Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays
10 novembre 2016
L'adsorbimento di peptidi su plastica durante le tradizionali diluizioni seriali basate su puntali può avere un impatto significativo sulla determinazione della potenza e confondere la comprensione delle relazioni struttura-attività utilizzate per l'identificazione del piombo e le fasi di ottimizzazione del piombo della scoperta di farmaci. Qui vengono descritti i metodi per la diluizione seriale acustica automatizzata senza contatto di campioni di peptidi.
L'obiettivo generale di questo protocollo automatizzato per la diluizione seriale di campioni peptidici è ridurre al minimo l'assorbimento dei peptidi sulle superfici in plastica, consentendo una determinazione accurata della potenza ai fini della scoperta di farmaci. Questo metodo può migliorare la qualità e la riproducibilità dei dati e la rimozione della pipettatura basata su punte elimina anche il trasferimento incrociato dei campioni, evitando che gli errori si propaghino lungo l'intera serie di diluizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aumenta la qualità dei dati riducendo al minimo l'assorbimento dei peptidi sulle superfici in plastica.
Questo è particolarmente importante per guidare una campagna di identificazione di un composto attivo o di una relazione struttura-attività nella scoperta di farmaci. Dopo aver preparato il tampone per il saggio e aver creato un programma di dispensazione per un dispensatore in massa seguendo il protocollo descritto, immergere i tubi della cassetta di dispensazione nel tampone del saggio ed eseguire la messa a punto con il liquido. Posizionare una piastra da saggio a basso volume da 384 pozzetti su un supporto per piastre.
Quindi premere avvio. Dispensare 25 microlitri di soluzioni peptidiche 100 volte concentrate nelle colonne da uno a cinque di una micropiastra acusticamente qualificata da 384 pozzetti a fondo piatto in polipropilene, che verrà designata come piastra sorgente A. Dispensare 25 microlitri di controllo di riferimento 100 volte concentrato nei pozzetti A23 e A24. Quindi dispensare 10 microlitri di tampone per saggio nelle colonne da 11 a 15 e 30 microlitri di tampone per saggio nelle colonne da 21 a 22.
Successivamente, distribuire 10 microlitri di tampone per il saggio nelle colonne sei fino a dieci e sedici fino a venti di una seconda micropiastra in polipropilene acusticamente qualificata da 384 pozzetti, indicata come piastra sorgente B. Centrifugare le piastre sorgente A e B a 300 × g per un minuto. Successivamente, caricare le piastre sorgente e quelle per il saggio nella sezione hotel per piastre del sistema robotico.
Quindi, eseguire il software robotico seguendo il protocollo descritto nel testo, utilizzando dispenser acustici di fluidi integrati nel sistema per preparare tre diluizioni intermedie consecutive uno a cento. Iniziare trasferendo dalle colonne da uno a cinque della piastra sorgente A alle colonne da sei a dieci della piastra sorgente B. Dopo aver preparato la prima diluizione uno a cento, consentire all'automazione di trasferire la piastra sorgente B su una centrifuga integrata e centrifugare a 300 ×g per un minuto prima di riportare la piastra al dispenser acustico di fluidi. Successivamente, dopo aver trasferito la soluzione dalla piastra sorgente B alla piastra sorgente A per la seconda diluizione uno a cento, l'automazione trasferirà la piastra sorgente A sulla centrifuga e procederà alla centrifugazione prima di riportare la piastra al dispenser di fluidi.
Infine, dopo che l'automazione trasferisce la soluzione dalla piastra A alla B per la terza diluizione 1:100, la piastra B viene nuovamente centrifugata. Queste diluizioni di peptidi nella piastra sorgente A e nella piastra sorgente B vengono quindi utilizzate per preparare curve complete di risposta alla concentrazione nel saggio, come descritto nel protocollo testuale. Questo passaggio è fondamentale poiché una metodologia comparativa basata su punte causa una drastica perdita di potenza del campione a causa dell'assorbimento del peptide sulle superfici in plastica.
Scongeliare rapidamente le cellule CHO criopreservate che esprimono il recettore per il GLP1 murino in un bagno d'acqua a 37 gradi e risospendere in 20 millilitri di buffer per saggio. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g e a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di buffer per saggio.
Con il Trypan Blue, diluire il ceppo cellulare uno a uno e utilizzare un contatore cellulare automatico per determinare la densità cellulare vitale. Successivamente, risospendere le cellule nel buffer per il saggio a una concentrazione di 1,6 milioni di cellule per millilitro. Utilizzando un distributore automatico di reagenti, aggiungere cinque microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto della piastra per il saggio contenente peptidi diluiti in serie e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Per eseguire il saggio di rilevamento dell'AMP ciclico, utilizzare il buffer di lisi per preparare diluizioni 1:20 di ciascun reagente fluorescente omogeneo risolto nel tempo o HTRF. Utilizzare un distributore automatico di reagenti per aggiungere cinque microlitri di reagente criptato a tutti i pozzetti delle piastre per il saggio. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di reagente D2 alle colonne da 1 a 22 della piastra.
Successivamente, aggiungere cinque microlitri del reagente D2 nei pozzetti da E23 a P24. Usare immediatamente una pipetta manuale per aggiungere cinque microlitri di buffer di lisi nei pozzetti da A23 a D24, da utilizzare come pozzetti di controllo per il legame non specifico. Centrifugare le piastre del saggio a 200 ×g e a temperatura ambiente per un minuto al fine di mescolare il contenuto dei pozzetti.
Quindi coprire le piastre e incubare per un'ora. Al termine dell'incubazione, utilizzare un lettore di piastre per misurare il segnale FRET con un'eccitazione a 320 nanometri e un'emissione a 620 e 665 nanometri. Analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo.
Il primo passaggio del trasferimento acustico per il saggio di rilevamento dell'AMP ciclico consiste nel preparare quattro diluizioni intermedie di peptidi stock in due piastre sorgente, come mostrato qui. Nel secondo passaggio, il dispensatore acustico diluisce ulteriormente le soluzioni stock dalle piastre sorgente A e B per creare un intervallo di concentrazione a 11 punti per ciascun peptide in esame, in duplicato, per un totale di 16 peptidi diversi. Viene effettuato un ripristino con tampone del saggio per garantire un volume costante per pozzetto in tutta la piastra del saggio.
Qui è mostrata una mappa termica relativa a una piastra esempio contenente 16 peptidi in duplicato, analizzati mediante il saggio di accumulo di AMP ciclico. I valori bassi, mostrati in viola, rappresentano un'elevata concentrazione di AMP ciclico. Queste curve concentrazione-risposta illustrano la riproducibilità dei punti in duplicato.
Il campione uno rappresenta un controllo positivo per il saggio. I campioni due, tre e quattro erano inattivi e sono rappresentati dalle linee piatte nel grafico. I campioni da cinque a sedici rappresentano peptidi test attivi.
Il metodo qui presentato consente la generazione di curve complete di risposta alla concentrazione su un'ampia gamma di potenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore, ma ciò dipenderà dal numero di campioni che richiedono preparazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i peptidi sono campioni biologici e devono essere manipolati di conseguenza.
Per preservarne l'integrità, è consigliabile evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci peptidici e permetterà previsioni precise della potenza necessarie per alimentare le relazioni struttura-attività. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della dispensazione acustica automatizzata per la diluizione seriale di peptidi, il che ridurrà al minimo la perdita di peptidi dovuta all'assorbimento e aumenterà l'accuratezza delle misurazioni.
Non dimenticare che lavorare con peptidi biologicamente attivi con potenze nell'ordine del picomolare può essere estremamente pericoloso e si dovrebbero sempre adottare precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo automatizzato per la diluizione seriale di campioni di peptidi, progettato per ridurre al minimo l'adsorbimento dei peptidi sulle superfici in plastica. Riducendo tale assorbimento, il metodo migliora l'accuratezza della determinazione della potenza nel processo di scoperta di farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Scoperta di farmaci
- Chimica biochimica
- Tecniche analitiche
Sfondo
- L'adsorbimento del peptide può influenzare la determinazione della potenza.
- I metodi tradizionali possono portare a errori nella qualità dei dati.
- Una determinazione accurata della potenza è fondamentale per l'identificazione dei composti promettenti.
- I metodi automatizzati possono migliorare la riproducibilità.
Scopo dello studio
- Per ridurre al minimo l'assorbimento del peptide sulle materie plastiche.
- Per migliorare la qualità e la riproducibilità dei dati.
- Per eliminare errori di trasferimento del campione nelle diluizioni seriali.
Metodi Utilizzati
- Diluizione seriale acustica automatizzata senza contatto.
- Preparazione del buffer per il saggio e del programma di dispensazione.
- Utilizzo di una piastra per saggio a 384 pozzetti con volume ridotto.
- Priming dei tubi della cassetta di dispensazione con fluido.
Risultati principali
- Maggiore accuratezza nella determinazione della potenza.
- Riduzione dell'assorbimento del peptide sulle attrezzature in plastica.
- Migliorata riproducibilità dei dati sperimentali.
- Eliminazione degli errori dovuti al carryover del campione.
Conclusioni
- Il metodo automatizzato migliora in modo significativo la qualità dei dati.
- È vantaggioso per gli studi sul rapporto struttura-attività.
- Questo approccio supporta l'identificazione e l'ottimizzazione dei composti promettenti nella scoperta di farmaci.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Minimizzare l'adsorbimento dei peptidi sulle superfici in plastica è fondamentale per determinare con precisione la potenza nei processi di scoperta di farmaci a base di peptidi, influenzando direttamente gli studi sulle relazioni struttura-attività e le campagne di identificazione dei composti promettenti. La dispensazione acustica automatizzata migliora la qualità e la riproducibilità dei dati eliminando il trasferimento incrociato del campione associato alle punte e riducendo gli errori legati all'adsorbimento. Questo metodo scalabile e senza contatto supporta flussi di lavoro per lo screening ad alto rendimento e consente la generazione affidabile di curve concentrazione-risposta su diverse librerie di peptidi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette un'analisi precisa dell'attività di agonisti peptidici su bersagli come il GLP-1R del topo, riducendo gli artefatti di adsorbimento che alterano le misurazioni della potenza.
- Valore operativo: Consente una preparazione uniforme delle diluizioni seriali su diverse piastre per saggi, migliorando la riproducibilità nelle campagne di validazione dei bersagli.
- Valore predittivo: Aumenta l'affidabilità delle tendenze SAR minimizzando la variabilità tecnica derivante dalle interazioni con le superfici in plastica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera curve concentrazione-risposta a 11 punti in duplicato per più peptidi, consentendo saggi robusti di rilevamento del cAMP basati su HTRF.
- Valore operativo: Utilizza piastre acusticamente qualificate da 384 pozzetti a basso volume con reintegro automatico del tampone per mantenere la coerenza del volume da pozzetto a pozzetto.
- Scalabilità: Facilmente adattabile per aumentare la capacità di elaborazione dei campioni o per aggiungere copie di piastre saggio su pannelli di linee cellulari bersaglio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce output di diluizione dei peptidi direttamente compatibili con saggi funzionali su cellule che esprimono bersagli nativi come GLP-1R.
- De-risking meccanicistico: Riduce falsi negativi/positivi nel dosaggio della potenza mitigando la perdita di peptidi sulle superfici, migliorando la certezza dell'interazione con il bersaglio.
- Prontezza preclinica: Supporta campagne di identificazione di composti leader che richiedono determinazioni accurate dell'EC50 per l'ottimizzazione successiva.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale del bersaglio all'identificazione del capostazione, in cui dati precisi sull'attività del peptide informano la modellizzazione SAR e la priorizzazione dei composti.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo diluizioni precise di peptidi che riflettono l'effettiva attività biologica su cellule esprimenti il recettore ricombinante GLP-1R.
- Screening: Permette di ottenere scorte pronte all'uso di peptidi con un'accuratezza costante nelle diluizioni, riducendo la variabilità tra pozzetto e pozzetto nei risultati HTRF.
- Analisi: Genera segnali FRET quantitativi con eccitazione a 320 nm e emissioni a 620/665 nm, consentendo l'interpolazione delle concentrazioni di cAMP a partire da curve standard.
- Ricerca Translazionale: Collega la fase di scoperta al lavoro preclinico generando dati di potenza rappresentativi dell'interazione con il bersaglio in contesti cellulari simili a quelli naturali.
- Riutilizzo Aziendale: Costituisce un modulo automatizzato riutilizzabile per la manipolazione di peptidi in diverse campagne, riducendo la dipendenza dalla pipettatura manuale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva della potenza del peptide, riduzione dell'ambiguità meccanicistica derivante da artefatti di adsorbimento.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità ed eliminazione del carryover del campione nelle diluizioni seriali.
- Valore strategico: Decisioni più accurate sul proseguimento o meno dello sviluppo nella fase di identificazione dei composti promettenti, maggiore efficienza nell'uso del capitale grazie alla riduzione degli sprechi di reagenti e minor rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei candidati peptidici corretta per il rischio, basata su dati affidabili di EC50 ed efficacia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nei sistemi di dispensazione acustica di fluidi e nell'ottimizzazione dei saggi HTRF.
- Necessita di micropiastre in polipropilene acusticamente qualificate da 384 pozzetti e di un hotel per piastre robotizzato integrato con capacità di centrifugazione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla composizione del buffer del saggio e ai programmi di dispensazione, al fine di garantire riproducibilità.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si trasferiscono i protocolli tra diverse sequenze peptidiche o modelli di linee cellulari.
- Limite pratico: l'efficacia del metodo dipende dalla corretta manutenzione dei dispenser acustici e dall'evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento delle scorte di peptidi.
