Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di consentire l'esecuzione di esperimenti di salvataggio per deplezione in condizioni che preservino l'integrità cellulare e l'omeostasi delle proteine. Per analisi funzionali di processi biologici a livello di singola cellula. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti le funzioni delle proteine e i requisiti strutturali nella dinamica cellulare, come la mitosi e la differenziazione cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di esaurire una proteina di interesse e reintrodurre allo stesso tempo una variante di questa proteina a livello neofisiologico in una misura di una popolazione cellulare. Inizia rivestendo i piatti con fondo di vetro con fribronectina. Per fare ciò, diluire un stock di firbronectina da un milligrammo per millilitro da uno a 100 con PBS sterile.

Aggiungere un millilitro a ogni piatto da 35 millilitri per coprire tutta la superficie. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Durante l'incubazione, l'alfa MEM pre-caldo è stato integrato con il 10% di FBS e un'aliquota di 0,05% di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius.

Dopo 45 minuti di incubazione, iniziare a preparare la soluzione cellulare. Aspirare il terreno da una piastra di 10 centimetri di celle HeLa RFP H2B. E risciacquare delicatamente due volte con 1,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05%.

Lasciare 0,5 millilitri di tripsina EDTA sulla piastra dopo l'ultima aspirazione. E incubare le cellule per due o tre minuti a 37 gradi Celsius. E il 5% di anidride carbonica.

Picchiettare delicatamente la piastra. E osserva lo strato cellulare al microscopio per verificare che tutte le cellule siano state staccate. Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno e pipettare delicatamente più volte per separare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Contare un campione da 10 microlitri della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro. Quindi, aspirare la soluzione di fibronectina dalle stoviglie con fondo in vetro. Non lasciare asciugare la fibronectina prima della placcatura cellulare.

Preparare una soluzione di sospensione cellulare per piastra da 1,5 volte dieci a quinta cella per piatto da 35 millimetri in due millilitri di terreno. Piastra una piastra da 35 millimetri in aggiunta al numero di condizioni per contare il numero di cellule prima della trasduzione del virus. Incubare per 30-45 minuti.

Trascorso il tempo di incubazione, controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule siano ben separate. Come si vede qui. Rimetti le piastre nell'incubatrice e fai crescere le cellule fino al giorno successivo.

Il giorno dopo la piastratura, assicurarsi che le cellule abbiano raggiunto la densità di almeno il 50%Una densità cellulare inferiore al 50% comporta una diminuzione dell'efficienza di trasduzione del virus. Aumento della variazione dell'espressione proteica per cellula e aumento della tossicità cellulare. Quindi raccogliere le cellule dal piatto piatto aggiuntivo come prima.

E conta il numero di celle. Calcolare il volume di virus necessario per un'efficiente trasduzione delle cellule. Etichettare una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni condizione.

E aggiungi 400 microlitri di alfa MEM caldo meno. Dopo aver scongelato lentamente le aliquote dei virus con ghiaccio, aggiungere il volume richiesto di ciascun virus alle provette e mescolare delicatamente pipettando. Successivamente, dopo aver aspirato il terreno dalle cellule, aggiungere delicatamente la miscela virale goccia a goccia.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Ogni 15 minuti per un periodo di un'ora, agitare accuratamente le piastre sotto la cappa sterile per coprire le cellule con il virus. L'uso di una piccola quantità di terreno facilita il contatto del virus con le cellule.

Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente 1,6 millilitri di alfa MEM meno su ciascuna piastra per ottenere un volume totale di due millilitri. Quindi avviare la sincronizzazione cellulare aggiungendo due millimolari di timidina prima di incubare le cellule per altre due ore. Nel frattempo, preparare la miscela di trasfezione siRNA aggiungendo in una microprovetta 139 microlitri di acqua sterile, 50 microlitri di cloruro di calcio molare e 11 microlitri di siRNA 20 micromolari.

Se non è necessario alcun siRNA, sostituire la quantità di siRNA con acqua sterile per eseguire una trasfezione a vuoto. Aggiungere lentamente la soluzione di HBSS2X, goccia a goccia, alla miscela di siRNA di cloruro di calcio. Miscelare delicatamente due volte mediante iniezione d'aria utilizzando una pipetta da 200 microlitri.

Poiché i precipitati più piccoli si traducono in una migliore efficienza di trasfezione. Quindi incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere lentamente 200 microlitri goccia a goccia su ciascuna piastra e agitare per mescolare.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 16 ore. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dall'incubatore e trasportarle in una cappa di coltura tissutale. Dopo aver sciacquato le cellule due volte con due millilitri di hipis caldo, aggiungere due millilitri di alfa MEM meno prima di rimetterle nell'incubatore.

Sette ore dopo, aggiungere due millimolari di timidina alle piastre prima di rimetterle nell'incubatrice. Lavora con non più di quattro piastre cellulari alla volta poiché le variazioni di temperatura influiscono sulla durata del ciclo cellulare. Il giorno seguente, 48 ore dopo la trasfezione del siRNA e l'infezione virale, sciacquare le cellule due volte con due millilitri di PBS caldo, quindi aggiungere due millilitri di alfa MEM senza rosso fenolo per l'imaging di cellule vive.

Incubare per sette ore. Esecuzione di esperimenti di imaging di cellule vive a breve termine su cellule mitotiche con un microscopio invertito dotato di una camera termoregolata umidificata al 5% di anidride carbonica. Prima dell'acquisto, verificare che la camera abbia raggiunto la temperatura appropriata di 37 gradi Celsius.

Posizionare le piastre coltivate nella camera del microscopio un'ora prima dell'acquisizione per consentire un corretto equilibrio del mezzo ed evitare la deriva della messa a fuoco dovuta alle variazioni di temperatura. Esaminare lo stato mitotico delle cellule. A questo punto.

Dal 10 al 15% delle cellule dovrebbe essere nelle prime fasi della mitosi. Durante il tempo di equilibrio, impostare i parametri di acquisizione come determinato negli esperimenti precedenti. È importante ottenere una risoluzione adeguata senza sbiancamento delle foto.

Poiché ciò provoca danni cellulari e perturba la progressione mitotica. Scegliere diversi campi contenenti le celle che si trovano all'ingresso mitotico per condizione per ottenere un numero significativo di cellule da analizzare senza superare l'intervallo di acquisizione. Una volta scelti tutti i campi, reimposta il focus e avvia l'acquisizione il più velocemente possibile.

L'uso di un disco rotante può mettere a fuoco il sistema. Una configurazione tipica includerebbe quattro diverse condizioni. Sette campi per piastra.

E due canali di colore con un intervallo da 1,5 a due minuti su un periodo di 75 minuti. Determinare criteri ben definiti per analizzare i fenotipi mitotici nelle cellule, che dipenderanno dai marcatori fluorescenti utilizzati. A differenza della trasfezione di BAG3 GFP, DNA plasmatico, come si vede a sinistra, l'adenofezione con adenovirus recompetenti mostrata qui a destra consente un'espressione più omogenea ed efficiente di BAG3 GFP.

Nella maggior parte della popolazione cellulare a bassa molteplicità di infezione. Questo western blot rappresentativo mostra che l'adenofenzione con siRNA specifici per BAG3 e con l'adenovirus ricompotente BAG3 GFP consente un'efficiente deplezione di BAG3 endogeno e la reintroduzione della proteina BAG3 GFP a livelli quasi endogeni. Come mostrato qui, l'adenofezione può preservare l'omeostasi proteica poiché non vi è alcun aumento rilevabile dei livelli delle proteine da shock termico indotte dallo stress nelle cellule HeLa che sono state adenofettate.

A differenza delle cellule HeLa trattate con l'induttore di stress proteotossico, MG132. Qui vediamo che la progressione delle cellule attraverso la mitosi non è significativamente perturbata dall'adenofezione, come mostrato da queste immagini confocali in time lapse da cellule HeLa adenofectate con siRNA di controllo e BacMam GFP alfa tubulina. e BacMam FRP actina.

Il grafico indica la proporzione di cellule con mitosi anomala. Le cellule adenoficate con il solo siRNA specifico BAG3 hanno mostrato un aumento di circa due volte del livello di difetti mitotici. Come raffigurato dalla barra rossa.

Che è stato ripristinato vicino al livello della cella di controllo dalla reintroduzione di BAG3 GFP mostrato dalla barra nera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di salvataggio per esaurimento utilizzando l'adenofezione. Questo metodo fornisce un sistema rapido e semplice per creare knock down ipomorfici per l'analisi della funzione strutturale in più sfondi cellulari.

Seguendo questo metodo, è possibile identificare i requisiti strutturali chiave sulla proteina di interesse per una data funzione. Altri approcci di editing del genoma possono quindi essere utilizzati per approfondire le meccaniche coinvolte.