Name: I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in Drosophila Le larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Impara le tecniche di dissezione della ghiandola linfatica e immunistochimica in Drosophila per studiare l'ematopoiesi. Questi metodi permettono di analizzare gli effetti di alterazioni genetiche e ambientali sui processi cellulari.

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Ringraziamo Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi, e Andreas Jenny per l'assistenza. Ringraziamo István Andó per gli anticorpi specifici per i plasmatociti, Utpal Banerjee per le mosche dome-meso-EBFP2, Julian Martinez-Agosto per le mosche antp>GFP e Michael O'Connor per le mosche ptth e ptth>grim. Questi metodi sono stati sviluppati con il supporto della Kimmel Foundation, della Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 e NIH/NCI T32CA078207.

1. circolazione Concentrazione hemocyte <ol><li> Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore. </li><li> Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di 1x tampone fosfato (PBS, Tabella 1). </li><li> Per ogni larva, mettere 10 microlitri 1x PBS in una provetta su ghiaccio e 10 microlitri 1x PBS su un rilievo da dissezione pulito. Posizionare il pad dissezione su una base stereomicroscopio illuminato. </li><li> Essiccare una larva individuale ponendolo su un tessuto wipe prima di trasferirlo ad un calo PBS sul pad dissezione. </li><li> Utilizzando un paio di pinze, strappare delicatamente aperto e con attenzione invertire la cuticola per rilasciare il emolinfa. NOTA: Fare attenzione a non graffiare o jab la cuticola in quanto ciò potrebbe potenzialmente rilasciare hemocytes sessili 29. </li><li> Utilizzando una pipetta, raccogliere emolinfa dal pad dissezione. Evitare collecting detriti larvale, come il grasso corporeo. </li><li> Aggiungere il emolinfa in una provetta e mescolare pipettando su e giù. NOTA: Diversi campioni possono essere raccolti in una sola volta e tenuti in ghiaccio fino a un&#39;ora. </li><li> Opzionale: Mescolare Trypan blu con il campione emolinfa in parti uguali per tingere ed escludere le cellule morte. Contare le celle nel raggio di 3 min di aggiungere Trypan blu perché è tossico per le cellule. </li><li> Mescolare il campione pipettando su e giù prima di caricare 10 microlitri in una camera emocitometro. </li><li> Se si utilizza un contatore di cellule automatizzato, impostare i parametri appropriati per le dimensioni delle cellule e la circolarità. Ad esempio, impostare una dimensione minima della cella di 2 micron, una dimensione massima delle cellule di 22 micron, e una circolarità di 75 - 80% rotondità per rilevare normali, hemocytes rotonde 34. Esperimento con diversi parametri per rilevare ematociti concentrati più grandi e fusiformi, come lamellocytes. In alternativa, utilizzare un emocitometro per contare manualmente ematociti concentrati. </li></ol> 2. Circulating hemocyte immunoistochimica <ol><li> Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore. </li><li> Mettere una vetrino in ciascun pozzetto di una piastra a 6 o 12 pozzetti. NOTA: Coprioggetto Square (22 mm) in forma in 6 pozzetti e coprioggetto rotonde (diametro 18 mm) in forma in piastre da 12 pozzetti. </li><li> Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di PBS 1x. </li><li> Posizionare 5 microlitri 1x PBS nel centro di ogni coprioggetto. </li><li> Posizionare la piastra su una base stereomicroscopio illuminato. </li><li> Asciugare una larva individuale su un tessuto wipe e poi mettere in PBS sul vetrino. </li><li> Utilizzando un paio di pinze, strappare delicatamente e con attenzione capovolgere la cuticola. Prima di rimuovere la carcassa larvale, utilizzarlo per diffondere la emolinfa in modo uniforme. NOTA: Fare attenzione a non graffiare o jab la cuticola in quanto ciò potrebbe potenzialmente rilasciare hemocytes sessili 29. </li><li> ripetT per tutte le larve, raccogliendo l&#39;emolinfa di una larva per ogni vetrino. Consentire hemocytes di aderire alle lamelle per 5 -. 8 minuti a temperatura ambiente temperatura ambiente Non superare 30 minuti prima della fissazione. </li><li> Fissare hemocytes aggiungendo 5 ml di 7,5% di formaldeide (Tabella 1) per ciascun coprioggetto per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare coprioggetto tre volte con PBS 1x. Suggerimento la piastra e aspirare PBS dopo ogni lavaggio. Per evitare deflusso della soluzione permeabilizzazione nella fase successiva, utilizzare l&#39;aspiratore per rimuovere l&#39;eccesso di PBS dai perimetro delle lamelle. </li><li> Aggiungere 100 microlitri soluzione permeabilizzazione (Tabella 1) per ciascun coprioggetto per 20 minuti a RT. </li><li> Tip e Tap delicatamente la piastra per aspirare la soluzione di permeabilizzazione. </li><li> Diluire anticorpo primario con soluzione di anticorpi (Tabella 1) secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere almeno 500 microlitri soluzione di anticorpo primario coprioggetto in piastre da 12 pozzetti.Aggiungere almeno 1,5 ml in piastre da 6 pozzetti. Incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare coprioggetto con 1x PBS per 10 minuti in un agitatore orbitale, tre volte. </li><li> Diluire anticorpo secondario con soluzione di anticorpi secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere almeno 500 microlitri soluzione di anticorpo secondario a lamelle in piastre da 12 pozzetti. Aggiungere almeno 1,5 ml per 6 pozzetti. Incubare per almeno 2 ore a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare coprioggetto con 1x PBS per 10 minuti su un agitatore orbitale come al punto 2.10, tre volte. </li><li> Durante le fasi di lavaggio, microscopio in vetro pulito vetrini con etanolo al 70% (Tabella 1) utilizzando salviette di tessuto. Per ogni vetrino, posizionare 5 ml di montaggio tampone (Tabella 1) sul vetrino. NOTA: Due vetrini stare su una diapositiva. </li><li> Aspirare il lavaggio finale PBS. </li><li> Usare pinze per rimuovere con attenzione i coprioggetti dai piatti e luogo, inverted, sulla sommità del buffer di montaggio. Nota: i vetrini del microscopio possono essere conservati a 4 ° C prima di imaging. Il tempo massimo di memorizzazione dipende dalla stabilità degli anticorpi utilizzati. 6 e 12 pozzetti possono essere risciacquati e riutilizzati. </li></ol> 3. In Vivo cristallo cellulare melanizzazione <ol><li> Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore. </li><li> Prima di iniziare, impostare una sorgente di riscaldamento a 60 ° C. NOTA: Un programma termica cycler di 60 ° C per 10 min (seguita da C hold 25 °) funziona meglio, ma un bagno d&#39;acqua o altra fonte di calore è sufficiente fino a quando il calore viene distribuito in modo coerente e uniforme su ogni larva. </li><li> Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di PBS 1x (Tabella 1). </li><li> Uno alla volta, asciugare una larva su un tessuto pulire e posto sul fondo di un tubo di PCR. Posizionare ogni larvain un tubo PCR separata. (Vedi Figura 3A). </li><li> Per risultati coerenti, affinché soggiorno larve al fondo delle provette PCR da raffreddamento larve nei tubi a 4 ° C per 10 - 15 min e / o leggermente toccando i tubi prima del riscaldamento. </li><li> Mettere le provette PCR nel termociclatore (o bagno d&#39;acqua). Riscaldare a 60 ° C per 10 min. </li><li> Rimuovere con attenzione le larve dai tubi di PCR in dissezione pozzi piatto pieno di 1x PBS fresco. </li><li> larve secco su un tessuto pulire e organizzare su una superficie piana per l&#39;imaging allo stereomicroscopio. </li><li> Punteggio immagini di larve ciecamente da più individui. </li></ol> 4. larvale delle ghiandole linfatiche immunoistochimica NOTA: La ghiandola linfatica si trova circa un terzo tratto dall&#39;estremità anteriore di una larva leggermente sotto il cervello sul lato dorsale. (Vedi freccia nella figura 3B.) La ghiandola linfatica fiancheggia il vaso dorsale ed è più facilmente sezionato attaccato al hoo boccaks o al cervello. Wild-type, terzo stadio ghiandole linfatiche sono strutture molto piccole; i lobi principali sono circa 100 - 200 micron di lunghezza. (Vedi Figura 4A). <ol><li> Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore. </li><li> Linfa ghiandola dissezione <ol><li> Per ciascuna condizione sperimentale, aggiungere 1 ml di PBS 1X (Tabella 1) a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Aggiungere 1 goccia di 0,1% PBST (Tabella 1) a ciascun pozzetto usando una pipetta monouso. NOTA: detergente, ad esempio Tween 20, viene aggiunto per abbassare la tensione superficiale, che il tessuto si depositano sul fondo del pozzo. </li><li> Posizionare la piastra piatta sul ghiaccio. </li><li> Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di PBS 1x. </li><li> Posizionare un pad dissezione pulito su una base stereomicroscopio illuminato. Utilizzare una pipetta usa e getta per posizionare Small scende dello 0,01% PBST (Tabella 1) sul pad. Trasferire una larva di una goccia PBST per la dissezione. </li><li> Tenere la larva con un paio di pinze a circa la lunghezza di un quarto dalla fine posteriore, dorsale verso l&#39;alto. </li><li> Utilizzare un altro paio di pinze per afferrare la cuticola anteriori immediatamente alle pinze che stanno frenando la larva. Tirare delicatamente la cuticola verso l&#39;estremità anteriore fino a quando i ganci bocca sono esposti. NOTA: L&#39;obiettivo è quello di sbucciare la cuticola senza disturbare eventuali strutture interne. </li><li> Rilasciare la cuticola e utilizzare entrambe le pinze per tagliare la larva in due. Rimuovere l&#39;estremità posteriore dalla goccia PBST. NOTA: Se la cuticola non buccia fino ai ganci bocca, tagliare la larva in due e togliere la fine posteriore. Utilizzare un paio di pinze per afferrare il bordo della cuticola, e utilizzare l&#39;altra coppia di pinze per spingere i ganci bocca attraverso l&#39;apertura. Questo invertire la cuticola ed esporre i ganci bocca. Questo può essere usato come alternate metodo dissezione pure. </li><li> Utilizzare un paio di pinze da definire la cuticola (sia la cuticola ventrale, il lembo dorsale cuticola, o entrambi) per la stabilità. </li><li> Utilizzare un altro paio di pinze per afferrare i ganci bocca esposti e delicatamente tirare fuori. NOTA: Questo separerà la cuticola dalle strutture interne. Idealmente, l&#39;occhio / dischi immaginali antennali, cervello, ghiandole anello, e ghiandole linfatiche che fiancheggiano il vaso dorsale rimane attaccato ai ganci bocca. </li><li> Mentre ancora in mano i ganci bocca, rimuovere con attenzione le strutture indesiderate come ad esempio le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e intestino. NOTA: Se il cervello separa dai ganci della bocca, la ghiandola linfatica potrebbe essere ancora attaccato ai raccolti e con il cervello. In questo caso, tenere il cordone nervoso ventrale invece dei ganci bocca. </li><li> Utilizzando i ganci bocca o cordone nervoso ventrale come una maniglia, trasferire il complesso sezionato contenente la ghiandola linfatica al pozzo sul ghiaccio. Non superare 30 minprima della fissazione. </li></ol></li><li> Fissazione e immunoistochimica <ol><li> Posizionare la piastra 24 pozzetti sulla base stereomicroscopio. </li><li> Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il PBST dal pozzo. NOTA: Vuoto, pozzi vicini sono utili per depositare temporaneamente i rifiuti. </li><li> Aggiungere delicatamente 200 microlitri 3,7% di formaldeide (Tabella 1) lungo il lato del bene e agitare la piastra per garantire che i tessuti sezionati sono completamente sommerse. </li><li> Riportare la piastra di ghiaccio per 30 min. Se le ghiandole linfatiche esprimono la proteina fluorescente (s), tenere la piastra coperta per evitare photobleaching. </li><li> Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il fissativo. </li><li> Lavare aggiungendo 200 microlitri 1x PBS al pozzo e posizionando la piastra su un agitatore orbitale per 5 min a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il PBS. NOTA: fisso linfonodi possono essere lasciati sul ghiaccio in PBS fino ghiandole linfatiche per tutte le condizioni sperimentali sono dissected e fissa. </li><li> Ripetere il lavaggio passaggi altre due volte. </li><li> Aggiungere 200 microlitri soluzione permeabilizzazione (Tabella 1) al pozzo. Impostare la piastra su un agitatore orbitale per 45 minuti a RT. NOTA: 45 min è il &quot;gold standard&quot; per la linfa ghiandola permeabilizzazione ma gli autori hanno successo dopo soli 20 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione con una pipetta p200. </li><li> Diluire anticorpo primario con soluzione di anticorpi (Tabella 1) secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 ml soluzione di anticorpo primario al bene e garantire che i tessuti dissezionati sono completamente sommerse. Incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere l&#39;anticorpo primario. </li><li> Lavare aggiungendo 200 microlitri 1x PBS al pozzo e posizionando la piastra su un agitatore orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il PBS. </li><li> Ripetere il lavaggio passaggi altre due volte. </li><li> Diluire una secondariantibody con soluzione di anticorpi secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 ml soluzione di anticorpo secondario al pozzo e garantire che i tessuti dissezionati sono completamente sommerse. Incubare su un agitatore orbitale per almeno 2 ore a RT. </li><li> Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere l&#39;anticorpo secondario e lavare come descritto nei passaggi 4.3.12 e 4.3.13. Non rimuovere la PBS dopo il lavaggio finale. </li></ol></li><li> Linfa montaggio ghiandola <ol><li> Pulire microscopio in vetro diapositive utilizzando etanolo al 70% (Tabella 1) e salviette di tessuto. </li><li> Per ciascuna condizione sperimentale, posizionare una goccia di montaggio tampone (Tabella 1) sul vetrino. NOTA: Due condizioni stare su una diapositiva. Montaggio polmone dipende dal numero di ghiandole linfatiche da montare. Utilizzare 2 ml per circa 18 - 20 ghiandole linfatiche, 1 ml per 10 - 12, e 0,5 microlitri per 5 o meno. </li><li> Posizionare il vetrino da microscopio su una base stereomicroscopio illuminato. </li><li> Per un massimo di due condizioni alla volta, trasferire tutti i ghiandole linfatiche dal pozzo al buffer di montaggio con una pinza, utilizzando i ganci bocca o cordone nervoso ventrale come impugnatura. </li><li> Spazio tessuti sezionati in modo uniforme in una forma circolare o rettangolare, diffondendo il buffer di montaggio nel processo. </li><li> Per singoli tessuti sezionati, singolarmente, far scorrere una pinza della pinza sotto il vaso dorsale e tirare delicatamente verso la periferia del buffer di montaggio. NOTA: Questo attirerà la linfa ghiandola dal resto dei tessuti sezionati e appiattire la ghiandola linfatica sul vetro. </li><li> Utilizzando una pinza della pinza e di un movimento di taglio, tagliare il vaso dorsale tra la ghiandola linfatica e il cervello. </li><li> Spostare il resto dei tessuti sezionati al lato opposto della ghiandola linfatica, sul bordo esterno del buffer. NOTA: I tessuti sezionati indesiderati finiranno per formare un perimetro attorno alle ghiandole linfatiche e servire da supporto su which il vetrino riposerà. </li><li> Ripetere l&#39;operazione fino a quando tutti i linfonodi sono separati dai tessuti sezionati, riservando uno dei tessuti sezionati indesiderati svolge nel centro. </li><li> Prendete un vetrino tra due dita. Verificare che il vetrino sia privo di polvere e impronte digitali. Se necessario, usare un tessuto wipe e il 70% di etanolo per pulire il vetrino. </li><li> Assicurare che il bordo del vetrino è parallela al bordo del vetrino, attenzione abbassare il vetrino sul tampone di montaggio. NOTA: i vetrini del microscopio possono essere conservati a 4 ° C prima di imaging. Il tempo massimo di memorizzazione dipende dalla stabilità degli anticorpi utilizzati. piastre da 24 pozzetti possono essere lavati e riutilizzati. </li></ol></li></ol> 5. Imaging <ol><li> Immagine hemocytes fisso e montato ghiandole linfatiche su una fluorescenza standard appropriato o microscopio confocale a 20X di ingrandimento o superiore in base alle istruzioni per l&#39;uso del produttore. Immagine intera larve su un supportostereomicroscopio ARD a 2X ingrandimento in base alle istruzioni per l&#39;uso del produttore. </li><li> Seguire le istruzioni del fornitore di software per la deconvoluzione, se lo si desidera. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Composizione </td><td> Conservazione </td><td> Commenti </td></tr><tr><td rowspan="5"> 1x PBS </td><td> cloruro di potassio / L 200 mg </td><td rowspan="5"> temperatura ambiente </td><td rowspan="5"></td></tr><tr><td> 200 mg / L di fosfato di potassio monobasico </td></tr><tr><td> cloruro di sodio / L 8.000 mg </td></tr><tr><td> 1.150 mg / L di fosfato sodico bibasico </td></tr><tr><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> Fissativo </td><td> 3,7% o 7,5% di formaldeide in PBS 1x </td><td> temperatura ambiente al buio </td><td> La formaldeide è tossica. </td></tr><tr><td rowspan="3"> soluzione permeabilizzazione / diluente anticorpo</td><td> 0,4% Triton </td><td rowspan="3"> 4 ° C </td><td rowspan="3"> La formula standard utilizza 0,4% Triton ma gli autori utilizzano 0,1% Tween 20 con successo. Utilizzare per diluire gli anticorpi primari e secondari in base alle concentrazioni consigliate fornitori. </td></tr><tr><td> 5% albumina di siero bovino, siero normale di capra, o siero normale asino </td></tr><tr><td> 1x PBS </td></tr><tr><td> 70% di etanolo </td><td> 70% di etanolo 200 prova a dH2O </td><td> temperatura ambiente </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> buffer di montaggio </td><td> 0,5% N-propil gallato </td><td rowspan="4"> 4 ° C al buio </td><td rowspan="4"> N-propil gallato è dannoso. DAPI è un agente mutageno. </td></tr><tr><td> 80% glicerolo </td></tr><tr><td> Opzionale: 1 mg / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) </td></tr><tr><td> 1x PBS </td></tr><tr><td> 0,1% PBST </td><td> 0,1% di Tween 20 in PBS 1x </td><td> temperatura ambiente </td&gt; <td></td></tr><tr><td> 0,01% PBST </td><td> Diluizione 1:10 di 0,1% PBST </td><td> temperatura ambiente </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Soluzioni utilizzati nel presente protocollo.

<ol><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thicker+than+blood%3A+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).</li>
<li>Crozatier, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila haematopoiesis.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+a+model+for+studying+genetic+and+molecular+aspects+of+haematopoiesis+and+associated+leukaemias%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias.</a> Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).</li>
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<li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Larval+Hemocytes+of+Drosophila-Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster.</a> Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).</li>
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<li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prothoracicotropic+hormone+regulates+developmental+timing+and+body+size+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila.</a> Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).</li>
<li>Reimels, T. A., Pfleger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rabex-5+restricts+Notch+activity+in+hematopoietic+cells+and+maintains+hematopoietic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis.</a> J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o finanziari.

Su alterazione genetica o ambientale, i quattro metodi descritti qui possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione di analizzare i processi distinti durante emopoiesi, come la segnalazione, la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione Drosophila emopoiesi è un processo dinamico.; il numero di hemocytes per animale aumenta 35 e la struttura e l&#39;espressione genica della ghiandola linfatica variazioni 32 durante lo sviluppo. Prima di eseguire questi test, quindi, ...

I complessi meccanismi che regolano i fattori di trascrizione e vie di segnalazione che coordinano lo sviluppo del sistema ematopoietico e che malfunzionamento malattie ematologiche sono ancora poco chiare. Questi fattori di trascrizione e vie di segnalazione, così come la loro regolamentazione, sono altamente conservati tra Drosophila e mammiferi emopoiesi 1-5. Così il sistema ematopoietico Drosophila rappresenta un ottimo modello genetico per definire i meccanismi molecolari che controllano l&#39;emopoiesi e malattie ematologiche sottostanti. Simile a mammiferi, Drosophila generare cellule del sangue, chiamate ematociti concentrati, in spazialmente e temporalmente distinte fasi di emopoiesi. Tradizionalmente, Drosophila emopoiesi è stato pensato per essere limitato alle fasi del mesoderma embrionale e nella ghiandola linfatica larvale. Recenti studi dimostrano che emopoiesi si verifica anche in larvale clu sessilisters e nell&#39;adulto addome 6-8. Tutte le fasi ematopoietiche producono due tipi di ematociti concentrati mature: plasmatocytes e cellule di cristallo. Plasmatocytes sono cellule macrofagi come coinvolti nella fagocitosi, l&#39;immunità innata, e la guarigione della ferita. celle a cristalli contengono pro-phenoloxidases necessari per melanizzazione, una reazione usato in risposte immunitarie insetti e la guarigione delle ferite. Emopoiesi larvale può generare un terzo tipo hemocyte maturo, chiamato lamellocyte, in risposta ad alcune sfide immunitario come parassitoide vespa infezione 9,10. Lamellocytes sono grandi, cellule aderenti che funzionano, in collaborazione con plasmatocytes e le cellule di cristallo, per incapsulare e neutralizzare le uova di vespa di cui in Drosophila larve. In assenza di parassitizzazione, lamellocytes non si trovano nel wild-type larve. masse melanotic assomigliano melanized, uova vespa incapsulati; molti ceppi mutanti di Drosophila sviluppano masse melanotici in assenza di parassitizzazione. La presenza di Lamellociti e / o masse melanotici possono essere indicativi di anomalie ematopoietiche. In realtà, il fenotipo di massa melanotico è stato utilizzato per identificare i geni e meccanismi coinvolti nella emopoiesi 11-14. Il sistema ematopoietico larvale è il più ampiamente studiato fino ad oggi. Si compone di ematociti concentrati circolanti nel emolinfa, i cluster hemocyte sessili fantasia sotto la cuticola, e ematociti concentrati che risiedono nella ghiandola linfatica. La ghiandola linfatica è una serie di lobi bilaterali collegati al vaso dorsale. Ogni lobo principale della ghiandola linfatica è diviso in tre zone principali. La zona più esterna è conosciuta come la zona corticale e contiene maturazione hemocytes. La zona più interna viene chiamata zona midollare e comprende precursori hemocyte quiescenti. La terza zona, la segnalazione posteriori centro, è un piccolo gruppo di cellule alla base della ghiandola linfa che agiscono come una cellula simile nicchia stelo. I primi lavori stabilito funzioni critiche per Notch 15-18 </sup&gt;, Riccio 19,20, JAK-STAT 18 e ali 21 attività per regolare lo sviluppo della ghiandola linfa larvale. Studi più recenti hanno dimostrato che BMP 22, FGF-Ras 23, e Hippo 24,25 funzione di segnalazione anche all&#39;interno della ghiandola linfatica larvale. Quattro saggi ematopoietiche larvali qui esposti descrivono 1) misura la concentrazione hemocyte circolazione, definito come numero di cellule per unità di volume, 2) l&#39;isolamento e il fissaggio di circolazione hemocytes per immunoistochimica, 3) la visualizzazione di cellule di cristallo in vivo, e 4) dissezione, il fissaggio e il montaggio ghiandole linfatiche per immunoistochimica. Questi test possono essere utilizzati come letture ematopoietiche per valutare le funzioni ei regolamenti dei percorsi di segnalazione nel sistema ematopoietico larvale. Mentre questi metodi sono stati utilizzati in precedenza nel campo, documentazione visiva di questi saggi ha iniziato solo recentemente 8,26-30. Diverse pubblicazioni citate qui ci sono di aiutorisorse ful che descrivono metodi simili e marcatori ematopoietici 26,31-33. Inoltre, Trol e Viking sono marcatori utili della membrana linfatico della ghiandola seminterrato.

<table><tbody><tr><td>Compresse PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>piatto da dissezione</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>silicone dissecting pad, realizzato con il kit Sylgard 184</td><td>Krayden (distribuito da Fisher)</td><td>NC9644388 (numero di catalogo Fisher)</td><td>Realizzato in capsula di Petri mescolando i componenti del kit di elastomeri Sylgard secondo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>stereomicroscopio</td><td>Morrell Instruments (distributore Nikon)</td><td>mna42000, mma36300</td><td>modelli Nikon SMZ1000 e SMZ645</td></tr><tr><td>salvietta per tessuti</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>pinza</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72700-DZ</td><td></td></tr><tr><td>p200 pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contatore di cellule automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber vetrini</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>tripano colorazione blu</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>formaldeide</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Rocky Mountain Biologicals</td><td>BSA-BSH-01K</td><td></td></tr><tr><td>siero di capra normale</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>siero d'asino normale</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>200 prova etanolo</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>N-propil gallato</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>VWR</td><td>EM-4750</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo)</td><td>Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>vetro di copertura del microscopio, quadrato 22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr> vetro <tr><td>di copertura del microscopio, 18 mm circolare</td><td>Fisher</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>vetrini per microscopio Fisher</td><td></td><td>22-034-980</td><td></td></tr><tr><td>termociclatore</td><td>Eppendorf</td><td>E950010037</td><td>Mastercycler EP Gradient S</td></tr><tr><td>Provette PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>pipetta di trasferimento monouso</td><td>Fisher</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td> microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager.Z1</td></tr></tbody></table>

i metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; drosophila</em&gt; le larve

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Molti paralleli esistenti tra i sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e, anche se Drosophila manca il lignaggio linfoide che caratterizzano mammiferi immunità adattativa. Drosophila e mammiferi emopoiesi si verificano in spazialmente e temporalmente distinte fasi per la produzione di diverse linee cellulari del sangue. Entrambi i sistemi mantengono riserve di progenitori di cellule del sangue con il quale espandere o sostituire linee maturi. Il sistema ematopoietico permette Drosophila e mammiferi per rispondere e di adattarsi alle sfide del sistema immunitario. È importante sottolineare che i regolatori trascrizionali e vie di segnalazione che controllano la generazione, la manutenzione, e la funzione del sistema ematopoietico sono conservati dalle mosche ai mammiferi. Queste somiglianze consentono Drosophila da utilizzare per geneticamente modello di sviluppo ematopoietiche e la malattia. Qui dettaglio test per esaminare il sistema ematopoietico di Drosophila larve. Inparticolare, si delineano i metodi per misurare il numero di cellule del sangue e la concentrazione, visualizzare una specifica stirpe maturo in vivo, ed eseguire immunoistochimica sulle cellule del sangue in circolazione e nell&#39;organo ematopoietiche. Questi test possono rivelare cambiamenti nell&#39;espressione genica e dei processi cellulari tra cui la segnalazione, la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione e può essere utilizzato per indagare su una serie di domande riguardanti emopoiesi. In combinazione con gli strumenti genetici disponibili in Drosophila, questi test possono essere utilizzati per valutare il sistema ematopoietico su alterazioni genetiche definiti. Sebbene non specificamente qui delineato, questi saggi possono anche essere utilizzati per esaminare l&#39;effetto di alterazioni ambientali, come infezioni o dieta, sul sistema ematopoietico.

Di circolazione hemocyte Concentrazione Numeri hemocyte aumentano durante lo sviluppo larvale 35. Per illustrare che questo metodo rileva le differenze nei numeri hemocyte e concentrazione, indipendentemente dalla causa biologica, abbiamo misurato concentrazioni hemocyte di ritardo e non ritardata larve. Perdita di ormone prothoracicotropic (ptth) per l&#39;ablazione genetica dei neuroni ptth produttrici (ptth&gt; cupo...

Sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e condividono molte caratteristiche comuni, rendendo Drosophila un modello genetico interessante per lo studio ematopoiesi. Qui mostriamo dissezione e montaggio del grande organo ematopoietico larvale per immunoistochimica. Descriviamo anche metodi per saggiare i vari compartimenti ematopoietici larvali tra emociti circolanti e le cellule di cristallo sessili.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

L'obiettivo generale di questi procedimenti è analizzare diversi componenti del sistema ematopoietico di Drosophila, con particolare enfasi sulla dissezione e sul montaggio del linfonodo per l'immunocitochimica. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ematopoiesi di Drosophila, inclusi gli effetti di alterazioni genetiche o ambientali su processi come la sopravvivenza, la proliferazione, la differenziazione e la segnalazione cellulare delle linee ematopoietiche.Il principale vantaggio di queste tecniche è che, quando utilizzate in combinazione, possono aiutare a distinguere gli effetti specifici che le alterazioni hanno su processi complessi durante l'ematopoiesi. Iniziare il prelievo dell'emolinfa aggiungendo 10 microlitri di PBS 1x in una provetta da microcentrifuga e ponendo la provetta sul ghiaccio. Successivamente, depositare una goccia di 10 microlitri di PBS 1x su un supporto pulito per dissezione.Selezionare un singolo larva e asciugarlo posizionandolo su un fazzoletto di carta, quindi trasferirlo sulla goccia di PBS presente sul supporto per dissezione. Utilizzando pinzette, strappare delicatamente e invertire la cuticola per ri

methods-to-examine-the-lymph-gland-and-hemocytes-in-drosophila-larvae

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Parassitoide (parassita) vespe costituiscono una classe importante di nemici naturali di insetti tra...

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Questo video descrive la ghiandola linfatica di Drosophila, il sito primario dell'emopoiesi nella larva di mosca, e mostra un esempio di protocollo per sezionare e montare l'organo per l'immunoistochimica e l'imaging fluorescente.

Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti della Drosophila

L'emolinfa di Drosophila funge sia da sangue che da liquido interstiziale, circolando in tutto il corpo durante gli stadi larvali e adulti. Questo video descrive un protocollo per raccogliere l'emolinfa larvale al fine di quantificare le cellule circolanti.

Rottura delle cuticole: un metodo per raccogliere l'emolinfa dalle larve di Drosophila

Questo video dimostra il test di disturbo dell'emocita, valutando la riadesione degli emociti nelle tasche ematopoietiche delle larve di Drosophila. Il disturbo meccanico rilascia gli emociti residenti, aumentando la conta degli emociti circolanti. Dopo il recupero, la riaderenza degli emociti residenti è confermata, illustrando la reversibilità.

Un test di disturbo degli emociti per valutare la riadesione degli emociti alle tasche ematopoietiche

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Le cellule del sangue di Drosophila, o emociti, si alternano tra i siti residenti e la circolazione.  Nella larva, gli emociti residenti (sessili) si localizzano in microambienti induttivi, le tasche ematopoietiche, mentre gli emociti circolanti si muovono liberamente nell'emolinfa. L'obiettivo di questo protocollo è l'isolamento e la quantificazione standardizzati di queste due popolazioni di emociti, comportamentali distinte ma interscambianti.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.

Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo

Questo protocollo descrive un saggio in vivo di fagocitosi usato per valutare e quantificare la capacità degli emociti di Drosophila melanogaster giovani e invecchiati di batteri fagocitosi.

Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

Impara le tecniche di dissezione della ghiandola linfatica e immunistochimica in Drosophila per studiare l'ematopoiesi. Questi metodi permettono di analizzare gli effetti di alterazioni genetiche e ambientali sui processi cellulari.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in

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