Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita, Capitata Ceratitis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire acidi nucleici negli embrioni di Ceratitis Capitata, un importante parassita agricolo, per espandere in definitiva la cassetta degli attrezzi per il suo controllo. Questo metodo aiuta a correggere funzionalmente i geni in un organismo immobile, oltre a generare ceppi transgenici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che vengono iniettate quantità molto basse di acidi nucleici per ottenere gli effetti desiderati.

Mantenere tutte le fasi di vita della colonia di mosche a 25 gradi Celsius con il 65% di umidità e un fotoperiodo di 12 12 ore luce/buio con una fotofase a partire dalle 8 del mattino. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura nella base della gabbia per fornire acqua alle mosche per mezzo di un'azione capillare. Si stabilisce una gabbia da sei litri, si carica una con tra 1.500 e 2.000 pupe.

Per il cibo, caricare la gabbia con circa 45 grammi di una miscela da uno a 10 di lievito e zucchero. Per raccogliere le uova, posizionare un piatto pieno d'acqua sotto la gabbia. Le femmine depositeranno le uova attraverso la rete, che poi si raccoglieranno nell'acqua.

A causa delle femmine vergini che possono deporre le uova, assicurarsi che le uova siano tutte fecondate aspettando che le mosche abbiano almeno una settimana, prima di raccogliere le uova. Per raccogliere le uova, filtrare l'acqua con un colino fine. Quindi, utilizzando una pipetta per pastori, trasferisci le uova in una scatola di plastica caricata con circa 0,5 litri di cibo larvale standard.

Se non sono state deposte abbastanza uova, aumentare il contenuto di lievito del cibo dell'adulto fino al 25%Posizionare ogni scatola in un contenitore trasparente, contenente uno strato di crusca per favorire l'impupamento. Coprire il contenitore con un coperchio a rete per consentire la circolazione dell'aria. Dopo circa 10 giorni, controlla la presenza di larve di terzo stadio che sono saltate nello strato di crusca per l'impupamento.

Una volta trovate, preparati a controllare la presenza di pupe nei giorni successivi. Per raccogliere le pupe, usa una spazzola morbida per spazzarle via dal contenitore. Inizialmente, raccogli le pupe in una piccola tazza.

Dopo che le raccolte sono state completate, trasferisci le pupe in una nuova gabbia per adulti. Gli adulti dovrebbero emergere in circa 10 giorni. Per la microiniezione, far preparare in anticipo i vetrini.

Attacca una striscia di due centimetri di nastro biadesivo a un vetrino e segna i bordi con un pennarello a china per creare una parete per uno strato di olio che mantiene gli embrioni idratati. Per raccogliere gli embrioni appena deposti, lasciare che le giovani femmine fecondate depongano gli ovuli per 30 minuti su un nuovo vassoio e poi raccogliere gli embrioni. Per rimuovere il corion dagli embrioni, immergere il colino e le uova in una soluzione commerciale di candeggina al 50% per cinque secondi.

È fondamentale non sbiancare eccessivamente gli embrioni. Lavare immediatamente gli embrioni sbiancati immergendo accuratamente il colino in acqua pulita e ultrapura. Fallo almeno quattro volte.

Quindi, tieni il colino in acqua limpida e ultrapura e inietta gli embrioni entro due ore. Successivamente, utilizzando un pennello fine, raccogli circa 50 embrioni e posizionali su un disco di carta da filtro nera imbevuta d'acqua. Sotto uno stereomicroscopio da dissezione, fila gli embrioni sul nastro biadesivo di un vetrino da microscopio preparato.

Orientare tutti gli embrioni nella stessa direzione. È importante manipolare gli embrioni con attenzione perché la perforazione della membrana embrionale con il pennello può causare danni che riducono la sopravvivenza dell'embrione. Ora copri gli embrioni con uno strato di olio di cloro-trifloro etholene.

Il petrolio dovrebbe essere contenuto dai bordi del marcatore di porcellana. Non oltrepassare i confini. Utilizzando una micropipetta, caricare l'ago per iniezione con alcuni microlitri di soluzione di acido nucleico a uno o due microgrammi per microlitro.

Quindi, collegare l'ago all'apparecchio per microiniezione e impostarlo in modo da fornire un'iniezione di mezzo secondo a 800 ettopascal con una contropressione di 150 ettopescal . Per iniettare, utilizzare un grilletto a pedale e utilizzare il micro-manipolatore per controllare l'ago mentre si utilizzano i controlli del tavolino per spostare la diapositiva. Verificare che il bolo di iniezione venga espulso correttamente e quindi allineare l'ago con il polo posteriore del primo embrione della fila.

Spostando lo stadio, inserire l'ago nell'embrione e iniettare il bolo di acidi nucleici. Il liquido iniettato indurrà un aumento della pressione interna con conseguente leggero movimento dell'embrione. Rilascia il pedale e, immediatamente, ma delicatamente, rimuovi l'ago dall'embrione.

Un po' di citoplasma fuoriesce nel sito di iniezione. E 'normale. Se gli embrioni scoppiano con l'iniezione, lasciare essiccare gli embrioni per alcuni minuti prima di coprirli con l'olio.

Dopo l'iniezione, trasferire il vetrino in una capsula di Petri. Metti un disco di carta da filtro nel coperchio del piatto. Immergere il filtro con acqua e chiudere la capsula di Petri con una pellicola di paraffina.

Incubare la camera a 25 gradi Celsius. Due giorni dopo l'iniezione, controllare i vetrini più volte durante il giorno per verificare la presenza di larve schiuse. Cerca le larve nell'olio e, usando un pennello fine, trasferiscile in una capsula di Petri con cibo larvale a base di carote.

Carica ogni piatto con un massimo di 200 larve. La larva non può sopravvivere a lungo nell'olio, quindi cerca spesso. Incubare le larve con il coperchio per lo più chiuso, in modo che ci sia ancora flusso d'aria verso le larve.

Controlla i piatti ogni giorno e dopo una settimana preparati a raccogliere le larve mettendo i piatti in un contenitore con la crusca. Raccogli le pupe e subito dopo aspettati che emergano. Successivamente anestetizzano gli adulti nati usando anidride carbonica e li ispezionano per la trasformazione.

Quando si esegue lo screening, questo metodo di mobilizzazione può essere fondamentale. Gli adulti di Medfly possono essere anestetizzati usando ghiaccio o CO2, ma l'esposizione prolungata potrebbe ridurre la sopravvivenza degli altri. Verificare la presenza di fluorescenza rossa utilizzando un filtro DS red wide.

Oppure controlla la fluorescenza verde utilizzando un filtro EYFP. Trasferisci gli individui trasformati in una piccola gabbia con adulti selvatici del sesso opposto per stabilire un ceppo eterozigote. In un esperimento, l'RNA a doppio ceppo è stato utilizzato per silenziare l'espressione genica di inx5.

La linea germinale adulta dei controlli non iniettati sembra essere normale come previsto, mentre gli individui trattati hanno mostrato testicoli e ovaie sottosviluppati. La quantificazione dell'abbondanza del trascritto inx5 negli addomi di individui di entrambi i sessi ha confermato l'espressione significativamente più bassa del gene rispetto ai controlli. In un secondo esperimento, due ceppi con spermatozoi marcati sono stati generati utilizzando il promotore della tubulina beta-2 per guidare diversi marcatori fluorescenti.

I maschi transgenici hanno mostrato un distinto pattern di fluorescenza nel corpo e nei testicoli. Con questo video, forniamo i nostri protocolli ottimizzati per l'allevamento e la micro-iniezione di acidi nucleici negli embrioni di medfly. Una volta padroneggiati, è possibile iniettare fino a 1.000 embrioni in una giornata lavorativa di otto ore.

Seguendo questa procedura, altri metalli come thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine possono essere eseguiti per sviluppare una nuova generazione di ceppi di mosche mediche.