Modello in vivo per la prova Effetto dell'ipossia sul tumore metastasi

Questo manoscritto descrive lo sviluppo di un modello animale che permette di testare direttamente gli effetti dell'ipossia tumorale sulle metastasi e di decifrare i meccanismi della sua azione. Sebbene gli esperimenti qui descritti si concentrino sul sarcoma di Ewing, un approccio simile può essere applicato ad altri tipi di tumore.

L'obiettivo generale di questa procedura è testare direttamente l'effetto dell'ipossia tumorale sulle metastasi utilizzando un modello animale. Questo metodo può aiutare a identificare il meccanismo alla base degli effetti prometastatici dell'ipossia e potenziali nuovi bersagli terapeutici per prevenire la disseminazione tumorale. Due vantaggi di questa tecnica sono la capacità di testare gli effetti dell'ipossia tumorale in vivo e di ricapitolare le fasi delle metastasi e delle interazioni cellulari che si verificano nei pazienti oncologici.

Nel nostro modello, l'ipossia tumorale è creata dalla legatura dell'arteria femorale che fornisce sangue all'ilo portatore del tumore del topo. La successiva amputazione degli arti posteriori impedisce la mobilità associata alla crescita ripetuta del tumore primario, consentendo la formazione di metastasi. A dimostrare la procedura saranno Jason Tilan, Sung-Kyeok Hung e la dottoressa Olga Rodriguez, co-direttrice del Laboratorio di ricerca sull'imaging preclinico qui a Georgetown.

Per iniettare le cellule del sarcoma di Ewing, trattenere delicatamente una femmina di topo SCID Beige di quattro-sei settimane, stabilizzando la zampa sinistra tra il quarto e il quinto dito per esporre il lato mediale dell'arto posteriore inferiore. Inserire un ago da 28 gauge da 1/2" pollice con un angolo di circa 30-45 gradi anteriormente nel muscolo gastrocnemio verso la cresta tibiale. Quando la punta dell'ago tocca la cresta, ritirare leggermente l'ago e iniettare lentamente 0,1 millilitri di cellule del sarcoma di Ewing continuando a ritirare l'ago.

Quindi utilizzare calibri digitali per misurare quotidianamente le dimensioni del polpaccio tramite le lunghezze mediale/laterale e anteriore/posteriore fino a quando la dimensione del tumore non raggiunge il volume desiderato. Prima di iniziare la legatura, iniettare per via sottocutanea un agente analgesico seguito dalla somministrazione di Hypoxyprobe-1 per la conferma dell'ipossia. Quindi, posizionare il mouse anestetizzato su un cuscinetto riscaldante sulla superficie operativa e applicare un unguento sugli occhi dell'animale.

Quindi, estendi e fissa l'arto posteriore con un pezzo di nastro adesivo a circa 45 gradi dalla linea mediana. Depilare l'area chirurgica con una crema depilatoria, rimuovendo la crema con un tampone di preparazione all'etanolo dopo 10 secondi e disinfettare la pelle esposta con tre salviette consecutive al 10% di iodio povidone ed etanolo. Trasferire il topo sotto uno stereomicroscopio e praticare un'incisione di 1 centimetro nella pelle da metà coscia verso la regione inguinale.

Utilizzando tamponi di cotone fine inumiditi con soluzione salina, spazzolare delicatamente il tessuto adiposo sottocutaneo che circonda il muscolo della coscia. Quindi, sezionare con cura il tessuto adiposo sottocutaneo per rivelare l'arteria femorale sottostante. Stabilizzare la ferita e il campo chirurgico per esporre la vascolarizzazione del muscolo adduttore medio-superiore e utilizzare una pinza sottile per perforare delicatamente la guaina femorale membranosa per esporre il fascio neurovascolare.

Utilizzando una serie pulita di pinze sottili, sezionare e separare l'arteria femorale dalla vena femorale e dal nervo nella posizione prossimale vicino all'inguine, distalmente al legamento inguinale. Quindi, passare una sutura di seta 6-0 sotto l'arteria femorale distale alla parte posteriore dell'arteria femorale circonflessa laterale e occludere l'arteria femorale con doppi nodi. Chiudere l'incisione con suture in polipropilene 6-0 e iniettare per via sottocutanea 0,5 millilitri di soluzione fisiologica calda per la terapia dell'equilibrio dei fluidi.

Quindi posizionare l'animale sopra un cuscinetto caldo drappeggiato nella gabbia di recupero con monitoraggio fino a completo recupero. Al momento sperimentale appropriato, trattenere delicatamente l'animale e utilizzare le tosatrici per radere i peli dall'arto portatore di tumore dalla tibia distale alla regione pelvica. Iniettare l'agente analgesico e posizionare l'animale anestetizzato in posizione sdraiata laterale destra su un telo sterile posizionato su un cuscinetto riscaldante.

Applicare un unguento sugli occhi e disinfettare il sito chirurgico come appena dimostrato. Quindi, posizionare un telo sterile sull'animale e praticare un'incisione cutanea circonferenziale femorale media seguita da una dissezione smussata e da una retrazione prossimale della pelle. Esporre il peduncolo neurovascolare femorale mediale sul lato mediano della gamba.

Quindi utilizzare una sutura riassorbibile rivestita di poliglactina 910 4-0 per legare vicino al legamento inguinale. Usando le forbici, eseguire una transezione femorale media del muscolo seguita da una dissezione smussata del tessuto molle all'articolazione coxofemorale. Utilizzando un tagliaossa, eseguire un'osteotomia medio-femorale seguita da una leggera pressione nel sito dell'osteotomia con una spugna di gelatina assorbibile per ridurre al minimo il sanguinamento.

Quindi utilizzare clip per ferite chirurgiche per chiudere la pelle sovrastante e iniettare per via sottocutanea 0,5 millilitri di soluzione fisiologica calda per la terapia dell'equilibrio dei fluidi. Almeno due volte a settimana, palpare attentamente la testa, il collo, le regioni ascellari e l'arto posteriore controlaterale degli animali a cui è stato iniettato il tumore. Verificare la presenza di metastasi d'organo interne attraverso la distensione addominale e la presenza di metastasi polmonari attraverso una leggera pressione del processo xifoideo con il dito indice.

Per valutare le metastasi degli organi interni mediante risonanza magnetica nei punti temporali sperimentali appropriati, accendere la pompa collegata a un sistema di circolazione dell'acqua calda per mantenere il topo a una temperatura corporea fisiologica. Quindi, posizionare il sensore respiratorio a contatto con la parte superiore dell'addome dell'animale e accendere l'apparecchiatura di monitoraggio respiratorio BIOPAC Systems. Posizionare il topo anestetizzato su un supporto stereotassico per topo progettato su misura e applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale.

Per ridurre gli artefatti da movimento e il rumore, selezionare l'opzione di gating nel protocollo MRI per sincronizzare la raccolta dei dati con il ciclo respiratorio. Quindi, eseguire una sequenza di imaging anatomico bidimensionale pesata in T2 per visualizzare le metastasi. Per la coltura di cellule tumorali primarie dopo l'amputazione, l'incisione o l'autopsia, prelevare da due a tre segmenti di 2-3 millimetri di tessuto tumorale vitale umido lucido di colore rosa-rosso, da ciascun campione di tessuto di interesse e posizionare i segmenti isolati in piastre di coltura cellulare di 6 centimetri contenenti terreno di coltura primaria fresco.

Quindi, trasferire i tessuti in un incubatore di coltura cellulare per il periodo di crescita cellulare appropriato. Dopo l'iniezione delle cellule del sarcoma di Ewing nel muscolo gastrocnemio, i tumori primari possono crescere fino a una dimensione del polpaccio di 250 millimetri cubi. I tumori di controllo a questo volume mostrano un livello relativamente basso di ipossia endogena solo nelle cellule distanti dal sistema vascolare, come determinato dalla colorazione con ipossisonda-1.

Al contrario, la legatura dell'arteria femorale induce una profonda ipossia nella stragrande maggioranza delle cellule tumorali, anche quelle prossimali ai vasi sanguigni. L'efficacia della legatura dell'arteria femorale è supportata dalla completa inibizione della crescita del tumore primario nel periodo di tre giorni tra la legatura dell'arteria femorale e l'amputazione. L'analisi istopatologica rivela estese aree di necrosi nei tumori primari trattati con legatura dell'arteria femorale prelevati tre giorni dopo l'intervento chirurgico.

Tuttavia, ci sono gruppi di cellule tumorali vitali presenti all'interno del tessuto tumorale situato ai bordi del tumore vicino al sistema vascolare. Queste cellule tumorali vitali rimanenti sono altamente invasive, come evidenziato dalla loro massiccia intravasazione. Molte cellule all'interno del lume del vaso sono positive all'ipossisonda-1, indicando che le cellule ipossiche dopo la legatura dell'arteria femorale possono aver iniziato l'angioinvasione.

In questi esperimenti, l'ipossia ha aumentato significativamente la frequenza e la molteplicità delle metastasi, spesso osservate in sedi non colpite nei topi portatori di tumori di controllo. Una volta padroneggiata, ogni procedura chirurgica, compresa la preparazione, l'anestesia e il recupero, può essere completata in 30 minuti per animale. La durata dell'intero esperimento dipende dalla linea cellulare utilizzata e dai suoi tassi di crescita e metastasi.

Le tempistiche della risonanza magnetica e dell'eutanasia variano in base alla latenza delle metastasi e devono essere stabilite per ogni singola linea cellulare in un esperimento pilota. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un'adeguata gestione del dolore e il monitoraggio degli animali dopo la procedura. Se la procedura viene eseguita perfettamente, non devono essere osservati effetti avversi gravi o decessi correlati all'intervento chirurgico.

A seguito di questa procedura, i tessuti e le cellule dei tumori primari di controllo e ipossici, nonché delle loro metastasi corrispondenti, possono essere sottoposti a ulteriori analisi, compresa la profilazione dell'espressione genica globale per identificare i meccanismi delle metastasi indotte dall'ipossia. Questa tecnica può essere utilizzata dai ricercatori nel campo delle metastasi tumorali per testare direttamente gli effetti dell'ipossia tumorale sulla disseminazione della malattia. Anche se qui ci siamo concentrati sul sarcoma di Ewing, un approccio simile può essere applicato ad altri tumori.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come creare un modello animale di ipossia tumorale e di come monitorare le metastasi risultanti sia in vivo che ex vivo.