Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di veicolare acidi nucleici negli embrioni di Ceratitis Capitata, un importante parassita agricolo, al fine di ampliare la dotazione di strumenti per il suo controllo. Questo metodo consente di correggere funzionalmente geni in un organismo immobilizzato, nonché di generare ceppi transgenici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che vengono iniettate quantità molto ridotte di acidi nucleici per ottenere gli effetti desiderati.

Mantenere tutti gli stadi di vita della colonia di moscerino della frutta a 25 gradi Celsius con un'umidità del 65% e un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, con la fase luminosa che inizia alle 8 del mattino. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura alla base della gabbia per fornire acqua alle mosche mediante azione capillare. Preparare una gabbia da sei litri e caricarla con da 1.500 a 2.000 pupe.

Per il cibo, caricare la gabbia con circa 45 grammi di una miscela di lievito e zucchero in rapporto da uno a dieci. Per raccogliere le uova, posizionare una piastra piena d'acqua sotto la gabbia. Le femmine depositeranno le uova attraverso la rete, che successivamente si raccoglieranno nell'acqua.

Poiché le femmine vergini possono deporre uova, assicurarsi che tutte le uova siano fecondate attendendo almeno una settimana prima di raccogliere le uova, fino a quando le mosche non abbiano raggiunto almeno quell'età. Per raccogliere le uova, filtrare l'acqua con un colino fine. Successivamente, utilizzando una pipetta di Pasteur, trasferire le uova in una scatola di plastica contenente circa 0,5 litri di alimento larvale standard.

Se non vengono deposte abbastanza uova, aumentare il contenuto di lievito nel cibo degli adulti fino al 25%. Posizionare ogni scatola in un contenitore trasparente contenente uno strato di crusca per favorire la pupeificazione. Coprire il contenitore con un coperchio a rete per consentire la circolazione dell'aria. Dopo circa 10 giorni, verificare la presenza di larve di terzo stadio che sono saltate nello strato di crusca per la pupeificazione.

Dopo averli trovati, prepararsi a verificare la presenza di pupe nei giorni seguenti. Per raccogliere la pupa, utilizzare un pennello morbido per raccoglierle dal contenitore. Inizialmente, raccogliere le pupe in un piccolo bicchiere.

Dopo il completamento delle raccolte, trasferire le pupe in una nuova gabbia per adulti. Gli adulti dovrebbero schiudersi in circa 10 giorni. Per la microiniezione, preparare in anticipo le lamelle.

Attaccare una striscia di nastro biadesivo lunga due centimetri su un vetrino e segnare i bordi con un pennarello indelebile per creare una barriera che contenga uno strato di olio, necessario a mantenere idratati gli embrioni. Per raccogliere embrioni appena deposti, lasciare che femmine giovani fecondate depongano per 30 minuti su un nuovo vassoio, quindi raccogliere gli embrioni. Per rimuovere la coriona dagli embrioni, immergere il colino e le uova in una soluzione commerciale di candeggina al 50% per cinque secondi.

È fondamentale non eccessivare nella candeggina degli embrioni. Lavare immediatamente gli embrioni candeggiati immergendo con attenzione il colino in acqua ultrapura pulita. Ripetere questa operazione almeno quattro volte.

Successivamente, mantenere il setaccio in acqua ultrapura e iniettare gli embrioni entro due ore. Poi, utilizzando un pennello fine, raccogliere circa 50 embrioni e posizionarli su un disco di carta da filtro nera inumidita con acqua. Sotto un microscopio stereoscopico da dissezione, allineare gli embrioni sul nastro adesivo doppio dello vetrino preparato.

Orientare tutti gli embrioni nella stessa direzione. È importante manipolare gli embrioni con attenzione perché la perforazione della membrana embrionale con il pennello potrebbe causare danni che riducono la sopravvivenza dell'embrione. Coprire ora gli embrioni con uno strato di olio di cloro-trifluoroetilene.

L'olio deve essere contenuto entro i bordi tracciati con il pennarello per porcellana. Non superare i bordi. Utilizzando una micropipetta, caricare l'ago di iniezione con alcuni microlitri di soluzione di acido nucleico, alla concentrazione di uno-due microgrammi per microlitro.

Quindi, collegare l'ago all'apparato di microiniezione e impostarlo per erogare un'iniezione della durata di mezzo secondo a 800 ettopascal con una pressione di retroazione di 150 ettopascal. Per effettuare l'iniezione, utilizzare un interruttore a pedale e il micromanipolatore per controllare l'ago, mentre si usano i comandi dello stage per spostare il vetrino. Verificare che il bolo di iniezione venga espulso correttamente, quindi allineare l'ago con il polo posteriore del primo embrione della fila.

Spostando il portapreparati, inserire l'ago nell'embrione e iniettare la bolla di acidi nucleici. Il liquido iniettato indurrà un aumento della pressione interna, provocando un lieve movimento dell'embrione. Rilasciare il pedale ed estrarre immediatamente, ma delicatamente, l'ago dall'embrione.

Un po' di citoplasma fuoriuscirà nel sito di iniezione. Questo è normale. Se gli embrioni si rompono durante l'iniezione, lasciarli disidratare per alcuni minuti prima di ricoprirli con olio.

Dopo l'iniezione, trasferire il vetrino in una capsula di Petri. Posizionare un disco di carta da filtro nel coperchio della capsula. Inzuppare la carta con acqua e chiudere la capsula di Petri con pellicola di paraffina.

Incubare la camera a 25 gradi Celsius. Due giorni dopo l'iniezione, controllare più volte durante la giornata i vetrini alla ricerca di larve schiuse. Cercare le larve nell'olio e, utilizzando un pennello fine, trasferirle in una piastra di Petri contenente cibo per larve a base di carota.

Caricare ogni piastra con fino a 200 larve. La larva non può sopravvivere a lungo nell'olio, quindi effettuare controlli frequenti. Incubare le larve con il coperchio per lo più chiuso, in modo che vi sia comunque un flusso d'aria verso le larve.

Controllare le piastre quotidianamente e dopo una settimana prepararsi a raccogliere le larve posizionando le piastre in un contenitore con crusca. Raccogliere le pupe e poco dopo aspettarsi che emergano. Successivamente anestetizzare gli adulti schiusi utilizzando anidride carbonica ed esaminarli per verificarne la trasformazione.

Durante la selezione, il metodo di mobilizzazione può risultare fondamentale. Gli adulti di moscerino delle olive possono essere anestetizzati utilizzando ghiaccio o CO2, ma un'esposizione prolungata potrebbe ridurre la sopravvivenza degli altri. Verificare la presenza di fluorescenza rossa utilizzando un filtro ampio DS rosso.

In alternativa, verificare la fluorescenza verde utilizzando un filtro EYFP. Trasferire gli individui trasformati in una piccola gabbia con adulti di tipo selvatico di sesso opposto per stabilire una linea eterozigote. In un esperimento, l'RNA doppio marcato è stato utilizzato per silenziare l'espressione del gene inx5.

La linea germinale adulta dei controlli non iniettati appare normale, come previsto, mentre gli individui trattati mostravano testicoli e ovaie sottosviluppati. La quantificazione dell'abbondanza del trascritto di inx5 negli addomi di individui di entrambi i sessi ha confermato un'espressione significativamente più bassa del gene rispetto ai controlli. In un secondo esperimento, due ceppi con spermatozoi marcati sono stati generati utilizzando il promotore della beta-2 tubulina per esprimere diversi marcatori fluorescenti.

I maschi transgenici mostravano un pattern di fluorescenza distinto nel corpo e nei testicoli. Con questo video, forniamo i nostri protocolli ottimizzati per l'allevamento e la microiniezione di acidi nucleici negli embrioni di moscerino delle olive. Una volta acquisita padronanza, è possibile iniettare fino a 1.000 embrioni in una giornata lavorativa di otto ore.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metalli come thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine per sviluppare una nuova generazione di ceppi di mosca delle olive.