L'uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo

L'obiettivo generale dell'analisi del settore somatico indotto è quello di fornire una tecnica di rendimento medio-alto per la caratterizzazione funzionale di costrutti genici e promotori nel tessuto secondario dello stelo dell'albero in tempi relativamente brevi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su dove e quando si è manifestato il pericolo, nonché sul loro ruolo in processi biologicamente importanti come la formazione del legno e lo sviluppo secondario del fusto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è una procedura efficiente, facile e relativamente veloce applicabile a un'ampia gamma di specie arboree.

Per iniziare, prepara una provetta pulita da 50 millilitri con tappo a vite con 19 millilitri di terreno fresco a 28 gradi Celsius LB con gli antibiotici appropriati per la selezione batterica. Aggiungere un millilitro di coltura di A. tumefaciens e controllare la densità ottica, o OD, a 600 nanometri. Se l'OD è superiore a 0,1, diluire ulteriormente con LB caldo. Posizionare la coltura di A. tumefaciens in un'incubatrice vibrante fino a quando l'OD 600 è compreso tra 0,4 e 0,6.

Una volta ottenuto ciò, centrifugare le celle per 15 minuti a quattro gradi Celsius e 1.000 x g. Decantare il liquido dal tubo e risospendere immediatamente il pellet della cella con un millilitro di terreno MS raffreddato. Trasferire la sospensione in una microprovetta pulita da due millilitri e conservarla in ghiaccio fino al momento del bisogno.

Inizia l'esperimento durante la primavera o l'inizio dell'estate e seleziona piante con un cambio attivo e a crescita rapida. Ciò è confermato se il floema può essere facilmente staccato dallo xilema. Identifica una sezione diritta del fusto vicino alla base della pianta e rimuovi eventuali foglie o rami.

Usando un bisturi affilato, taglia una finestra cambiale di un centimetro quadrato creando due incisioni parallele di 20 millimetri attraverso il floema a cinque millimetri di distanza l'una dall'altra e poi un singolo taglio orizzontale che divide in due i due tagli verticali all'estremità basale. Guarire la striscia di floema verso l'alto esponendo il tessuto xilematico in via di sviluppo. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere una quantità sufficiente di terreno di inoculazione per bagnare completamente la superficie dello xilema esposto.

Immediatamente, reinserire la striscia di floema nello stelo e legarla saldamente in posizione con il parafilm. Ripetere queste fasi di inoculazione per tutti i geni o i promotori di interesse, creando nuove finestre cambiali almeno un centimetro sopra o sotto le finestre esistenti e con un offset di 90 gradi. Inoltre, inoculare le finestre con i vettori di controllo positivi e negativi sullo stesso stelo o steli, come gli inoculati sperimentali.

Monitorare periodicamente la crescita dello stelo e, una volta osservata una crescita radiale di almeno cinque millimetri, prelevare il tessuto per un test della beta-glucuronidasi o GUS. Per raccogliere il materiale di prova, asportare prima la finestra cambiale dallo stelo rimuovendo qualsiasi tessuto che non faccia parte della nuova crescita. Per gli studi relativi alla morfologia matura delle cellule o dei tessuti dello xilema e del floema, staccare il floema dallo xilema.

In alternativa, per le indagini che richiedono che la zona cambiale rimanga intatta, o che i modelli di espressione del promotore debbano essere valutati, tagliare la finestra cambiale trasversalmente utilizzando una lama di rasoio per creare dischi di spessore compreso tra 0,5 e un millimetro. Posizionare i tessuti della finestra cambiale raccolti in singole provette a fondo tondo da 14 millilitri e risciacquare due volte in tampone fosfato molare 0,1 a pH 7 per cinque minuti ogni volta, assicurandosi che il tessuto sia completamente sommerso. Al termine del secondo risciacquo, fare attenzione a rimuovere tutta la soluzione in eccesso.

Quindi, aggiungere cinque millilitri di reagente GUS a ciascuna provetta. Se questo non copre completamente il campione di tessuto, aggiungere altro reagente. Incubare le provette per dieci minuti a 55 gradi Celsius al buio.

Successivamente, incubare le provette per altre 12-16 ore su uno shaker a 37 gradi Celsius al buio agitando delicatamente. Dopo averli rimossi dall'incubatrice, prelevare un sottogruppo casuale delle provette e controllare il pH del reagente GUS utilizzando una cartina di tornasole con un intervallo di pH compreso tra zero e sette. Se qualcuno di essi ha un pH inferiore a sei, etichettarli e controllare il resto delle provette.

Etichettare ed escludere le provette con un pH inferiore a sei. Decantare il reagente GUS dalle provette e sostituirlo con una quantità di etanolo al 70% sufficiente a coprire il tessuto. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Utilizzando un paio di pinze pulite, rimuovere tutto il tessuto della finestra cambiale da una provetta per campioni e posizionarlo su un piccolo vassoio o una capsula di Petri per la visualizzazione microscopica. Posizionare il campione sotto la lente di un microscopio da dissezione con un ingrandimento compreso tra 1X e 4X e identificare e conteggiare il numero di cellule o tessuti che mostrano una colorazione blu brillante. Negli esempi in cui il floema è stato rimosso, contare il numero di settori nel tessuto cambiale che si trovano sulla superficie dello xilema in via di sviluppo.

Per i campioni tagliati in dischi, contare il numero di settori presenti nei diversi tipi di cellule o tessuti. Assicurarsi che entrambi i lati del disco siano visualizzati e che i settori che si trovano su due dischi corrispondano per garantire che i numeri non vengano sovrastimati. Riposizionare solo i settori contenenti tessuto nella provetta contenente il 70% di etanolo e conservare fino al momento del bisogno.

Ripetere l'analisi per eventuali finestre cambiali aggiuntive raccolte, compresi i controlli positivi e negativi. Per facilitare l'identificazione accurata nella classificazione dei settori, si consiglia di acquisire familiarità con l'anatomia e lo sviluppo dello stelo secondario, comprese le risposte dello stelo alle ferite. Questa figura mostra diverse trasformazioni riuscite viste qui come regioni di colorazione blu.

Un esempio di finestra a buccia di floema mostra più settori trasformati e i dischi raccolti da due specie arboree mostrano i settori di trasformazione e la successiva crescita radiale. Si può anche osservare la trasformazione in una serie di tipi di tessuto. Qui i settori del fusto possono essere visti nel periderma, nel floema, nel parenchima della ferita e in molte altre regioni tissutali del pioppo bianco.

Questa immagine mostra i risultati dell'espressione del promotore genico nei derivati cambiali. In questo esempio, vediamo la proporzione di colorazione in ciascun tipo di tessuto in uno studio che coinvolge una serie di promotori CesA di eucalipto grandis trasformati in steli di ibridi di eucalipto. L'espressione nel floema, negli xilemi in via di sviluppo e sviluppati è rappresentata in percentuale.

Il numero medio di eventi di trasformazione per centimetro di cambio inoculato può anche essere calcolato per ogni promotore o gene di interesse. In questa tabella sono riportati i dati per settori tipici identificati in soggetti eucalipto e pioppo trasformati con un controllo positivo o promotore di interesse analizzati con il metodo della raccolta a dischi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire un metodo rapido, efficiente e ampiamente applicabile per sezionare la complessa natura della differenziazione cambiale con formazione nello sviluppo secondario dello stelo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare piante e batteri, come trasformare, coltivare e raccogliere gli steli, nonché come identificare e classificare il tessuto transgenico per la valutazione fenotipica.