mezzo freddo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare sezioni oblique del midollo spinale adatte alla stimolazione delle radici ventrali. La stimolazione delle radici ventrali può essere utilizzata per confermare facilmente l'identità delle motoneuroni e, cosa più importante, per stimolare in modo affidabile le cellule ventrali.

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Si descrivono procedure di preparazione e registrazione elettrofisiologica da fette di cervello che mantengono il dorso-ventrale asse mediale corteccia entorinale (MEC). A causa di codifica neurale della posizione segue un dorso-ventrale organizzazione all'interno della MEC, queste procedure di facilitare studio dei meccanismi cellulari importanti per la navigazione e la memoria.

Preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale Rodent mediale

Questo video descrive la registrazione intracellulare in vivo di motoneuroni di ratto sotto stimolazione transspinale a corrente continua. Il protocollo descrive come misurare le proprietà della membrana e registrare l'attivazione ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodica o catodica del midollo spinale.

Stimolazione transspinale a corrente continua del motoneurone spinale di un ratto

Questo video mostra un test basato su array di microelettrodi per studiare l'attività della rete neuronale in sezioni di midollo spinale di topo. In primo luogo, viene registrata l'attività elettrofisiologica del corno dorsale superficiale (SDH) della fetta. Quindi, viene introdotto un inibitore del canale del potassio per prolungare la depolarizzazione, con conseguente attività ritmica sincrona attraverso la rete neuronale.

Valutazione basata su array di microelettrodi delle reti neuronali in fette di midollo spinale di topo

La registrazione delle correnti di Ca2+ sulla membrana frontale di rilascio presinaptico è la chiave per una comprensione precisa dell'ingresso di Ca2+ e del rilascio di neurotrasmettitori. Presentiamo una dissociazione acuta del midollo spinale della lampreda che produce assoni reticolospinali isolati funzionali, permettendo la registrazione direttamente dalla membrana facciale di rilascio dei singoli terminali presinaptici.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

L'efficacia dell'assorbimento intramuscolare e del trasporto retrogrado delle molecole ai corrispondenti motoneuroni dipende dalla posizione dei siti di iniezione rispetto alle placche terminali del motore (MEP). Qui, descriviamo come localizzare i MEP sui muscoli scheletrici per ottimizzare il trasporto retrogrado dei traccianti nei motoneuroni.

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

L'integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l'attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

Viene delineato l'uso combinato della tecnologia microelectrode array e della stimolazione chimica indotta da 4-aminopiridina per studiare l'attività nocicettiva a livello di rete nel corno dorsale del midollo spinale.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Impara a preparare fette oblique del midollo spinale da topi P2-P11 per la stimolazione delle radici ventrali. Questa tecnica consente l'identificazione affidabile dei motoneuroni e lo studio delle cellule ventrali innervate dai collaterali assonali.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Esplora altri video