Name: Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Scopri la diluizione seriale acustica automatizzata di peptidi per la determinazione della potenza nel drug discovery. Questo metodo riduce l'adsorbimento alla plastica e migliora la qualità dei dati.

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1. Peptide diluizione in serie <ol><li> Preparare tampone: Hanks tamponata soluzione salina (HBSS) supplementato con 25 mM HEPES, 0,1% BSA e 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), pH 7,4. </li><li> Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere sistematicamente 5 ml di tampone in ciascun pozzetto di cinque piastre da 384 pozzetti a basso dosaggio di volume. <ol><li> Utilizzare software interno per creare un programma di erogazione di 5 ml di volume, oltre ad ogni pozzetto di una piastra a 384 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Immergere l&#39;erogazione di tubi cassetta nel tampone e liquido Prime. </li><li> Mettere a 384 pozzetti basso volume piastra di test sul supporto piatto. </li><li> Premi start. </li></ol></li><li> Diluire tutti i campioni di peptidi, indipendentemente dal veicolo di stoccaggio, in tampone per produrre un peptide magazzino 100x. NOTA: I peptidi che richiedono lo screening possono essere fornite in PBS (PBS) o Dimetilsolfossido (DMSO) come si ritiene opportuno (per esempio, DMSO will avere un effetto deleterio sulla peptidi con modifiche secondarie come PEGylation). </li><li> Dispensare 25 ml scorte peptide 100x in colonne 1-5 di acusticamente qualificato in polipropilene 384 pozzetti micropiastra. Questo piatto è designato &#39;piastra fonte A&#39;. Assicurarsi che i piatti di origine, ma non piatti di destinazione, sono a fondo piatto e conformarsi alle tolleranze acustiche specifiche, come definito dal costruttore di strumenti acustici. </li><li> Erogare controllo di riferimento 100x 25 ml in pozzi A23 e A24 della piastra fonte A. </li><li> Dispensare 10 microlitri tampone in colonne 11-15 e tampone 30 microlitri in colonne 21-22 di targa fonte A. </li><li> Dispensare 10 microlitri tampone in colonne e colonne 6-10 16-20 di secondo acusticamente qualificato 384 pozzetti in polipropilene micropiastra. Questo piatto è designato &#39;piastra sorgente B&#39;. </li><li> Centrifuga piastre sorgente A e B a 300 xg per 1 min. Include una piastra di giusto equilibrio. </li><li> Utilizzare flui acusticod distributori integrati in un sistema robotico automatizzato per preparare tre sequenziali 1: 100 diluizioni intermedie (in tampone) degli stock peptidici 100x da colonna 1 in fonte A. NOTA: La programmazione richiede piatto riformattazione e software dose-risposta (come fornito dal produttore del distributore di fluido acustico) per consentire tre trasferimenti acustici tra Source A e Source B (vedi Figura 1 per i layout piastra). Passo 1.9 dettagli specificamente l&#39;uso di dispensatori di fluido utilizzato in questo laboratorio sotto controllo robotico automatizzato (vedi Materiali Tavolo): <ol><li> piastre sorgente di caricamento e piastre di test in piastra sezione albergo della robotica. </li><li> Aprire il software robot automatizzati e di carico piatto riformattazione e protocolli di espansione programma di dose-risposta. Fare clic su &#39;Esegui&#39;. NOTA: Automazione istruisce un distributore di fluido acustica per trasferire 250 nl dalle colonne 1-5 di piatto sorgente A in colonne 6-10 su piastra sorgente B, e un secondo Acoustidispenser fluido C in grado di gestire volumi di fluido più grandi per riempire con 15 microlitri tampone per mescolare. Automazione trasferisce poi piastra sorgente B a centrifuga integrato e centrifughe a 300 xg per 1 min (una piastra equilibrio adeguato è incluso per tutte le fasi di centrifugazione). piatto di origine B viene restituito al distributore di fluido acustica per il trasferimento di 250 nl dalle colonne 6-10 di provenienza piastra B in colonne 11-15 di targa sorgente A ed il riempimento con tampone 15 microlitri per mescolare. Automazione piatto trasferimenti fonte dalla A alla centrifuga e centrifughe a 300 xg per 1 min integrato. Piastra Source A viene quindi restituito al distributore di fluido acustica per il trasferimento di 250 nl dalle colonne 11-15 di targa sorgente A in colonne 16-20 di provenienza piastra B ed il riempimento con tampone 15 microlitri per mescolare. Automazione trasferisce poi piastra sorgente B a centrifuga e centrifughe integrato a 300 xg per 1 min. NOTA: Infine, il protocollo di risposta alla dose dirige erogazione acustica per trasferireil volume richiesto a ciascuno dei 4 pozzetti della piastra sorgente diluite in serie (in entrambe piastra sorgente A e la piastra sorgente B) per costruire una curva di pieno 11 punti in duplicato in piastre di saggio (pre-riempito con tampone 5 microlitri al passo 1.2 ). trasferimenti di automazione piastra test a centrifuga integrato e centrifughe a 300 xg per 1 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delle cellule <ol><li> crioconservati ovariche di criceto cinese (CHO), le cellule che esprimono Scongelare rapidamente il recettore del mouse bersaglio GLP-1 in un bagno d&#39;acqua 37 ° C e risospendere in 20 ml di tampone. </li><li> sospensione cellulare Centrifugare per 5 min a 200 xg a temperatura ambiente (RT). Includere un giusto equilibrio. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere pellet cellulare in 10 ml di tampone. </li><li> Diluire cella stock 1: 1 in Trypan blu e determinare la densità di cellule vitali mediante un contatore di cellule automatizzato. Risospendere le cellule in tampone a 1,6 x 10 6 cellule per ml (equivalenti a 8.000 cellule per well di piastre del saggio). </li><li> Utilizzare un dispensatore di reagente bulk aggiungere 5 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre di saggio (contenenti peptidi serialmente diluiti in tampone 5 microlitri) e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li></ol> Assay 3. HTRF cAMP Detection <ol><li> Portare HTRF cAMP kit di analisi per RT per 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare ogni reagente HTRF (criptato e d2) separatamente in diluizione 1:20 in tampone di lisi (formulazione proprietaria, fornito dal produttore del test di rilevamento cAMP). NOTA: ATTENZIONE: Lysis buffer contiene fluoruro di potassio (KF), che è tossico e teratogeno 13. Per lo smaltimento, piastre di test contenenti KF devono essere sigillati e inceneriti, e qualsiasi rifiuto liquido devono essere diluiti a &lt;1 mmol / L con acqua prima dello smaltimento nel lavandino. </li><li> Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere 5 ml di reagente criptato a tutti i pozzetti delle piastre test. </li><li> Utilizzare un distributore di reagente di massa per aggiungere 5 ml di reagente D2 a Columns 1-22 delle piastre di saggio. </li><li> Immediatamente pipetta manualmente tampone di lisi 5 ml in pozzi A23-D24 delle piastre di analisi per dare pozzetti di controllo (NSB) legame non specifico, e 5 ml di reagente D2 nei pozzetti E23-P24. </li><li> Centrifugare le piastre test per 1 min a 200 xg a temperatura ambiente per mescolare i pozzetti. </li><li> Coprire le piastre test per ridurre al minimo l&#39;evaporazione e la foto-candeggio e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Misurare segnale di fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) con eccitazione a 320 nm ed emissione a 620 nm e 665 nm usando un lettore di piastre. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Utilizzare significare NSB per sottrarre sfondo da tutti i pozzetti. </li><li> Calcolare% Delta F dal / 620 rapporto di 665 nm nm come segue: Rapporto = (A 665nm / A 620nm) x 10 4 Delta F = ((Rapporto Campione - Rapporto NSB) / Rapporto NSB)) x 100 dove Rapporto NSB = pozzi senza reagente D2. </li><li> Calcola% attivata siaion tra le cellule e le cellule non stimolate stimolati con massima GLP-1 ligando come segue: attivazione% = (% Delta Fsample -% cellule DeltaFunstimulated) / (% di cellule DeltaFGLP-1 stimolato -% cellule non stimolate deltaF) x 100 </li><li> Analizzare curve concentrazione-risposta via a 4 parametri di analisi logistica e grafico come attivazione% come definito dal controllo di riferimento 1. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
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<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive l&#39;applicazione di successo di dispensazione acustica automatizzato per diluire serialmente campioni peptide su un intervallo di concentrazione di 3 x 10 6 richiede meno di 1 ml di campione. Il principale vantaggio di questo metodo è quello di aumentare la qualità dei dati riducendo al minimo peptide adsorbimento a plasticware via ridotta l&#39;esposizione di campioni di contenitori sperimentali e plasticware (come ad esempio le punte delle pipette) che normalmente vengono richie...

Il GLP-1R è un altro obiettivo stabilito nel trattamento del diabete di tipo 2 2. L&#39;agonista peptide nativo per questo recettore, GLP-1, ha un in vivo emivita di 2-3 min 3. Il legame di GLP-1 ai suoi accoppiati alle proteine ​​G risultati recettore bersaglio nella produzione a valle del secondo messaggero cAMP attraverso l&#39;accoppiamento nativo proteina G per l&#39;attivazione di adenilato ciclasi. Misura del campo accumulato fornisce un saggio robusto per monitorare l&#39;attivazione del recettore e per lo screening attivi GLP-1 analoghi con proprietà fisico-chimiche preferite. Tale test richiede la diluizione seriale di campioni per costruire curve concentrazione-risposta, e questo è particolarmente complicato quando consegna campioni peptidici. I potenziali errori di preparazione diluizione in serie punta a base sono stati descritti in precedenza 1,4,5. Peptidi viene fortemente assorbito dalle plasticware, con conseguente stime potenza inaffidabili. perdita di peptidi può essere minimizzato attraverso tegli inclusione di albumina sierica bovina (BSA) in buffer e l&#39;uso di plasticware siliconato, eppure proteina legante rimane imprevedibile. In particolare, la variazione nel legame di GLP-1 per contenitori sperimentali è stato descritto 6. C&#39;è un ulteriore complicazione che gli agenti di stabilizzazione utilizzati in laboratorio plasticware può fuoriuscire dalle punte e piastre microtiter nel buffer dosaggio acquosi e interferire con la funzione della proteina 7, 8. Pertanto, i metodi per ridurre l&#39;esposizione al plasticware sono necessari per aumentare la precisione delle misurazioni. Acustici dosatori concentrano un segnale acustico ad alta frequenza sulla superficie di un campione di fluido, con conseguente espulsione delle goccioline precise nanolitri in una piastra di test adiacente 9. L&#39;uso di eiezione acustica è standard nell&#39;industria farmaceutica per la preparazione e lo screening di grandi librerie di composti sintetici, e la tecnologia è stata ben validata per piccole moleculES 10. A nostra conoscenza, siamo il primo gruppo a descrivere erogazione acustico per la preparazione di peptidi ricombinanti e sintetici e abbiamo precedentemente riportato la maggiore precisione rispetto ai metodi di punta a base convenzionale 1. Questo articolo descrive l&#39;integrazione della preparazione di peptidi diluizioni seriali e da trasferimento acustico senza contatto su un sistema di robotica movimentazione piatto completamente automatizzato. Un certo numero di metodi che comprendono trasferimento acustica di campioni sono stati descritti in precedenza 11. Utilizziamo un metodo in due fasi per preparare concentrazioni archivi intermedi e diluire serialmente analoghi peptidici per la generazione della curva dose-risposta completa. I peptidi preparati vengono incubate con cellule che esprimono il mouse bersaglio GLP-1R, e usiamo un test disponibile in commercio omogenea risolta nel tempo di fluorescenza (HTRF) per misurare l&#39;accumulo di cAMP all&#39;interno di queste cellule come una lettura di peptide activ agonistilità. Il test è robusto e suscettibili di un high-throughput formato 384-bene e regolarmente applicata sia sviluppo test e lo screening di stupefacenti progetti 12.

<table><tbody><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Preparato come stock da 0,5 M in DMSO</td></tr><tr><td>GLP-1 (7-36) ammide</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>Preparato come stock da 1 mg/ml in PBS, denominato "controllo di riferimento 100x"</td></tr> <tr><td>Peptidi di prova</td><td>Prodotto internamente presso MedImmune</td><td></td><td>Fornito a varie concentrazioni in DMSO o PBS a seconda dei casi</td></tr><tr><td>Stock di peptidi 100x</td><td>Prodotto internamente presso MedImmune</td><td></td><td>Test peptide diluito in tampone di analisi a 100 volte la concentrazione finale richiesta</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore cellulare Cedex XS</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Piastre da 384 pozzetti, basso volume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified 384-Well Polipropilene Microplate</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio qualificato Echo</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Volumi di trasferimento delle goccioline con incrementi di 2,5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Volumi di trasferimento delle gocce con incrementi di 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab Automation Software di programmazione per la robotica delle scienze della vita</td> Dispenser di reagenti <td>MultidropCombi HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Denominato "dispenser di reagenti sfusi"</td></tr><tr><td>Kit HTRF cAMP Dynamic 2</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>Lettore multietichetta EnVision</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di peptide agonisti in potenza determinazione assays

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Come con la scoperta di nuovi farmaci piccola molecola, lo screening per agonisti peptidici richiede la diluizione di serie di peptidi per la produzione di curve concentrazione-risposta. Screening peptidi offre un ulteriore livello di complessità convenzionali metodi di trattamento del campione con punta a base espongono peptidi ad una grande superficie di plasticware, fornendo una maggiore possibilità di perdita peptide tramite adsorbimento. Prevenire l&#39;eccessiva esposizione al plasticware riduce la perdita di peptide attraverso l&#39;adesione alla plastica e, quindi, riduce al minimo le imprecisioni in potenza previsione, e abbiamo precedentemente descritto i vantaggi di non-contatto acustico erogazione in vitro high-throughput screening di agonisti peptidici 1. Qui si discute di una soluzione di automazione completamente integrata per la preparazione senza contatto acustico di diluizioni seriali peptide in piastre microtitolazione che utilizza l&#39;esempio di screening per agonisti peptidici al glucagone-like peptide-1 del recettore del mouse (GLP-1R). I nostri metodi consentono per altatest per lo screening per agonisti -throughput cell-based e sono facilmente scalabile per supportare un aumento di campioni, o per consentire un aumento del numero di copie targa test (ad esempio, per un gruppo di più linee cellulari di destinazione).

<html> Noi abitualmente uso di un metodo in due fasi per la diluizione peptidi tramite bonifico acustica. Per la prima fase, un erogatore acustica allineato con l&#39;automazione viene usato per creare quattro diluizioni intermedie magazzino peptide attraverso due piastre sorgente (Figura 1a, b). Per la seconda fase, si usa un erogatore acustica per diluire ulteriormente archivi diluizioni dalle piastre sorgente A e B per creare un intervallo di concentra...

L'adsorbimento di peptidi su plastica durante le tradizionali diluizioni seriali basate su puntali può avere un impatto significativo sulla determinazione della potenza e confondere la comprensione delle relazioni struttura-attività utilizzate per l'identificazione del piombo e le fasi di ottimizzazione del piombo della scoperta di farmaci. Qui vengono descritti i metodi per la diluizione seriale acustica automatizzata senza contatto di campioni di peptidi.

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo automatizzato per la diluizione seriale di campioni peptidici è ridurre al minimo l'assorbimento dei peptidi sulle superfici in plastica, consentendo una determinazione accurata della potenza ai fini della scoperta di farmaci. Questo metodo può migliorare la qualità e la riproducibilità dei dati e la rimozione della pipettatura basata su punte elimina anche il trasferimento incrociato dei campioni, evitando che gli errori si propaghino lungo l'intera serie di diluizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aumenta la qualità dei dati riducendo al minimo l'assorbimento dei peptidi sulle superfici in plastica.Questo è particolarmente importante per guidare una campagna di identificazione di un composto attivo o di una relazione struttura-attività nella scoperta di farmaci. Dopo aver preparato il tampone per il saggio e aver creato un programma di dispensazione per un dispensatore in massa seguendo il protocollo descritto, immergere i tubi della cassetta di dispensazione nel tampone del saggio ed eseguire la messa a punto con il liquido. Posizionare una piastra da saggio a basso volume da 384 pozzetti su un supporto per piastre.Quindi premere avvio. Dispensare 25 microlitri di soluzioni peptidiche 100 volte concentrate nelle colonne da uno a cinque di una micropiastra acusticamente qualificata da 384 pozzetti a fondo piatto in polipropilene, che verrà designata come piastra sorgente A. Dispensare 25 microlitri di controllo di riferimento 100 volte concentrato nei pozzetti A23 e A24. Quindi dispensare 10 microlitri di tampone per saggio nelle colonne da 11 a 15 e 30 microlitri di tampone per saggio nelle colonne da 21 a 22.Successivamente, distribuire 10 microlitri di tampone per il saggio nelle colonne sei fino a dieci e sedici fino a venti di una seconda micropiastra in polipropilene acusticamente qualificata da 384 pozzetti, indicata come piastra sorgente B. Centrifugare le piastre sorgente A e B a 300 × g per un minuto. Successivamente, caricare le piastre sorgente e quelle per il saggio nella sezione hotel per piastre del sistema robotico.Quindi, eseguire il software robotico seguendo il protocollo descritto nel testo, utilizzando dispenser acustici di fluidi integrati nel sistema per preparare tre diluizioni intermedie consecutive uno a cento. Iniziare trasferendo dalle colonne da uno a cinque della piastra sorgente A alle colonne da sei a dieci della piastra sorgente B. Dopo aver preparato la prima diluizione uno a cento, consentire all'automazione di trasferire la piastra sorgente B su una centrifuga integrata e centrifugare a 300 ×g per un minuto prima di riportare la piastra al dispenser acustico di fluidi. Successivamente, dopo aver trasferito la soluzione dalla piastra sorgente B alla piastra sorgente A per la seconda diluizione uno a cento, l'automazione trasferirà la piastra sorgente A sulla centrifuga e procederà alla centrifugazione prima di riportare la piastra al dispenser di fluidi.Infine, dopo che l'automazione trasferisce la soluzione dalla piastra A alla B per la terza diluizione 1:100, la piastra B viene nuovamente centrifugata. Queste diluizioni di peptidi nella piastra sorgente A e nella piastra sorgente B vengono quindi utilizzate per preparare curve complete di risposta alla concentrazione nel saggio, come descritto nel protocollo testuale. Questo passaggio è fondamentale poiché una metodologia comparativa basata su punte causa una drastica perdita di potenza del campione a causa dell'assorbimento del peptide sulle superfici in plastica.Scongeliare rapidamente le cellule CHO criopreservate che esprimono il recettore per il GLP1 murino in un bagno d'acqua a 37 gradi e risospendere in 20 millilitri di buffer per saggio. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 × g e a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di buffer per saggio.Con il Trypan Blue, diluire il ceppo cellulare uno a uno e utilizzare un contatore cellulare automatico per determinare la densità cellulare vitale. Successivamente, risospendere le cellule nel buffer per il saggio a una concentrazione di 1,6 milioni di cellule per millilitro. Utilizzando un distributore automatico di reagenti, aggiungere cinque microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto della piastra per il saggio contenente peptidi diluiti in serie e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Per eseguire il saggio di rilevamento dell'AMP ciclico, utilizzare il buffer di lisi per preparare diluizioni 1:20 di ciascun reagente fluorescente omogeneo risolto nel tempo o HTRF. Utilizzare un distributore automatico di reagenti per aggiungere cinque microlitri di reagente criptato a tutti i pozzetti delle piastre per il saggio. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di reagente D2 alle colonne da 1 a 22 della piastra.Successivamente, aggiungere cinque microlitri del reagente D2 nei pozzetti da E23 a P24. Usare immediatamente una pipetta manuale per aggiungere cinque microlitri di buffer di lisi nei pozzetti da A23 a D24, da utilizzare come pozzetti di controllo per il legame non specifico. Centrifugare le piastre del saggio a 200 ×g e a temperatura ambiente per un minuto al fine di mescolare il contenuto dei pozzetti.Quindi coprire le piastre e incubare per un'ora. Al termine dell'incubazione, utilizzare un lettore di piastre per misurare il segnale FRET con un'eccitazione a 320 nanometri e un'emissione a 620 e 665 nanometri. Analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo.Il primo passaggio del trasferimento acustico per il saggio di rilevamento dell'AMP ciclico consiste nel preparare quattro diluizioni intermedie di peptidi stock in due piastre sorgente, come mostrato qui. Nel secondo passaggio, il dispensatore acustico diluisce ulteriormente le soluzioni stock dalle piastre sorgente A e B per creare un intervallo di concentrazione a 11 punti per ciascun peptide in esame, in duplicato, per un totale di 16 peptidi diversi. Viene effettuato un ripristino con tampone del saggio per garantire un volume costante per pozzetto in tutta la piastra del saggio.Qui è mostrata una mappa termica relativa a una piastra esempio contenente 16 peptidi in duplicato, analizzati mediante il saggio di accumulo di AMP ciclico. I valori bassi, mostrati in viola, rappresentano un'elevata concentrazione di AMP ciclico. Queste curve concentrazione-risposta illustrano la riproducibilità dei punti in duplicato.Il campione uno rappresenta un controllo positivo per il saggio. I campioni due, tre e quattro erano inattivi e sono rappresentati dalle linee piatte nel grafico. I campioni da cinque a sedici rappresentano peptidi test attivi.Il metodo qui presentato consente la generazione di curve complete di risposta alla concentrazione su un'ampia gamma di potenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore, ma ciò dipenderà dal numero di campioni che richiedono preparazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i peptidi sono campioni biologici e devono essere manipolati di conseguenza.Per preservarne l'integrit&agrave;, &egrave; consigliabile evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Questa tecnica aprir&agrave; la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci peptidici e permetter&agrave; previsioni precise della potenza necessarie per alimentare le relazioni struttura-attivit&agrave;. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della dispensazione acustica automatizzata per la diluizione seriale di peptidi, il che ridurr&agrave; al minimo la perdita di peptidi dovuta all'assorbimento e aumenter&agrave; l'accuratezza delle misurazioni.Non dimenticare che lavorare con peptidi biologicamente attivi con potenze nell'ordine del picomolare può essere estremamente pericoloso e si dovrebbero sempre adottare precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale.

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Scopri la diluizione seriale acustica automatizzata di peptidi per la determinazione della potenza nel drug discovery. Questo metodo riduce l'adsorbimento alla plastica e migliora la qualità dei dati.

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

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