Metodi per l'isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i miociti dei linfonodi senoatriali spontaneamente attivi dai topi per esperimenti elettrofisiologici o di imaging a breve o medio termine. I miociti isolati dei nodi senoatriali sono importanti per lo studio dei meccanismi di pacemaking cardiaco, in particolare lo studio delle correnti ioniche specifiche o dei tempi di rilascio intracellulare del calcio. Ma relativamente pochi laboratori utilizzano miociti senoatriali isolati dai topi, in parte perché è molto difficile apprendere la procedura solo con metodi scritti.

Dopo aver preparato tutte le soluzioni necessarie per l'isolamento, rimuovere il pelo dal petto dell'animale con le forbici. Quindi sezionare la gabbia toracica per esporre la cavità toracica utilizzando una pinza per tessuti esterni e forbici da dissezione. Sciacquare la cavità toracica con due millilitri di Tyrode completo riscaldato con eparina.

Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con cura i polmoni e il timo utilizzando forbici interne e pinze da dissezione. Tenendo delicatamente l'apice del cuore, tagliare con cura la vena cava inferiore e l'aorta per rimuovere il cuore dalla cavità toracica. Quindi trasferire il cuore in una delle piastre di dissezione in silicone e poi sciacquarlo con due o quattro millilitri di Tyrode completo eparinizzato riscaldato.

Orientare il cuore in modo che i vasi posteriori siano visibili e rivolti verso l'alto. Quindi, immobilizza il cuore fissandolo attraverso l'apice nel piatto di dissezione in silicone. Successivamente, individua il solco tra i ventricoli e gli atri.

Usando le forbici da dissezione interna, praticare un'incisione in corrispondenza del solco tenendolo vicino ai ventricoli. Lavare il solco e l'incisione con ulteriori Tyrode completi eparinizzati riscaldati, se necessario, per consentire una visione chiara degli atri e delle valvole. Quindi continuare a tagliare lungo il solco per separare gli atri dai ventricoli.

Successivamente, trasferire il tessuto atriale nella seconda capsula di dissezione in silicone e sciacquarlo con tre millilitri di Tyrode completo eparinizzato riscaldato. Successivamente, mentre si allunga delicatamente la preparazione, fissare il tessuto attraverso la vena cava inferiore. Quindi capovolgere il tessuto in modo che l'atrio destro dell'animale sia ora sul lato sinistro dello sperimentatore e l'atrio sinistro sia sul lato destro dello sperimentatore.

È molto importante ottenere e riconoscere l'orientamento per isolare il tessuto corretto. Procedere a fissare il tessuto attraverso la vena cava superiore, quindi le appendici atriali destra e sinistra. Rimuovere il grasso residuo o altri tessuti per consentire una visione chiara della preparazione.

Successivamente, aprire la parete anteriore degli atri tagliando le vene cave. Ruotare il piatto secondo necessità per sezionare sia le vene cave superiori che quelle inferiori. Riposizionare i perni secondo necessità per visualizzare il setto interatriale.

Quindi tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l'atrio sinistro. Riappuntare il preparato, stenderlo delicatamente e rimuovere il grasso da dietro il nodo senoatriale. Successivamente, rimuovere l'appendice atriale destra, quindi liberare il nodo seno-atriale tagliando lungo la crista terminalis che appare come una striscia arancione scuro che delimita l'appendice atriale.

Riappuntare o sbloccare il tessuto nodale e tagliarlo lateralmente per produrre tre strisce di uguali dimensioni. In questa procedura, utilizzando la pipetta stretta lucidata a fuoco, trasferire tre strisce di tessuto linfonodale senoatriale nella prima delle tre piccole provette a fondo rotondo contenenti 2,5 millilitri di Tyrode di magnesio a basso contenuto di calcio e incubare per cinque minuti. Dopo cinque minuti, trasferire le strisce di tessuto nella seconda piccola provetta rotonda contenente 2,5 millilitri di Tyrode di magnesio a basso contenuto di calcio.

Lavare le strisce di tessuto facendo roteare delicatamente la provetta o pipettando delicatamente con la pipetta stretta. Non capovolgere il tubo. Quindi trasferire le strisce di tessuto nel terzo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 millilitri di Tyrode a basso contenuto di magnesio e ripetere la fase di lavaggio.

Successivamente, trasferisci le strisce nel grande tubo a fondo rotondo contenente 2,5 millilitri di Tyrode a basso contenuto di magnesio con enzimi. Mescolare ogni cinque minuti facendo roteare delicatamente il tubo. Dopo la digestione enzimatica, utilizzare una pipetta stretta lucidata a fuoco per trasferire delicatamente le strisce di tessuto nella prima delle tre piccole provette a fondo rotondo contenenti la soluzione KB modificata.

Quindi trasferire le strisce attraverso il secondo e il terzo tubo a fondo tondo piccolo per lavare il fazzoletto prima di trasferirlo nel tubo a fondo tondo grande che contiene la soluzione KB. Utilizzando la pipetta più grande lucidata a fuoco, dissociare le cellule nel grande tubo a fondo tondo mediante triturazione costante, avendo cura di mantenere il tubo di dissociazione immerso nel bagno d'acqua a 35 gradi Celsius e di evitare l'introduzione di bolle nella soluzione. Abbiamo scoperto che un'espulsione forzata della soluzione a una frequenza di circa uno al secondo o un Hertz funziona meglio.

Ora aggiungi 75 microlitri di soluzione di adattamento del cloruro di sodio e del cloruro di calcio ai tessuti. Agitare delicatamente per mescolarli e incubarli per cinque minuti. Continuare ad aggiungere calcio in incrementi come indicato nel protocollo scritto.

Dopo il riadattamento del calcio, raccogliere i miociti seno-atriali lasciandoli riposare per circa 10 minuti o mediante centrifugazione a 2.000 volte g per tre minuti. Per le cellule isolate in modo acuto, rimuovere delicatamente ed eliminare circa cinque millilitri di surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento. Quindi conservare le cellule a temperatura ambiente per un massimo di otto ore per gli esperimenti con patch clamp.

Successivamente, le valutazioni funzionali dei miociti senoatriali isolati possono essere effettuate utilizzando registrazioni patch clamp per potenziali d'azione spontanei e correnti di membrana. I miociti senoatriali spontaneamente attivi possono essere mantenuti in coltura per un massimo di sei giorni. Le cellule in coltura conservano una morfologia complessiva molto simile a quella dei miociti seno-atriali isolati acutamente, senza cambiamenti significativi nella lunghezza media, nella larghezza, nell'area della sezione trasversale o nella capacità di membrana delle cellule in coltura rispetto alle cellule isolate in modo acuto.

Le celle sono adatte per una serie di studi sperimentali, come le registrazioni di corrente e voltage clamp. Vengono mostrati qui come esempi i potenziali d'azione spontanei e la corrente divertente. Una volta padroneggiati, la dissezione del nodo senoatriale, l'isolamento e la reintroduzione del calcio possono essere completati in circa due ore in modo da poter avere cellule pronte per i tuoi esperimenti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'orientamento del tessuto è fondamentale per una buona dissezione e che le fasi di dissociazione enzimatica e meccanica devono essere ottimizzate come descritto nel testo. Seguendo questa procedura, i miociti isolati dei linfonodi seno-atriali possono essere utilizzati per una varietà di esperimenti, tra cui l'elettrofisiologia a singola cellula, l'imaging del calcio e l'immunocitochimica. Le cellule possono anche essere mantenute in coltura per esperimenti che richiedono la manipolazione genica o l'espressione di molecole reporter.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i miociti senoatriali dai topi adulti. In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.