Name: Infezione sperimentale con Listeria monocytogenes Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Scopri come infettare topi C57BL/6J con Listeria monocytogenes e misurare le risposte dell'interferone-gamma nelle cellule immunitarie. Questo protocollo semplice permette di studiare la sopravvivenza e i meccanismi di difesa dell'ospite.

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Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da una sovvenzione operativa da CIHR (MOP97807) a SED.

<ol><li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).</li>
<li>Ranson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+V+alpha+14%2B+NKT+cells+participate+in+the+early+response+to+enteric+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).</li>
<li>Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+immunity%3A+a+T-cell-independent+pathway+of+macrophage+activation%2C+defined+in+the+scid+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse.</a> Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).</li>
<li>Soudja, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory-T-cell-derived+interferon-gamma+instructs+potent+innate+cell+activation+for+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity.</a> Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).</li>
<li>Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interferon-gamma+during+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses.</a> Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+IL-12%2F23-+and+IFN-gamma-mediated+immunity%3A+molecular%2C+cellular%2C+and+clinical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features.</a> Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).</li>
<li>Flynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Cooper, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+tuberculosis+in+interferon+gamma+gene-disrupted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice.</a> J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).</li>
<li>Dalton, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+of+immune+cell+function+in+mice+with+disrupted+interferon-gamma+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes.</a> Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).</li>
<li>Harty, J. T., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immunity+to+Listeria+monocytogenes+in+the+absence+of+IFN+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma.</a> Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+in+mice+that+lack+the+interferon-gamma+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor.</a> Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).</li>
<li>Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+effector+cells+default+to+the+Th2+pathway+in+interferon+gamma-deficient+mice+infected+with+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major.</a> J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).</li>
<li>Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+aroA-+infection+in+gene-targeted+immunodeficient+mice%3A+major+role+of+CD4%2B+TCR-alpha+beta+cells+and+IFN-gamma+in+bacterial+clearance+independent+of+intracellular+location%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location.</a> J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).</li>
<li>Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+IFN+gamma+in+protection+against+tumor+development+and+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).</li>
<li>Hodge, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+AU-rich+element+removal+promotes+chronic+IFN-gamma+expression+and+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice.</a> J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).</li>
<li>Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+and+lupus+nephritis+in+transgenic+mice+expressing+interferon+gamma+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis.</a> J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).</li>
<li>Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+interferon-gamma+and+interleukin-4+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus.</a> J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).</li>
<li>Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+affects+homing+of+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells.</a> J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).</li>
<li>Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Use+of+Interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical Use of Interferon-gamma.</a> Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).</li>
<li>Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gammadelta+T+cells+in+alpha-galactosylceramide-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity.</a> J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).</li>
<li>Leonard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+single-dose+interleukin-12+exposure+on+interleukin-12-associated+toxicity+and+interferon-gamma+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.</a> Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).</li>
<li>Zenewicz, L. A., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%3A+a+short+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview.</a> Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).</li>
<li>Viegas, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma+production+by+CD27%28%2B%29+NK+cells+exacerbates+Listeria+monocytogenes+infection+in+mice+by+inhibiting+granulocyte+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization.</a> Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).</li>
<li>Selvanantham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+and+Nod2+enhance+TLR-mediated+invariant+NKT+cell+activation+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection.</a> J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+9B.2+Listeria+monocytogenes%3A+cultivation+and+laboratory+maintenance%2C+Chapter+31B%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2013).</li>
<li>Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+animals+for+research--issues+to+consider+for+rodents+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits.</a> ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Obernier, J. A., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+an+appropriate+period+of+acclimatization+following+transportation+of+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals.</a> ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).</li>
<li>BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf">http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf</a> (2007).</li>
<li>Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com/tutorials">http://www.flowjo.com/tutorials</a> (2016).</li>
<li>Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonizing+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+activity+enhances+Th1+immunity+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice.</a> J. Immunol. , (2015).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Amer+Stat+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nonparametric estimation from incomplete observations.</a> J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Brown, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+CD28-mediated+signals+in+T+helper+subset+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation.</a> J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+difference+in+anti-Listeria+resistance+of+C57BL%2F6+and+A%2FJ+mice+is+not+eliminated+by+active+immunization+or+by+transfer+of+Listeria-immune+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells.</a> Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%2C++Chapter+19%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li>
<li>Mekada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+among+C57BL%2F6+substrains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Genetic differences among C57BL/6 substrains.</a> Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).</li>
<li>Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+transmission+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+via+ingestion+of+contaminated+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food.</a> J Vis Exp. (75), e50381(2013).</li>
<li>Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+in+E-cadherin+responsible+for+host+specificity+towards+the+human+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes.</a> Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).</li>
<li>Wollert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129 (5), 891-902 (2007).</li>
<li>Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+Listeria+monocytogenes+to+CD8%2B+T+cells+requires+secretion+of+hemolysin+and+intracellular+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth.</a> J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).</li>
<li>Muraille, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dendritic+cell+activation+by+live+versus+killed+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes.</a> Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).</li>
<li>Datta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+Listeria+induces+protective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity.</a> Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).</li>
<li>Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+of+direct+ex+vivo+epitope+mapping+identifies+dominant+and+subdominant+CD4+and+CD8+T+cell+epitopes+from+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Listeria+monocytogenes+as+a+live+vaccine+vehicle+for+the+induction+of+protective+anti-viral+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).</li>
<li>Foulds, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+CD4+and+CD8+T+cells+are+intrinsically+different+in+their+proliferative+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.</a> J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi da divulgare.

Qui si descrive un protocollo di come effettuare una infezione sperimentale di base con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 in C57BL 6J maschi o femmine /. Questo protocollo è stato istituito con lo scopo di studiare l&#39;effetto di un romanzo piccola molecola IS001 sulla produzione di IFN-γ da parte dei linfociti innata e adattativa in vivo 31. Monitorando la clearance batterica e la sopravvivenza dopo l&#39;infezione, intuizioni sono state acquisite in modo questi cambiamenti n...

IFN-γ è una citochina che è cruciale per mediare l&#39;immunità contro i patogeni intracellulari e per il controllo della crescita tumorale 5. L&#39;importanza di questa citochina nella resistenza batterica è evidente nell&#39;osservazione che gli esseri umani con mutazioni nel percorso di segnalazione di IFN-γ sono altamente suscettibili all&#39;infezione con micobatteri e salmonelle 6. Allo stesso modo, i topi carenti di entrambi IFN-γ o difetti del recettore espositive IFN-γ nella resistenza alla micobatteri 7-9 e altri agenti patogeni intracellulari, tra cui L. monocytogenes 10,11, Leishmania importante 12, Salmonella typhimurium 13, e alcuni virus 11. Oltre agli agenti patogeni Lotta contro, IFN-γ gioca un ruolo cruciale in Host-difesa contro i tumori 14. Sebbene maggiore produzione di IFN-γ è utile nel contesto di infezione o tumore, la produzione prolungata di questa citochina è stato collegato to lo sviluppo di autoimmunità sistemica 15-17 e l&#39;accelerazione del diabete di tipo I nei diabetici non obesi modello di topo 18. Le principali fonti di IFN-γ includono le cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T helper, le cellule T 1 (Th1), e linfociti T citotossici (CTL) 5,19,20. IFN-γ migliora sia innata e adattativa per: (1) up-regolazione complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II espressione, (2) aumentare l&#39;espressione di molecole co-stimolatorie sulle cellule presentanti l&#39;antigene, (3) macrofagi migliorare fattori fagocitosi e la produzione di citochine pro-infiammatorie e microbicidi (ad esempio, l&#39;ossido di azoto e le specie reattive dell&#39;ossigeno), (4) promuovere la differenziazione delle cellule T CD4 + naive in cellule effettrici Th1, (5) promuovere il passaggio di classe di anticorpi di immunoglobuline ( Ig) 2a e IgG3 (nel topo), (6) inducendo la produzione di chemochine reclutare cellule immunitarie di siti di infection, e (7) miglioramento delle cellule NK e le risposte CTL 5,19. Data l&#39;importanza cruciale di IFN-γ in risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni e tumori, ricombinante IFN-γ è stato testato come trattamento per varie infezioni e neoplasie (recensito in 19). Tuttavia, a causa somministrazione sistemica di IFN-γ o citochina Th1 promuovere l&#39;interleuchina-12 (IL-12) è associato ad effetti collaterali e dose-correlati tossicità 19,21, vi è interesse a sviluppare strategie alternative per aumentare la produzione di IFN-γ by cellule immunitarie. Sviluppo di nuovi farmaci biologici e piccole molecole richiede in strumenti di screening vivo per verificare se tali agenti aumentare la produzione di IFN-γ durante una risposta immunitaria e se questo si traduce in effetti biologici significativi come l&#39;aumento della sopravvivenza degli animali. Infezione sperimentale di topi con i gram-positivi batterio L. monocytogenes è stato un modello strumentale perdecifrare il ruolo di IFN-γ in host-immunità contro patogeni intracellulari 1,22. L&#39;infezione dei topi con l&#39;agente patogeno per via endovenosa o per via intraperitoneale (ip) porta alla rapida diffusione dei batteri alla milza e nel fegato, dove diventano internalizzati dai macrofagi residenti e epatociti con cariche batteriche picco nella milza che si verificano tra il 3 e 4 giorni post infezione 1,3,22. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK è importante per l&#39;attivazione dei macrofagi e la resistenza precoce contro l&#39;agente patogeno 3; tuttavia a dosi elevate infettive, la produzione di IFN-γ può anche essere dannoso alla clearance dei patogeni 23. Cellule NKT sono anche una fonte di IFN-γ nella milza e nel fegato durante il controllo precoce di agenti patogeni 2,24 e questa produzione è stato dimostrato per amplificare la produzione di IFN-γ da altri tipi di cellule, tra cui le cellule NK 2. D&#39;altra parte, in seguito ad azione adattativi linfociti T, cellule T CD8 + in partilare, sono importanti per mediare il gioco del patogeno e della protezione contro reinfezione 1,4,22. Questo modello di infezione è stato interessante per i ricercatori per una serie di ragioni (rivisto in 1). Innanzitutto, l&#39;infezione con il patogeno è altamente riproducibile e induce una forte Th1 e cellulare risposta immunitaria. In secondo luogo, durante l&#39;infezione subletali, carica batterica è concentrata nel fegato e nella milza dove può essere facilmente misurata. In terzo luogo, l&#39;agente patogeno può essere tranquillamente gestita sotto biosicurezza di livello 2 (BSL2) condizioni. In quarto luogo, l&#39;organismo e la risposta immunitaria che genera sono stati ampiamente caratterizzati. Infine, una varietà di ceppi mutanti e geneticamente modificati sono stati sviluppati che sono disponibili per l&#39;uso. Qui descritto è un protocollo di base per l&#39;inoculazione di C57BL 6J topi / con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 e per la misura di IFN - γ resposte da NK, NKT e linfociti adattivi post-infezione. Inoltre descritto è come misurare carica batterica nella milza e nel fegato dopo l&#39;infezione subletali e di effettuare studi di sopravvivenza dopo infezione con un modificata LD 50 dose del patogeno. Infine, dati rappresentativi sono mostrati di come questo protocollo può essere usata per selezionare l&#39;effetto di nuovi trattamenti sulle risposte IFN-gamma e la sopravvivenza mouse dalla L. monocytogenes infezione.

<table><tbody><tr><td>Brodo per infusione di cuore cerebrale,</td><td>BD</td><td>299070</td> modificato <td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio (NH3Cl)</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22400089</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>Prima dell'uso, inattivare a caldo a 56 gradi C per 30 min</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Penicillina / Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>GolgiStop Protein Transport Inhibitor (contenente Monensin)</td><td>BD</td><td>554724</td><td>Utilizzare 4 &mu; l in 6 ml di coltura cellulare</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehye</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 15710</td><td>Diluire al 4% di PFA in ddH2O o 1x PBS</td></tr><tr><td>10x tampone Perm/Wash</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Diluire 1x in ddH2O</td></tr><tr><td>blocco Fc, Anti-Topo CD16/CD32 Purificato</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Diluire 1:50</td></tr><tr><td>Colorante di vitalità riparabile eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>Diluire 1:1.000 (abbiamo utilizzato anche coloranti vitali di Molecular Probes)</td></tr><tr><td>anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>15-0041</td><td>Il produttore raccomanda una certa dimensione del test; tuttavia questa dovrebbe essere titolata prima dell'uso.</td></tr><tr><td>anti-Topo CD8-FITC (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081</td><td>Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.</td></tr><tr><td>PBS57/mCD1d tetramero-APC</td><td>NIH Tetramero Core Facility</td><td>N/A</td><td>Ottenuto in dono dalla struttura</td></tr><tr><td>anti-Mouse TCR&beta;-PE-Cy7 (H56-597)</td><td>eBioscience</td><td>25-5961</td><td>Il produttore raccomanda una certa dimensione del test; tuttavia questo deve essere titolato prima dell'uso.</td></tr><tr><td>anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td><td>eBioscience</td><td>47-3351</td><td>Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.</td></tr><tr><td>anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0451</td><td>Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.</td></tr><tr><td>anti-Topo IFN gamma-PE (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>12-7311</td><td>Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td>Utilizzare una goccia per colorante</td></tr><tr><td>Kit ELISA IFN gamma per topo</td><td>eBioscience</td><td>88-7314</td><td>Utilizzato per misurare l'interferone gamma nel surnatante di coltura</td></tr><tr><td>Provette ventilate da 50 ml per la coltura</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per la coltura dei batteri, qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr>Provette <td></td><td></td> per<td>microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr>piastre <td></td><td></td><td>di Petri batteriche</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr> 2 <tr><td>ml di cyrovials</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Spettrometro</td><td></td><td></td> UV <td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>aghi ingegnerizzati di sicurezza qualsiasi</td><td></td><td></td><td>marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson laboratories</td><td>Stock#000664</td><td>Ordina per arrivo a 7 settimane</td></tr><tr><td>Candeggina</td><td></td><td></td><td>Per la decontaminazione</td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td>Per la decontaminazione</td></tr><tr><td>Perle di</td><td></td><td></td> vetro <td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Rotore per centrifuga</td><td></td><td></td><td>, secchi, coperchi per secchi.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Glicerina</td><td></td><td></td> sterile <td>Qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Puntali per</td><td></td><td></td> pipette <td>Qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>70 micron filtri</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>siringa</td><td></td><td></td> da 3 ml <td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Pistola</td><td></td><td></td> per pipette <td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Unità</td><td></td><td></td> di filtrazione <td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td>Diluire da 1 a 9 in ddH2O, qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td></td><td></td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td>a fondo tondo</td><td>qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Tubi FAC</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD</td><td></td><td>Qualsiasi citometro a flusso potrebbe essere utilizzato per l'acquisizione che abbia una configurazione laser appropriata e un set di filtri per discriminare il fluorochormes</td></tr><tr><td>Flowjo software</td><td>Treestar</td><td></td><td>Utilizzato per l'analisi dei dati. Saranno appropriati anche altri tipi di software di analisi dei dati</td></tr><tr><td>Pipettatore multicanale (0 - 300 &micro; l)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Utilizzato per il lavaggio delle cellule e l'aggiunta di anticorpi durante la colorazione con citometria a flusso</td></tr><tr><td>Acido</td><td></td><td></td> acetico <td>Utilizzato per il lavaggio di perle di vetro, qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata</td></tr><tr><td>Sistema di conservazione batterica</td><td>Microbank Pro-lab Diagnostics</td><td></td><td>Utilizzato come alternativa alle scorte di glicerolo per la conservazione a lungo termine dei batteri</td></tr></tbody></table>

infezione sperimentale con<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; come modello per lo studio host interferone-gamma risposte

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes è un batterio gram-positivo che è una causa di origine alimentare malattie negli esseri umani. infezione sperimentale di topi con questo agente patogeno è stato molto istruttivo sul ruolo delle cellule immunitarie innate e adattative e citochine specifiche immunità dell&#39;ospite contro gli agenti patogeni intracellulari. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule innate durante l&#39;infezione subletale con L. monocytogenes è importante per l&#39;attivazione di macrofagi e il controllo precoce del patogeno 1-3. Inoltre, la produzione di IFN-γ da linfociti memoria adattativi è importante per l&#39;innesco l&#39;attivazione delle cellule innate upon reinfezione 4. La L. monocytogenes modello di infezione quindi serve come un ottimo strumento per indagare se le nuove terapie che sono progettati per aumentare la produzione di IFN-γ avere un impatto sulle risposte IFN-γ in vivo e hanno effetti biologici produttivi come l&#39;aumento gioco batterica o migliorare la sopravvivenza del mouse da parte diinfezione. Qui descritto è un protocollo di base per il modo di condurre le infezioni intraperitoneale di C57BL / 6J topi con il ceppo EGD di L. monocytogenes e per misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK, cellule NKT e linfociti adattivi mediante citometria di flusso. Inoltre, le procedure sono descritte a: (1) crescere e preparare i batteri per l&#39;inoculazione, (2) misurare carica batterica nella milza e nel fegato, e (3) la sopravvivenza misura animale endpoint. Dati rappresentativi sono inoltre forniti per illustrare come questo modello infezione può essere utilizzato per testare l&#39;effetto di agenti specifici sulle risposte IFN-y a L. monocytogenes e la sopravvivenza di topi da questa infezione.

La figura 3 presenta alcune tipico flusso citometria colorazione di IFN-γ in cellule NK e NKT milza a dopo l&#39;infezione 24 ore con 10 CFU 5 del patogeno. Questa figura illustra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritto nella Tabella 2. La figura 4 mostra alcuni dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati con la IS001 o il veicolo di control...

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l&#39;interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l&#39;infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l&#39;infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono coltivare e infettare topi C57 blacksix con il ceppo EGG di *Listeria monocytogenes* e misurare il carico batterico, le risposte di interferone gamma e la sopravvivenza e risposta all'infezione da questo patogeno. Questo protocollo può aiutare i ricercatori a identificare agenti o geni che influenzano le risposte di interferone gamma e la sopravvivenza degli animali dopo un'infezione batterica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è relativamente semplice da allestire in laboratorio.Anche per chi ha poca esperienza nella coltivazione di batteri. La procedura sarà inoltre dimostrata da Jennifer Ahn, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare immergendo la punta sterile di una pipetta in una provetta di glicerolo stock della ceppo L monocytogenes EGG scongelata a temperatura ambiente.E immediatamente effettuare uno strofinaccio avanti e indietro con la punta su una sezione di una piastra di infusione cerebrale e cardiaca o piastra BHI. Questo è lo strofinaccio primario. Ruotare la piastra di 90 gradi e trascinare una nuova punta di pipetta attraverso il primo strofinaccio, distribuendo il ceppo sul quarto successivo della piastra.Questa è la seconda striscia. Successivamente, ruotare e distribuire la seconda striscia in un terzo quarto della piastra per creare la terza striscia. Ora, capovolgere la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Dovrebbero essere visibili colonie singole e uniformi nell'ultima serie di striature tra le 16 e le 24 ore. Quando le colonie compaiono, dispensare 10 millilitri di brodo BHI sterile in un tubo sterile da 50 millilitri con tappo areato e utilizzare una punta di pipetta sterile per trasferire una colonia di L. monocytogenes dalla piastra nel brodo. Coltivare il brodo inoculato durante la notte in un incubatore con agitazione orbitale a 37 gradi Celsius e 225 rotazioni al minuto, fino a quando l'OD600 raggiunge il valore di uno.Per la preparazione del ceppo sperimentale di L. monocytogenes da inoculare, all'interno di una cappa a sicurezza biologica, inoculare un tubo di terreno BHI con 100 microlitri della coltura ottenuta nell'incubazione notturna. Dopo un ulteriore periodo di incubazione a 37 gradi Celsius, sotto agitazione, fino al raggiungimento dell'OD600 desiderato, trasferire il contenuto della coltura in un tubo da centrifuga sterile per la centrifugazione. Aspirare quindi il sopranatante utilizzando un vuoto collegato a un matraccio trappola contenente candeggina.Lavare il pellet due volte con PBS nelle stesse condizioni di centrifugazione. Dopo il secondo lavaggio, risospendere i batteri in PBS e diluire alla concentrazione appropriata. Per somministrare le UFC di interesse a ciascun topo in un volume di 200 microlitri.Successivamente, mescolare accuratamente la sospensione con una punta pipetta sterile per assicurare che i batteri siano distribuiti in modo omogeneo. Poi aspirare 200 microlitri di inocolo in una siringa da un millilitro con sistema di sicurezza, munita di ago da 25 gauge. A questo punto, afferrare un topo con la mano meno dominante per la pelle molle intorno alle spalle.E iniettare tutti i 200 microlitri dell'inoculo nel quadrante inferiore dell'addome, appena laterale rispetto alla linea mediana per evitare la vescica, utilizzando un ago e una siringa nuovi per ogni animale. Per misurare il carico batterico massimo dell'infezione, al terzo giorno post infezione, immobilizzare gli arti di un animale sperimentale in posizione supina su un tavolo da dissezione. E disinfettare la cute con etanolo al 70 percento.Utilizzando forbici sterili resistenti per tagli profondi, effettuare un'incisione dal torace all'inguine. Successivamente, praticare un'incisione dalla parte centrale dell'inguine verso ciascun ginocchio e dalla parte centrale del torace verso ciascun gomito. Separare con movimento ottuso, dissezionare e riflettere all'indietro la pelle, fissandola aperta con aghi da 25 gauge.Disinfettare lo strato muscolare con ulteriore etanolo al 70 percento. Quindi, utilizzando forbici fini sterili, praticare un'incisione mediana nella parete peritoneale. Utilizzare una pinza per afferrare il processo xifoideo.Eseguire incisioni nella parete peritoneale a partire dal processo xifoideo, proseguendo lateralmente su ciascun lato. Seguire la gabbia toracica fino appena al di sotto del diaframma. Ciò renderà visibile il fegato.Successivamente, utilizzare forbici sterili per tagliare un pezzo di circa 100 milligrammi da un lobo. Posizionare il tessuto in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri prepesata contenente da 0,2 a 0,3 grammi di perle di vetro sterili lavate con acido di diametro compreso tra 1,5 e 2 millimetri. Utilizzare la pinzetta per spostare delicatamente gli organi sul lato sinistro della cavità peritoneale al fine di visualizzare la milza.Utilizzare la pinzetta per afferrare delicatamente la milza, recidendo il tessuto connettivo circostante per liberare l'organo dalla cavità peritoneale. Collocare la milza in un tubo diverso rispetto al fegato e trasferire i tessuti in laboratorio in un contenitore a prova di perdite contenente ghiaccio. Agitare i tubi utilizzando un omogeneizzatore a sfera per tre minuti a una frequenza di 30 hertz.Successivamente, preparare una serie di diluizioni decrescenti dei campioni omogeneizzati in PBS contenente il 0,1 percento di triton X-100. Poi, utilizzare un’ansa sterile per distribuire 100 microlitri di ciascun omogeneato diluito su una piastra di agar BHI. Infine, trasferire le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius per un’incubazione notturna.Mantenere le piastre che contengono fino a 300 colonie per piastra. Contare le colonie su ciascuna piastra. Per misurare il CD4 nelle risposte di interferone gamma delle cellule T CT8, isolare le milze da topi infettati con due decimi alla quarta UFC del patogeno come appena dimostrato.Processare le milze in una sospensione monocellulare di globuli rossi. Risospendere il pellet a una concentrazione di quattro per dieci alla sesta cellule per millilitro in mezzo RPMI completo contenente FCS. Successivamente, seminare un millilitro di cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti con un volume uguale di L. monocytogenes scongelato e inattivato termicamente, e collocare le colture fredde in un incubatore a 37 gradi Celsius.Dopo 20 ore, aggiungere 0,66 microlitri per millilitro di inibitore del trasporto proteico nei pozzetti. Quindi reinserire la piastra nell'incubatore. Dopo quattro ore, all'interno di una cappa a sicurezza biologica, raccogliere 500 microlitri di sopranatante di coltura e congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius per la successiva misurazione dell'interferone gamma mediante ELISA.Quindi trasferire le cellule in un singolo tubo sterile da 15 millilitri, lavando le pozzette con PBS ed aggiungendo il lavaggio alle cellule raccolte per la colorazione e l'analisi mediante citometria a flusso. Il picco del carico batterico si verifica nella milza due o tre giorni dopo l'infezione ed è ridotto in modo significativo dall'aggiunta di un antagonista del PPAR Alpha prima dell'infezione.A sette giorni dall'infezione, la risottimolazione *ex vivo* delle cellule T spleniche CD4 positive e CD8 positive con l'agente patogeno ucciso dal calore induce una risposta positiva all'interferone gamma da parte delle cellule CD4 positive e CD8 positive, come rilevato mediante citometria a flusso. Il trattamento con l'antagonista della PPAR alpha prima dell'infezione potenzia le risposte all'interferone gamma da parte delle cellule CD4 e CD8. Inoltre, il trattamento con l'antagonista della PPAR alpha aumenta la sopravvivenza dopo l'infezione con la dose LD50 dell'agente patogeno, dimostrando l'utilità di questo modello per studiare l'impatto di nuovi farmaci che modulano le risposte all'interferone gamma sulla sopravvivenza animale in seguito a infezione.Una volta padroneggiate, tutte le procedure descritte in questo protocollo possono generare i dati desiderati nell'arco di alcune settimane, se eseguite correttamente. La tecnica può essere ulteriormente adattata infettando i topi con ceppi di Listeria monocytogenes che esprimono antigeni modello e utilizzando agenti tetramerici specifici per le classi MAC I e II specifici per questi antigeni. Ciò consentirà di misurare l'espansione delle cellule T dopo l'infezione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica è diventata un modello fondamentale per decifrare il ruolo dell'interferone gamma nell'immunità dell'ospite contro i patogeni intracellulari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare e infettare topi C57 blacksix con listeria monocytogenes e di come misurare il carico batterico e le risposte di interferone gamma all'infezione.Non dimenticare che lavorare con Listeria monocytogenes può essere pericoloso per individui immunocompromessi, come donne in gravidanza, bambini molto piccoli o anziani. Pertanto, il patogeno dovrebbe essere manipolato esclusivamente da individui immunocompetenti in condizioni di sicurezza biologica di livello due.

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Listeria monocytogenes è un organismo modello per studiare le risposte immunitarie e la suscettibilità genetica a batteri intracellulari nei topi. Questo metodo permette di misurare la carica batterica e di generare monocellulari sospensioni del fegato e della milza di topi per l'analisi FACS per determinare cambiamenti nelle cellule del sistema immunitario dovuta a infezione da Listeria.

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Modellazione dell'infezione nei topi neonatali utilizzando batteri bioluminescenti incapsulati

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Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Questo video mostra un metodo di imaging per visualizzare la secrezione di interferone-gamma in situ (IFN-γ) nella milza del topo. In seguito all'infezione batterica e all'induzione dell'accumulo di IFN-γ all'interno delle cellule T e delle cellule natural killer, la milza viene prelevata dal topo. Dopo aver ottenuto sezioni di tessuto, viene eseguita l'immunocolorazione per visualizzare l'IFN-γ all'interno delle cellule.

Saggio per l'identificazione della secrezione di interferone-gamma negli organi linfoidi murini

Questo video dimostra la quantificazione della carica batterica infettiva dal cervello di topo perfuso infettato da Listeria monocytogenes.

Valutazione della colonizzazione batterica in un cervello di topo a seguito di infezione da Listeria monocytogenes

Questo documento descrive un nuovo metodo per l'infezione orale di topi...

Trasmissione orale di<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Nei topi tramite ingestione di alimenti contaminati

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Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

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Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging confocale per visualizzare la localizzazione in situ delle cellule che secernono la gamma di interferone citochina negli organi linfoidi secondari murini. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di altre citochine in tessuti diversi.

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