Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

L'obiettivo generale di questo metodo è consentire la realizzazione di esperimenti di recupero dopo deplezione in condizioni che preservino l'integrità cellulare e l'omeostasi proteica, per analisi funzionali di processi biologici a livello di singola cellula.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo le funzioni proteiche e i requisiti strutturali nella dinamica cellulare, come la mitosi e la differenziazione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nell'eliminare una proteina di interesse e nel reintrodurre contemporaneamente una variante di tale proteina a un livello prossimo a quello fisiologico nella maggior parte delle cellule di una popolazione.

Iniziare rivestendo le piastre con fondo in vetro con fibronectina. Per fare ciò, diluire un campione stock di fibronectina da un milligrammo per millilitro di un rapporto di uno a 100 con PBS sterile.

Aggiungere un millilitro in ogni piastra da 35 millilitri per coprire l'intera superficie. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Durante l'incubazione, preriscaldare l'alpha MEM integrato con il 10% di FBS e un'aliquote di tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius.

Dopo 45 minuti di incubazione, iniziare a preparare la soluzione cellulare. Aspirare il mezzo da una piastra da 10 centimetri di cellule HeLa-RFP-H2B e risciacquare delicatamente due volte con 1,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05%.

Lasciare 0,5 millilitri di tripsina EDTA sulla piastra dopo l'ultima aspirazione e incubare le cellule per due o tre minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Battere leggermente sulla piastra e osservare il livello cellulare al microscopio per verificare che tutte le cellule siano state distaccate. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo e pipettare delicatamente più volte per separare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri.

Contare un campione di 10 microlitri della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro. Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina dalle piastre con fondo in vetro. Non permettere alla fibronectina di asciugarsi prima della semina delle cellule.

Preparare una sospensione cellulare per seminare 1,5 × 10⁵ cellule per piatto da 35 millimetri in due millilitri di mezzo. Seminare un piatto aggiuntivo da 35 millimetri rispetto al numero delle condizioni, al fine di contare il numero di cellule prima della trasduzione virale. Incubare per 30-45 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, verificare le cellule al microscopio per assicurarsi che siano ben separate, come mostrato qui. Rimettere i piatti nell'incubatore e coltivare le cellule fino al giorno successivo.

Il giorno successivo alla semina, assicurarsi che le cellule abbiano raggiunto una densità di almeno il 50%. Una densità cellulare inferiore al 50% determina una ridotta efficienza di trasduzione virale, un aumento della variabilità dell'espressione proteica per cellula e un incremento della tossicità cellulare. Successivamente, raccogliere le cellule dalla piastra aggiuntiva come in precedenza e contare il numero di cellule. Calcolare il volume di virus necessario per una trasduzione efficiente delle cellule. Etichettare un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro per ogni condizione e aggiungere 400 microlitri di alpha MEM privo di siero, mantenuto caldo. Dopo aver scongelato lentamente le aliquote di virus su ghiaccio, aggiungere il volume richiesto di ciascun virus ai tubi e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Successivamente, dopo aver aspirato il mezzo dalle cellule, aggiungere delicatamente la miscela virale goccia a goccia. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Ogni 15 minuti per un'ora, agitare delicatamente le piastre all'interno della cappa sterile per garantire un contatto uniforme tra il virus e le cellule. L'uso di una piccola quantità di mezzo favorisce il contatto tra il virus e le cellule.

Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente 1,6 millilitri di alpha MEM privo in ogni piastra per ottenere un volume totale di due millilitri. Quindi avviare la sincronizzazione cellulare aggiungendo timidina 2 millimolare prima di incubare le cellule per ulteriori due ore.

Nel frattempo, preparare la miscela di transfezione con siRNA aggiungendo in un microtubo 139 microlitri di acqua sterile, 50 microlitri di cloruro di calcio uno molare e 11 microlitri di siRNA venti micromolare. Se non è necessario alcun siRNA, sostituire la quantità di siRNA con acqua sterile per eseguire una transfezione vuota. Aggiungere lentamente, goccia a goccia, la soluzione HBSS-2X sulla miscela di cloruro di calcio e siRNA. Mescolare delicatamente due volte per iniezione d'aria utilizzando una pipetta da 200 microlitri, poiché precipitati più piccoli determinano una maggiore efficienza di transfezione. Incubare quindi la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere lentamente 200 microlitri goccia a goccia in ogni piastra e agitare per mescolare. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 16 ore.

Il giorno successivo, rimuovere le piastre dall'incubatrice e trasportarle in una cappa a flusso laminare per colture cellulari. Dopo aver lavato le cellule due volte con due millilitri di HEPES tiepido, aggiungere due millilitri di alpha MEM privo di siero prima di reinserire le piastre nell'incubatrice.

Sette ore più tardi, aggiungere timidina 2 millimolare alle piastre prima di riposizionarle nell'incubatrice. Lavorare con non più di quattro piastre cellulari alla volta, poiché le variazioni di temperatura influiscono sulla durata del ciclo cellulare. Il giorno seguente, 48 ore dopo la trasfezione con siRNA e l'infezione virale, risciacquare le cellule due volte con due millilitri di PBS caldo, quindi aggiungere due millilitri di MEM alfa senza rosso fenolo per l'acquisizione di immagini su cellule vive. Incubare per sette ore.

Eseguire esperimenti di imaging cellulare vitale a breve termine su cellule mitotiche mediante un microscopio invertito dotato di una camera umidificata regolata termicamente con anidride carbonica al 5%. Prima dell'acquisizione, verificare che la camera abbia raggiunto la temperatura appropriata di 37 gradi Celsius.

Posizionare le piastre di coltura nella camera del microscopio un'ora prima dell'acquisizione per consentire un adeguato equilibrio del mezzo ed evitare spostamenti del fuoco dovuti a variazioni di temperatura. Esaminare lo stato mitotico delle cellule. A questo punto, dal 10 al 15% delle cellule dovrebbe trovarsi nelle fasi iniziali della mitosi.

Durante il tempo di equilibrazione, impostare i parametri di acquisizione determinati in esperimenti precedenti. È importante ottenere una risoluzione adeguata senza causare fotoblescimento, poiché ciò provoca danni cellulari e altera il decorso mitotico. Selezionare diversi campi contenenti cellule in ingresso mitotico per ogni condizione, in modo da ottenere un numero significativo di cellule da analizzare senza superare l'intervallo di acquisizione. Una volta scelti tutti i campi, ripristinare il fuoco e avviare l'acquisizione il più rapidamente possibile.

Utilizzando un sistema confocale a disco rotante, un'impostazione tipica includerebbe quattro condizioni diverse, sette campi per piastra e due canali di colore con un intervallo da 1,5 a due minuti su un periodo di 75 minuti. Stabilire criteri ben definiti per analizzare i fenotipi mitotici nelle cellule, i quali dipenderanno dai marcatori fluorescenti utilizzati.

A differenza della trasfezione di BAG3-GFP, il DNA plasmidico, come mostrato a sinistra, l'adenofezione con adenovirus ricombinanti, mostrata qui a destra, consente un'espressione più omogenea ed efficiente di BAG3-GFP nella maggior parte della popolazione cellulare a bassa multiplicità di infezione. Questo rappresentativo immunoblot mostra che l'adenofezione con siRNA specifici per BAG3 e l'adenovirus ricombinante BAG3-GFP permette un efficiente esaurimento del BAG3 endogeno e la reintroduzione della proteina BAG3-GFP a livelli quasi endogeni. Come mostrato qui, l'adenofezione può preservare l'omeostasi proteica poiché non si osserva un aumento rilevabile dei livelli delle proteine da shock termico indotte da stress in cellule HeLa sottoposte ad adenofezione, a differenza delle cellule HeLa trattate con l'induttore di stress proteotossico MG132. Qui osserviamo che il progresso delle cellule attraverso la mitosi non è significativamente alterato dall'adenofezione, come mostrato da queste immagini al microscopio confocale a intervalli di tempo da cellule HeLa sottoposte ad adenofezione con siRNA di controllo e BacMam-GFP alfa Tubulina, e BacMam-RFP Actina.

Il grafico indica la proporzione di cellule con mitosi anomala. Le cellule adenofettate solo con siRNA specifico per BAG3 hanno mostrato un aumento di circa due volte del livello di difetti mitotici, come rappresentato dalla barra rossa, che è stato ripristinato a livelli vicini a quelli delle cellule di controllo mediante la re-introduzione di BAG3-GFP, indicata dalla barra nera.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di recupero mediante deplezione utilizzando l'adenofezione. Questo metodo fornisce un sistema rapido e semplice per creare silenziamenti ipomorfi finalizzati all'analisi struttura-funzione in diversi contesti cellulari. Applicando questo approccio, è possibile identificare i requisiti strutturali fondamentali della proteina di interesse per una determinata funzione. Altri metodi di editing del genoma possono quindi essere utilizzati per approfondire i meccanismi coinvolti.