Creazione e il trapianto di un foglio di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) in un modello diabetico di guarigione

L'obiettivo generale di questa procedura è verificare l'effetto di fogli di cellule staminali di derivazione adiposa combinati con pelle artificiale sulla guarigione delle ferite per un grande difetto cutaneo a tutto spessore nel ratto diabetico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla guarigione di una ferita cronica, come una grande ferita diabetica con osso esposto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule vengono trapiantate nella ferita in fogli solidi utilizzando la tecnologia dei fogli cellulari e il risultato è un trapianto vitale e stabile.

Per un donatore di cuscinetti adiposi, pianifica di utilizzare ratti Lewis di età compresa tra otto e 33 settimane. Sul sito chirurgico, tieni pronti diversi applicatori sterili con punta di cotone, garze, un bisturi, un porta aghi, forbici operatorie, un paio di pinze e sutura in nylon 5-0. Per il posizionamento temporaneo del tessuto, caricare una capsula di Petri da 100 millilitri con 10 millilitri di PBS.

Pesare la capsula caricata con PBS per trovare successivamente la massa del tessuto raccolto. Dopo aver anestetizzato il ratto, posizionarlo supino su un telo sterile. Quindi, radere la zona operatoria e strofinare la pelle esposta utilizzando diversi scrub alternati di etanolo al 70%.

Ora, fai un'incisione cutanea di tre centimetri nell'addome inferiore laterale. Quindi, esporre e sezionare il muscolo obliquo esterno. Quindi, esporre il tessuto adiposo dell'epididimo che circonda l'epididimo.

Successivamente, asportare con cura il tessuto adiposo dell'epididimo. Evitare di danneggiare l'epididimo, i testicoli e i vasi sanguigni dell'epididimo. Trasferire il fazzoletto nella capsula di PBS.

Quindi, chiudi il ratto donatore e segui le pratiche standard di assistenza postoperatoria. Isolare le ASC da due a tre grammi di tessuto adiposo raccolto. Digerire il tessuto per un'ora in collagenasi di tipo A allo 0,1% per ottenere la frazione vascolare stromale, o SVF.

Dopo aver purificato la SVF, sospendere la SVF in 20 millilitri di terreno. Dividi la sospensione in due piastre di coltura da 60 centimetri quadrati e coltivali per 24 ore in condizioni standard. Il giorno successivo, lavare le piastre con PBS tre volte per rimuovere eventuali cellule e detriti non attaccati.

Dopo il lavaggio finale, aggiungere nuovamente il terreno completo fresco. Quindi, continua a far passare le cellule fino a quando non sono quasi subconfluenti il terzo giorno di coltura. Quindi, utilizzando un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25% in una breve incubazione.

Rimuovere le celle dalla piastra. Non lasciare che le cellule siano esposte alla tripsina attiva per più di 10 minuti. Dopo aver osservato e contato le cellule, subcolturarle a una densità di 1.700 per centimetro quadrato.

Quindi, passa le celle ogni tre giorni e completa tre passaggi prima di procedere. Dopo aver passato per la terza volta le ASC di ratto sottocoltivato, impiattare 150.000 cellule su un piatto di coltura sensibile alla temperatura di 35 millimetri di diametro e due millilitri di terreno di coltura. Coltiva il piatto per tre giorni in un'incubatrice per creare un foglio cellulare uniforme.

Tre giorni dopo, cambiare il terreno e aggiungere 16,4 microgrammi per millilitro di AA. Quindi colture le cellule, cambiando il terreno AA a giorni alterni. Dopo quattro o cinque giorni sul terreno contenente AA, controllare la proliferazione degli ASC. Cerca gli spazi tra le celle e il foglio di celle contigue.

Una volta stabilito un foglio di celle contigue, le celle possono essere utilizzate per il modello. Quando necessario, raccogliere il foglio cellulare posizionando la piastra a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Poiché la piastra è sensibile alla temperatura, le cellule si staccheranno spontaneamente come un foglio contiguo e il foglio può essere rimosso con una pinza.

Per il modello di guarigione delle ferite da obesità, utilizzare ratti ZDF maschi adulti, di età compresa tra 16 e 18 settimane di peso compreso tra 500 e 600 grammi. Posizionare e anestetizzare il ratto sul campo chirurgico e, prima di radere la testa, pulirla con etanolo al 70%. Quindi, radere la zona operatoria e pulire la pelle esposta con scrub alternati al 70% di etanolo.

A questo punto, trasferire la piastra sensibile alla temperatura delle cellule staminali adipose sul banco. Prima che il foglio cellulare si stacchi dalla piastra, rimuovere il terreno e lavare il foglio cellulare con PBS tre volte. Dopo aver raccolto il foglio cellulare, immergerlo in PBS fino al momento del bisogno.

Una volta che le cellule sono pronte, fare un difetto cutaneo a tutto spessore di 15 x 10 millimetri sulla testa del ratto. Per prima cosa, rimuovere il tessuto cutaneo fino al periostio. Quindi, asportare la pelle e il tessuto cutaneo con un bisturi e un paio di forbici chirurgiche.

Per completare il difetto, rimuovere il periostio con il raspatorio periostale. Quindi posizionare il foglio di celle sul difetto. Il foglio di cellule staminali è morbido e flessibile.

Usa una pinza per estenderlo ad ogni angolo del difetto. Ora, copri il foglio cellulare e il difetto con un cerotto di 10 x 15 millimetri di pelle artificiale imbevuta di soluzione salina subito prima dell'uso e chiudi la ferita con circa 10 punti di sutura utilizzando una sutura di nylon 5-0. Per proteggere la ferita, utilizzare una sutura di nylon 5-0 per fissare un cerotto di 15 x 20 millimetri di medicazione non adesiva sulla pelle artificiale.

Pianifica di osservare la medicazione a giorni alterni, perché il topo la rimuoverà invariabilmente e, se necessario, sostituirà prontamente la medicazione. In due gruppi di sei ratti grassi diabetici Zucker, il protocollo descritto è stato utilizzato per creare un difetto del cranio. I ratti sperimentali sono stati trattati con un foglio di cellule staminali adipose di ratto e i controlli non lo sono stati.

Dopo 14 giorni, le ferite del gruppo di trattamento erano significativamente più piccole di quelle dei controlli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una grande ferita con osso esposto nei ratti e quindi trattare quella ferita con cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi di utilizzare una rigorosa gestione della temperatura durante l'intero processo di utilizzo di piastre di coltura sensibili alla temperatura.

In caso contrario, le cellule potrebbero staccarsi spontaneamente dai piatti, ritardando gli esperimenti.