L'uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo

L'obiettivo generale dell'analisi indotta di settori somatici è fornire una tecnica a medio-alto rendimento per la caratterizzazione funzionale di geni e costrutti promotori nel tessuto secondario del fusto degli alberi in tempi relativamente brevi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo a dove e quando viene espressa la risposta a pericoli, nonché al loro ruolo in processi biologicamente importanti come la formazione del legno e lo sviluppo secondario del fusto. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di una procedura efficiente, semplice e relativamente rapida, applicabile a un'ampia gamma di specie arboree.

Per iniziare, preparare un tubo sterile da 50 millilitri con tappo a vite contenente 19 millilitri di mezzo LB fresco, alla temperatura di 28 gradi Celsius, con gli antibiotici appropriati per la selezione batterica. Aggiungere un millilitro di coltura di A.tumefaciens e misurare la densità ottica, o DO, a 600 nanometri. Se il valore di DO è superiore a 0,1, diluire ulteriormente con LB tiepido. Incubare la coltura di A.tumefaciens in un incubatore sotto agitazione fino a quando la DO a 600 raggiunge un valore compreso tra 0,4 e 0,6.

Una volta raggiunto questo risultato, centrifugare le cellule per 15 minuti a quattro gradi Celsius e 1.000 x g. Decantare il liquido dal tubo e ri-sospendere immediatamente il pellet cellulare con un millilitro di mezzo MS freddo. Trasferire la sospensione in un microtubo pulito da due millilitri e conservare sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Avviare l'esperimento durante la primavera o l'inizio dell'estate e selezionare piante con un cambium attivo e in rapida crescita. Questo è confermato se il floema può essere facilmente staccato dal xilema. Identificare una sezione dritta del fusto vicino alla base della pianta e rimuovere tutte le foglie o i rami.

Utilizzando un bisturi affilato, praticare una finestra cambiale di un centimetro quadrato creando due incisioni parallele di 20 millimetri attraverso il floema, distanti cinque millimetri l'una dall'altra, e quindi un'unica incisione orizzontale che intersechi le due incisioni verticali all'estremità basale. Sollevare verso l'alto la striscia di floema per esporre il tessuto xilematico in via di sviluppo. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere un quantitativo sufficiente di mezzo di inoculo per inumidire completamente la superficie dello xilema esposto.

Immediatamente, reinserire la striscia di floema nel fusto e fissarla saldamente con parafilm. Ripetere questi passaggi di inoculazione per tutti i geni o promotori di interesse, creando nuove finestre cambiali almeno un centimetro sopra o sotto le finestre esistenti e con un offset di 90 gradi. In aggiunta, inoculare le finestre con i vettori di controllo positivo e negativo sullo stesso fusto o su fusti separati, come per le inoculazioni sperimentali.

Monitorare periodicamente la crescita del fusto e, una volta osservata una crescita radiale di almeno cinque millimetri, raccogliere il tessuto per un saggio beta-glucuronidasi, o saggio GUS. Per raccogliere il materiale in esame, rimuovere innanzitutto la finestra cambiale dal fusto, eliminando qualsiasi tessuto non appartenente alla nuova crescita. Per studi relativi alla morfologia cellulare o tissutale del xilema e del floema maturi, separare il floema dal xilema.

In alternativa, per indagini che richiedono il mantenimento dell'integrità della zona cambiale o la valutazione di schemi di espressione del promotore, tagliare trasversalmente la finestra cambiale utilizzando una lametta per creare dischi dello spessore compreso tra 0,5 e un millimetro. Posizionare i tessuti della finestra cambiale raccolti in tubi individuali rotondi da 14 millilitri e lavarli due volte in tampone fosfato 0,1 molare a pH 7 per cinque minuti ogni volta, assicurandosi che il tessuto sia completamente immerso. Al termine del secondo lavaggio, prestare attenzione a rimuovere tutta la soluzione in eccesso.

Successivamente, aggiungere cinque millilitri di reagente GUS in ogni provetta. Se questo non copre completamente il campione di tessuto, aggiungere ulteriore reagente. Incubare le provette per dieci minuti a 55 gradi Celsius al buio.

In seguito, incubare i tubi per ulteriori 12-16 ore su un agitatore a 37 gradi Celsius al buio, utilizzando un'agitazione delicata. Dopo aver rimosso i tubi dall'incubatore, prelevare un sottoinsieme casuale di questi e verificare il pH del reagente GUS mediante carta indicatrice al tornasole con intervallo di pH compreso tra zero e sette. Se alcuni di essi presentano un pH inferiore a sei, etichettarli e controllare il pH dei tubi rimanenti.

Etichettare ed escludere eventuali provette con un pH inferiore a sei. Decantare il reagente GUS dalle provette e sostituirlo con etanolo al 70 percento in quantità sufficiente a coprire il tessuto. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Utilizzando una coppia pulita di pinzette, rimuovere tutto il tessuto della finestra cambiale da un tubo campione e posizionarlo su un piccolo vassoio o una piastra di Petri per la visualizzazione al microscopio. Posizionare il campione sotto l'obiettivo di un microscopio stereoscopico con un ingrandimento compreso tra 1X e 4X e identificare e contare il numero di cellule o tessuti che mostrano una colorazione blu brillante. Negli esempi in cui il floema è stato rimosso, contare il numero di settori nel tessuto cambiale presenti sulla superficie del xilema in via di sviluppo.

Per i campioni tagliati a forma di disco, contare il numero di settori presenti nei diversi tipi cellulari o tessutali. Assicurarsi di osservare entrambi i lati del disco e di abbinare i settori che si estendono su due dischi per evitare sovrastime del conteggio. Riporre nuovamente nel tubo contenente etanolo al 70 percento soltanto il tessuto che presenta settori, conservandolo fino al momento dell'utilizzo.

Ripetere l'analisi per tutte le ulteriori finestre cambiali raccolte, inclusi i controlli positivi e negativi. Per facilitare l'identificazione accurata nella classificazione dei settori, si consiglia di prendere familiarità con l'anatomia e lo sviluppo secondario del fusto, inclusa la risposta del fusto alle ferite. Questa figura mostra diverse trasformazioni riuscite, visibili come regioni di colorazione blu.

Un esempio di finestra di scollatura del floema mostra diversi settori trasformati e dischi raccolti da due specie di alberi, che evidenziano settori di trasformazione e successiva crescita radiale. È possibile osservare la trasformazione in una gamma di tipi di tessuti. In questo caso, settori del fusto sono visibili nel periderma, nel floema, nel parenchima da ferita e in diverse altre regioni tessutali del pioppo bianco.

Questa immagine mostra i risultati dell'espressione del promotore genico nei derivati del cambium. In questo esempio, viene illustrata la proporzione di colorazione in ciascun tipo di tessuto in un esperimento che coinvolge una serie di promotori CesA di *Eucalyptus grandis* trasformati in fusti di ibridi di eucalipto. L'espressione nel floema e nel xilema in via di sviluppo e sviluppato è rappresentata in percentuale.

Il numero medio di eventi di trasformazione per centimetro di cambium inoculato può essere calcolato anche per ogni promotore o gene di interesse. Questa tabella mostra i dati relativi ai settori tipici identificati in soggetti di eucalipto e pioppo trasformati con un controllo positivo o con un promotore di interesse, analizzati mediante il metodo di raccolta dei dischi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire un metodo rapido, efficiente e ampiamente applicabile per analizzare la complessa natura della differenziazione del cambium con la formazione nello sviluppo secondario del fusto.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare piante e batteri, come trasformare, coltivare e raccogliere fusti, nonché di come identificare e classificare il tessuto transgenico per la valutazione fenotipica.