Name: Luso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri l'Induced Somatic Sector Analysis per caratterizzare geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e nello sviluppo secondario del fusto. Questo metodo efficiente è applicabile a diverse specie arboree.

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Gli autori desiderano ringraziare il sostegno finanziario per l'aspetto del lavoro attraverso le sovvenzioni Linkage LP0776563 (GB, AS) e LP0211919 (GB) e i partner industriali Sappi e Mondi, nonché l'Australian Postgraduate Award (EM) dall'Australian Research Council e il Young Innovators and Scientist Award attraverso il Dipartimento dell'Agricoltura australiano (LT). Desideriamo inoltre ringraziare Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan e Simon Southerton per le numerose discussioni e idee che hanno avanzato durante lo sviluppo di questo protocollo e Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel e Noemie Defaix per l'assistenza nel lavoro di laboratorio.

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo ISSA è un metodo relativamente semplice ed efficiente per la creazione di tessuti staminali transgeniche in specie di alberi nel giro di pochi mesi per l&#39;analisi dei geni e promotori di interesse coinvolti in legno e stelo formazione. Poco sforzo, al di là di mantenere in vita le piante, è necessario far crescere transgenico tessuti staminali dopo l&#39;inoculazione, che è in contrasto con i metodi in vitro in cui è necessario vasta coltura per mantenere il tessuto o le piante, dove la produzi...

Albero deriva comprendono una notevole quantità di pianeti biomassa e sono di grande importanza biologica, culturale e commerciale. Secondaria steli creare habitat, fornendo risorse e rifugio per molte altre forme di vita. Forniscono molti altri servizi per gli ecosistemi in cui vivono e agiscono come risorsa rinnovabile per la produzione di legname, polpa e carta e altri prodotti di legno e non legnosi. sviluppo gambo secondario e più specificamente formazione del legno è regolata dal sistema molecolare complessa che regolano lo sviluppo di specifici tipi cellulari, la composizione biochimica delle loro pareti cellulari e come sono disposte a formare tessuti e organi. Dissezione delle basi molecolari di sviluppo secondaria dello stelo e la formazione del legno è confuso da molti fattori tra cui la variabilità delle proprietà del legno e staminali all&#39;interno e tra le steli, lunghi tempi di generazione, out-crossing sistemi di accoppiamento, alta eterozigosi, alto carico genetico, dormienza stagionale, lungo maturoperiodi stabilimento tratto e la dimensione fisica pura e semplice di alberi maturi. Come risultato, comprensione dello sviluppo stelo secondaria rispetto alla conoscenza dettagliata della maggior parte degli altri aspetti del controllo molecolare di sviluppo delle piante, è ancora nella sua infanzia. Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati per studiare e comprendere lo sviluppo secondaria dello stelo, in particolare il legno e la formazione della parete cellulare secondaria. Questi protocolli prevedono l&#39;utilizzo di piante intere o sistemi parte pianta, dove vengono creati sia piante transgeniche o cellule secondaria specifici o tessuti si trasformano per lo studio di aspetti specifici di legno e / o sviluppo secondaria dello stelo 1. Le piante transgeniche possono essere recuperati trasformazione post genetico da una vasta gamma di tessuti vegetali e tipi di cellule, tuttavia, il progresso è lento, soprattutto nell&#39;analisi tratti di fibra di legno a causa di lunga rigenerazione e stelo tempi di maturazione (dell&#39;ordine di anni), alta tecnica e Deman lavorods, bassa produttività dei geni candidati, nonché difficoltà di moltiplicazione alcune specie di piante legnose. Tecniche simili sono state sviluppate nel sistema modello non legnoso, come Arabidopsis che superare con successo alcune di queste limitazioni, ma non tutti i tipi di cellule staminali secondarie un presente in questi steli e le caratteristiche legate alla stagionalità o la longevità non può essere studiato in tali specie 2. In alternativa, i sistemi Parte della pianta, come ad esempio Pinu s radiata callo culture 3 riducono i tempi associati. Questi metodi sono tuttavia limitati allo studio di un tipo di cellula singola e soffrono vincoli simili come osservato per esperimenti in vitro. Allo stesso modo, le culture staminali apicali 4 coinvolgono espianti staminali intere hanno mostrato risultati promettenti, ma ancora non sono state applicate per lo studio di geni o promotori di interesse specifici. Più recentemente, un protocollo alternativo coinvolge colture di radici pelose è stato sviluppato per eucalypts ed è stato correttamenteapplicato 5, tuttavia, questo metodo richiede ancora nella coltivazione in vitro, coinvolge radici secondarie, piuttosto che i gambi e fino ad oggi si è limitato a una singola specie di alberi. Induced analisi di settore somatica (ISSA), come descritto qui, è stato sviluppato per superare alcuni di questi problemi fornendo un mezzo per un throughput elevato strumento di screening funzionale dei geni e promotori con presunti ruoli in formazione del legno e lo sviluppo del tessuto secondaria dello stelo. ISSA è una trasformazione e di screening sistema in vivo che è stato sviluppato per ridurre il tempo necessario per produrre cellule transgeniche e tessuti in uno stelo secondaria intatta superando lavoro, limitazioni tecniche e throughput abitualmente utilizzati metodi in vitro. I protocolli descritti consentono la creazione simultanea di centinaia di settori tissue trasformati indipendentemente e cellule secondaria steli entro un breve periodo di tempo, nelle specie arboree e tessuto di interesse senza gvariazione Enetic e / o ambientale in tempi relativamente brevi e costo del lavoro basso. ISSA vivo tecniche in sono stati descritti per la secondaria dello stelo 6 e Bud 7 tessuti e da allora sono stati raffinati in tessuto secondaria dello stelo attraverso studi di geni e / o promotori coinvolti nella differenziazione cambiale e comprendono: tubulina (TUB) 8, fasciclin simile Arabinogalactan ( FLA) 9, cellulosa sintasi (CESA) 10, parete cellulare associato dominio nac secondaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e veramente interessante nuovo gene (RING) H2 proteina 13. Questi studi sono stati condotti in secondaria steli di piante di pioppo e eucalipto e forniti approfondimenti morfologia delle cellule, la chimica della parete cellulare e l&#39;espressione genica. I protocolli descritti qui hanno lo scopo di riunire l&#39;esperienza di unND conoscenze acquisite attraverso lo sviluppo e l&#39;applicazione di ISSA da una serie di studi pubblicati e non pubblicati negli ultimi dieci anni. Essi si concentrano sulla trasformazione in vivo dei tessuti staminali secondarie 6 e si concentrano su studi che coinvolgono clone Populus alba &#39;pyramidalis&#39;, Eucalyptus globulus così come 11 Eucalyptus globulus x cloni camaldulensis. Questo documento prende ricercatori attraverso il protocollo dalla coltivazione di piante e batteri, la trasformazione dei tessuti staminali, la crescita e la raccolta di tessuto, identificazione di cellule e tessuti transgenici, preparazione per le valutazioni fenotipiche e metodi per la raccolta e l&#39;analisi dei dati. Mentre le tecniche sono state applicate con successo per misurare la composizione monosaccharide parete cellulare anche 9,11, a causa di limitazioni di spazio, questo documento si concentra sulle tecniche utilizzate per la cella di misura e la morfologia dei tessuti e comprensione dei modelli di espressione genica in v secondariaSME soltanto. Di conseguenza, il protocollo come descritto è adatto a coloro che desiderano acquisire ulteriori approfondimenti sul ruolo e / o l&#39;espressione dei geni legati alla secondaria steli con un basso costo, tecnicamente facile e medio-metodo di throughput elevato.

<table><tbody><tr><td>Piante</td><td>NA</td><td>NA Si</td><td>prega di consultare i fornitori di vivai locali per le piante secondo necessità</td></tr><tr><td>Ceppo di Agrobacterium</td><td>NA</td><td>NA Ci</td><td>sono molte strade possibili per ottenere ceppi di Agrobactrium. Ti suggeriamo di seguire la tua comunità di ricerca locale poiché potrebbero esserci restrizioni nell'ottenere i batteri nel tuo paese e regione.</td></tr><tr><td>Vettore binario (gene e promotore)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Abbiamo sviluppato una gamma di vettori per adattarsi al protocollo ISSA utilizzando un sistema di ricombinasi Gateway. Ciò include la sovraespressione, i knockout RNAi e i vettori di fusione del promotore basati su vettori pCAMBIA modificati e felici di fornire secondo necessità. Inoltre, ci sono molti vettori disponibili per la comunità di ricerca.</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>LB media con agar</td><td>Sigma</td><td>L2897</td><td>Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Sigma</td><td>NA</td><td>Il numero di catalogo dipenderà dall'antibiotico richiesto poiché una gamma di antibiotici viene utilizzata per la selezione batterica in vettori binari. Questo prodotto potrebbe provenire da un&nbsp; gamma di aziende</td></tr><tr><td>50 ml Tubi con tappo a vite</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>2 ml Microtubo</td><td>Watson Bio Lab</td><td>132-620C</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>Sigma</td><td>M9274</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Lama per bisturi n. 11</td><td>Sigma</td><td>S2771</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Questo è il miglior prodotto da utilizzare per legare la finestra cambiale post creazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubi a fondo tondo da 14 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>X-Gluc</td><td>X-GLUC direct</td><td></td><td>Dovrai andare sul sito web per ordinare - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio (III)</td> <td>Sigma</td><td>244023</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio (II)</td> <td>Sigma</td><td>P9387</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Carta di tornasole</td><td>Sigma</td><td>WHA10360300</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Lama di rasoio a filo singolo</td><td>ProSciTech</td><td>L055</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Lama di rasoio a doppio taglio</td><td>ProSciTech</td><td>L056</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>SEM Pin Stub</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Fiala campione con tappo a vite</td><td>ProSciTech</td><td>L6204</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>sigma</td><td>E7023</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>LR bianco</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>Lo stesso prodotto potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Stampo per incorporamento</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>Consigliamo questa varietà, tuttavia ci sono molte opzioni disponibili</td></tr><tr><td>Water Soulable supporti di montaggio</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td><td>Un esempio di un supporto di montaggio che potrebbe essere utilizzato tuttavia esistono altre opzioni e potrebbero essere esplorate.</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td>Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>Un prodotto simile potrebbe provenire da un'altra azienda</td></tr><tr><td>Quanta Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Questo è lo strumento utilizzato in parte di questo studio, ma qualsiasi altro SEM che abbia una modalità a basso vuoto potrebbe essere utilizzato</td></tr> Il <tr>software <td></td><td></td> di<td>imaging ImageJ</td><td>può essere reperito dal seguente URL http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di induced somatica settore analisi (issa) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e sviluppo secondaria dello stelo

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

la crescita secondaria dello stelo in alberi e formazione del legno associato sono significativi sia dal punto di vista biologico e commerciali. Tuttavia, relativamente poco si sa circa il controllo molecolare che governa il loro sviluppo. Questo è in parte dovuto alla fisica, risorse e limitazioni di tempo spesso associato con lo studio dei processi di crescita secondari. Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati coinvolge sia parte di pianta o di tutto il sistema impianto sia legnoso e specie vegetali non legnose. Tuttavia, le domande circa la loro applicabilità per lo studio dei processi di crescita secondaria dello stelo, la riluttanza di alcune specie e l&#39;intensità di lavoro sono spesso proibitivi per medie e applicazioni ad alta produttività. Inoltre, se si considerano la formazione di sviluppo gambo e legno secondario i tratti specifici sotto inchiesta potrebbero diventare solo misurabile fine del ciclo di vita di un albero, dopo diversi anni di crescita. In queste sfide alternativa in vivo protocols sono stati sviluppati, chiamato indotta somatica Analisi settoriale, che comporta la creazione di settori dei tessuti somatici transgenici direttamente nella secondaria dello stelo della pianta. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un mezzo efficace, semplice e relativamente veloce generare transgenico tessuti vegetali secondaria per il gene e caratterizzazione funzionale promotore che può essere utilizzato in una varietà di specie di albero. I risultati qui presentati indicano che i settori staminali secondarie transgenici possono essere creati in tutti i tessuti vivi e di tipi di cellule nel secondario steli di una varietà di specie arboree e che il legno caratteristiche morfologiche e pattern di espressione promotore di secondaria steli può essere facilmente valutata facilitare medio-alta caratterizzazione funzionale di throughput.

Usando questo protocollo sono stati indicati tutti i tipi di cellule staminali e tessuti secondari dal vivo per essere suscettibile di A. tumefaciens trasformazioni e sono stati definiti in tipi di settore in base al tipo di cellule inizialmente trasformato ed è conseguente modello di crescita di sviluppo. Tipi settore includono periderm, floema, cambiale, parenchima delle ferite e Tylose (figura 1b, 1c, 1d) e possono essere tro...

Qui presentiamo un protocollo che facilita la caratterizzazione funzionale a medio e alto rendimento di costrutti di geni e promotori nel tessuto staminale secondario dell'albero in tempi relativamente brevi. È efficiente, facile da usare e ampiamente applicabile a una vasta gamma di specie arboree.

L&#39;uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

L'obiettivo generale dell'analisi indotta di settori somatici è fornire una tecnica a medio-alto rendimento per la caratterizzazione funzionale di geni e costrutti promotori nel tessuto secondario del fusto degli alberi in tempi relativamente brevi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo a dove e quando viene espressa la risposta a pericoli, nonché al loro ruolo in processi biologicamente importanti come la formazione del legno e lo sviluppo secondario del fusto. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di una procedura efficiente, semplice e relativamente rapida, applicabile a un'ampia gamma di specie arboree.Per iniziare, preparare un tubo sterile da 50 millilitri con tappo a vite contenente 19 millilitri di mezzo LB fresco, alla temperatura di 28 gradi Celsius, con gli antibiotici appropriati per la selezione batterica. Aggiungere un millilitro di coltura di A.tumefaciens e misurare la densità ottica, o DO, a 600 nanometri. Se il valore di DO è superiore a 0,1, diluire ulteriormente con LB tiepido. Incubare la coltura di A.tumefaciens in un incubatore sotto agitazione fino a quando la DO a 600 raggiunge un valore compreso tra 0,4 e 0,6.Una volta raggiunto questo risultato, centrifugare le cellule per 15 minuti a quattro gradi Celsius e 1.000 x g. Decantare il liquido dal tubo e ri-sospendere immediatamente il pellet cellulare con un millilitro di mezzo MS freddo. Trasferire la sospensione in un microtubo pulito da due millilitri e conservare sul ghiaccio fino al momento dell'uso.Avviare l'esperimento durante la primavera o l'inizio dell'estate e selezionare piante con un cambium attivo e in rapida crescita. Questo è confermato se il floema può essere facilmente staccato dal xilema. Identificare una sezione dritta del fusto vicino alla base della pianta e rimuovere tutte le foglie o i rami.Utilizzando un bisturi affilato, praticare una finestra cambiale di un centimetro quadrato creando due incisioni parallele di 20 millimetri attraverso il floema, distanti cinque millimetri l'una dall'altra, e quindi un'unica incisione orizzontale che intersechi le due incisioni verticali all'estremità basale. Sollevare verso l'alto la striscia di floema per esporre il tessuto xilematico in via di sviluppo. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere un quantitativo sufficiente di mezzo di inoculo per inumidire completamente la superficie dello xilema esposto.Immediatamente, reinserire la striscia di floema nel fusto e fissarla saldamente con parafilm. Ripetere questi passaggi di inoculazione per tutti i geni o promotori di interesse, creando nuove finestre cambiali almeno un centimetro sopra o sotto le finestre esistenti e con un offset di 90 gradi. In aggiunta, inoculare le finestre con i vettori di controllo positivo e negativo sullo stesso fusto o su fusti separati, come per le inoculazioni sperimentali.Monitorare periodicamente la crescita del fusto e, una volta osservata una crescita radiale di almeno cinque millimetri, raccogliere il tessuto per un saggio beta-glucuronidasi, o saggio GUS. Per raccogliere il materiale in esame, rimuovere innanzitutto la finestra cambiale dal fusto, eliminando qualsiasi tessuto non appartenente alla nuova crescita. Per studi relativi alla morfologia cellulare o tissutale del xilema e del floema maturi, separare il floema dal xilema.In alternativa, per indagini che richiedono il mantenimento dell'integrità della zona cambiale o la valutazione di schemi di espressione del promotore, tagliare trasversalmente la finestra cambiale utilizzando una lametta per creare dischi dello spessore compreso tra 0,5 e un millimetro. Posizionare i tessuti della finestra cambiale raccolti in tubi individuali rotondi da 14 millilitri e lavarli due volte in tampone fosfato 0,1 molare a pH 7 per cinque minuti ogni volta, assicurandosi che il tessuto sia completamente immerso. Al termine del secondo lavaggio, prestare attenzione a rimuovere tutta la soluzione in eccesso.Successivamente, aggiungere cinque millilitri di reagente GUS in ogni provetta. Se questo non copre completamente il campione di tessuto, aggiungere ulteriore reagente. Incubare le provette per dieci minuti a 55 gradi Celsius al buio.In seguito, incubare i tubi per ulteriori 12-16 ore su un agitatore a 37 gradi Celsius al buio, utilizzando un'agitazione delicata. Dopo aver rimosso i tubi dall'incubatore, prelevare un sottoinsieme casuale di questi e verificare il pH del reagente GUS mediante carta indicatrice al tornasole con intervallo di pH compreso tra zero e sette. Se alcuni di essi presentano un pH inferiore a sei, etichettarli e controllare il pH dei tubi rimanenti.Etichettare ed escludere eventuali provette con un pH inferiore a sei. Decantare il reagente GUS dalle provette e sostituirlo con etanolo al 70 percento in quantità sufficiente a coprire il tessuto. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Utilizzando una coppia pulita di pinzette, rimuovere tutto il tessuto della finestra cambiale da un tubo campione e posizionarlo su un piccolo vassoio o una piastra di Petri per la visualizzazione al microscopio. Posizionare il campione sotto l'obiettivo di un microscopio stereoscopico con un ingrandimento compreso tra 1X e 4X e identificare e contare il numero di cellule o tessuti che mostrano una colorazione blu brillante. Negli esempi in cui il floema è stato rimosso, contare il numero di settori nel tessuto cambiale presenti sulla superficie del xilema in via di sviluppo.Per i campioni tagliati a forma di disco, contare il numero di settori presenti nei diversi tipi cellulari o tessutali. Assicurarsi di osservare entrambi i lati del disco e di abbinare i settori che si estendono su due dischi per evitare sovrastime del conteggio. Riporre nuovamente nel tubo contenente etanolo al 70 percento soltanto il tessuto che presenta settori, conservandolo fino al momento dell'utilizzo.Ripetere l'analisi per tutte le ulteriori finestre cambiali raccolte, inclusi i controlli positivi e negativi. Per facilitare l'identificazione accurata nella classificazione dei settori, si consiglia di prendere familiarità con l'anatomia e lo sviluppo secondario del fusto, inclusa la risposta del fusto alle ferite. Questa figura mostra diverse trasformazioni riuscite, visibili come regioni di colorazione blu.Un esempio di finestra di scollatura del floema mostra diversi settori trasformati e dischi raccolti da due specie di alberi, che evidenziano settori di trasformazione e successiva crescita radiale. È possibile osservare la trasformazione in una gamma di tipi di tessuti. In questo caso, settori del fusto sono visibili nel periderma, nel floema, nel parenchima da ferita e in diverse altre regioni tessutali del pioppo bianco.Questa immagine mostra i risultati dell'espressione del promotore genico nei derivati del cambium. In questo esempio, viene illustrata la proporzione di colorazione in ciascun tipo di tessuto in un esperimento che coinvolge una serie di promotori CesA di *Eucalyptus grandis* trasformati in fusti di ibridi di eucalipto. L'espressione nel floema e nel xilema in via di sviluppo e sviluppato è rappresentata in percentuale.Il numero medio di eventi di trasformazione per centimetro di cambium inoculato può essere calcolato anche per ogni promotore o gene di interesse. Questa tabella mostra i dati relativi ai settori tipici identificati in soggetti di eucalipto e pioppo trasformati con un controllo positivo o con un promotore di interesse, analizzati mediante il metodo di raccolta dei dischi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire un metodo rapido, efficiente e ampiamente applicabile per analizzare la complessa natura della differenziazione del cambium con la formazione nello sviluppo secondario del fusto.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare piante e batteri, come trasformare, coltivare e raccogliere fusti, nonché di come identificare e classificare il tessuto transgenico per la valutazione fenotipica.

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