Name: Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Scopri l'adenofezione per esperimenti depletion-rescue che preservano l'integrità cellulare e l'omeostasi proteica. Questo metodo consente analisi funzionali di proteine coinvolte in mitosi e miogenesi a livello di singola cellula.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), dalla Fondazione Bellini e dalla Fondazione Roby.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto un metodo che consenta esperimenti svuotamento soccorso da eseguire, che è applicabile ad analisi funzionali dei processi cellulari biologici che sono particolarmente sensibili alla sovraespressione di proteine ​​che interessano la stechiometria e la dinamica di complessi proteici e strutture macromolecolari. la divisione cellulare mitotico è un esempio estremo di morfodinamica cellulari finemente sintonizzato che coinvolge i cambiamenti più drammatici e spettacolari nella struttura generale di un...

inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammifero è il gold standard per sezionare le funzioni delle proteine. Tecnologie di editing del genoma basata sull&#39;uso di nucleasi specifiche del sito, come nucleasi zinc-finger di nuova concezione e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CAS9 ora permettono la generazione di linee cellulari con mirata delezione del gene e la mutazione 1,2. Questi nuovi approcci dovrebbero rivoluzionare il modo in cui stiamo studiando la funzione delle proteine ​​e la nostra comprensione della genetica delle malattie umane. In alcuni casi, tuttavia, a lungo termine o completa knockout gene non è auspicabile e possono provocare meccanismi di compensazione cellule secondarie. La generazione di linee cellulari geneticamente modificati può anche essere limitante quando si tratta di colture cellulari primarie con capacità proliferativa limitata, o quando è richiesta proiezione di un grande insieme di mutazioni in vari tipi cellulari. Questo è spesso necessario per determinare la dipendenza di una cella bprocesso iological sui requisiti strutturali di una proteina. A tal fine, atterramento reversibile da RNA interference che consente esperimenti di deplezione-salvataggio transitori in vari ambiti di cellulari rimane ancora un approccio semplice e potente per eseguire le analisi struttura-funzione di una proteina di interesse 3. Tuttavia, un grave inconveniente di questo approccio è la difficoltà di raggiungere silenziamento efficiente e reintrodurre la proteina di interesse o sue varianti a livelli fisiologici vicino nella maggior parte della popolazione cellulare. Ciò è essenziale per consentire studi approfonditi che tentano di correlare effetti funzionali osservati a livello delle singole cellule (fenotipo hypomorphic) con quelli osservati in saggi basati sulla popolazione di cellule, per esempio sulle interazioni proteina-proteina. Utilizzando metodi di trasfezione classici, difficilmente si può ottenere espressione omogenea e bassa di proteine ​​esogene in una vasta popolazione di cellule. Trasduzione di cellule con virus ricombinanticome adenovirus spesso permette un&#39;espressione più normalizzata di proteine ​​esogene. Tuttavia, l&#39;assorbimento adenovirus è limitata dal recettore CAR, che è assente in cellule non-umane o solo debolmente espressa in alcuni tipi di cellule umane. Inoltre, l&#39;entrata cellulare di adenovirus attiva percorsi che regolano la forma delle cellule e l&#39;adesione 4-6 segnalazione. Questo ovviamente non è desiderabile quando si studiano meccanismi regolatori della morfodinamica cellulari. Siamo stati di fronte a questa problematica quando abbiamo intrapreso analisi funzionali di un complesso chaperone, BAG3-HSPB8, nella divisione cellulare e le dinamiche di actina. Lavoro pionieristico aveva descritto un ruolo per questo complesso di proteine ​​chaperone controllo di qualità e l&#39;autofagia durante lo stress 7,8. La maggior parte di questi studi, tuttavia, invocata iperespressione della proteina, partendo dal presupposto che le accompagnatori sono normalmente sovraregolati durante lo stress. Questo ha lasciato aperta la questione se BAG3, in complesso con HSPB8, può contribuire al normale funzionamento delle cellule in divisione che esprimono °accompagnatori ESE come molti tipi di cellule di cancro 9. In particolare, se il complesso chaperone contribuisce al rimodellamento delle strutture di actina-based che controllano la progressione mitotico è stato di grande interesse, date le connessioni emergenti tra accompagnatori HSPB e le dinamiche del citoscheletro 10. Per risolvere questo problema, abbiamo cercato di sviluppare un metodo efficiente per gli esperimenti esaurimento-soccorso che non interferire con la progressione mitotico o morfologia cellulare, e che sarebbe conservare l&#39;omeostasi delle proteine ​​al fine di evitare perturbazioni secondaria della dinamica dei complessi macromolecolari che regola i cambiamenti-forma delle cellule . Così idealmente, l&#39;esaurimento-add-back del gene di interesse deve essere eseguita simultaneamente. L&#39;uso di complessi di adenovirus con un polimero cationico o lipidi è stata descritta per promuovere il trasferimento genico in vitro e in vivo 11,12. Per esempio, fosfato di calcio (CAPI) sembra formare un precipitato conadenovirus che migliorano il virus vincolante-ingresso attraverso un percorso CAR-indipendenti 13. Infatti, abbiamo scoperto che la combinazione di adenovirus-based trasduzione cellulare e trasfezione con composti cationici potrebbe migliorare l&#39;efficienza degli esperimenti svuotamento soccorso. Ciò ha permesso di abbassare la quantità di virus da 3 a 20 volte, a seconda della linea cellulare e il gene di interesse, e beneficiare di una finestra più ampia al fine di regolare l&#39;espressione di proteine ​​esogene a livelli vicini endogeni nella maggioranza di una popolazione di cellule con un impatto minimo sulla morfologia cellulare. In tali condizioni, si potrebbe anche ottenere un&#39;elevata efficienza knockdown dell&#39;espressione della proteina endogena (&gt; 75%). Con la presente descriviamo il passaggio Metodo passo e fornire la prova che l&#39;omeostasi delle proteine ​​non è significativamente perturbato come valutato dai livelli invariati di accompagnatori di stress-indotta della famiglia heat shock protein, rendendo il metodo adatto per le analisi funzionali della ro fisiologicoLe di chaperon molecolari per il video microscopia time-lapse. Il protocollo è suscettibile di procedure di sincronizzazione delle cellule e per l&#39;utilizzo del baculoviruses disponibili in commercio per la co-espressione di bassi livelli di marcatori fluorescenti, con la minima interferenza con le normali dinamiche di actina-based e mandrino durante la progressione mitotico. Mostriamo ulteriormente la versatilità del metodo, applicabile a &quot;duro&quot; trasdurre cellule C2C12 mouse, senza alcun impatto significativo sulla differenziazione dei mioblasti in miotubi in vitro.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Mioblasti di topo</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus design personalizzato</td><td>Welgen</td><td>design</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Actina-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight® Tubulina-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM), Alto glucosio</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Custodia</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Gentile dono della dottoressa Sabine Elowe, Qu&eacute; bec, Canada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo, Nuova Zelanda</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina&reg; Reagente di trasfezione RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM) Alpha senza desossiribouleosidi/ribonucleosidi</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM) Alpha senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA duplex</td><td>Dharmacon</td><td>Design</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2,5%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection: un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in cellular morfodinamica da esperimenti depletion-rescue

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

processi cellulari come la mitosi e la differenziazione cellulare sono regolate da cambiamenti nella forma delle cellule che in gran parte si basano su una corretta rimodellamento delle strutture del citoscheletro delle cellule. Questo prevede il montaggio-smontaggio di strutture macromolecolari ordine superiore in un dato momento e luogo, un processo che è particolarmente sensibile alle perturbazioni provocate da sovraespressione di proteine. Metodi che preservare dell&#39;omeostasi proteica e mantenere la morfologia vicino a normale cellulare sono altamente desiderabili per determinare il contributo funzionale di una proteina di interesse in una vasta gamma di processi cellulari. Transitori esperimenti esaurimento-soccorso basate su RNA interference sono approcci potenti per analizzare le funzioni delle proteine ​​e dei requisiti strutturali. Tuttavia, reintroduzione della proteina bersaglio con deviazione minima dal suo livello fisiologico è una vera sfida. Qui si descrive un metodo denominato adenofection che è stato sviluppato per studiare il ruolo di chaperon molecolari und partner nel normale funzionamento di cellule in divisione e il rapporto con l&#39;actina rimodellamento. cellule HeLa sono state esaurite di BAG3 con duplex siRNA mira la regione 3&#39;UTR. proteine ​​BAG3 GFP-tagged sono stati reintrodotti simultaneamente in&gt; 75% delle cellule utilizzando adenovirus ricombinanti accoppiati ai reagenti di trasfezione. Adenofection ha permesso di esprimere proteine ​​BAG3-GFP a livelli fisiologici vicino in cellule HeLa impoverito di BAG3, in assenza di una risposta allo stress. Nessun effetto è stato osservato sui livelli di endogeni accompagnatori heat shock protein, i principali regolatori di stress-inducibile di omeostasi delle proteine. Inoltre, aggiungendo baculoviruses guida l&#39;espressione di marcatori fluorescenti al momento della cella di trasduzione-trasfezione, potremmo sezionare dinamiche cellulari mitotiche da time-lapse microscopica analisi con perturbazione minima di progressione mitotica normale. Adenofection è applicabile anche alle cellule di topo difficili da infettare, e adatto per analisi funzionali di mioblasti differenziazione in miotubi. Così adenofection fornisce un metodo versatile per eseguire struttura-funzione analizza delle proteine ​​coinvolte nei processi biologici sensibili che si basano sulla dinamica del citoscheletro di ordine superiore.

Trasfezione di BAG3-GFP DNA plasmidico utilizzando lipidi cationici è stata associata con l&#39;espressione eterogenea in cellule HeLa, alcune cellule mostrano livelli malapena rilevabili di proteine ​​e altri cuscinetti livelli molto elevati BAG3 (Figura 2A). In queste cellule, perdita dell&#39;omeostasi proteina è stata evidenziata da accumulo di BAG3-GFP in aggregati perinucleare (Figura 2A, frecce). Al contrario, la trasduzione delle cellule con aden...

Descriviamo un metodo per esperimenti di salvataggio della deplezione che preserva l'integrità cellulare e l'omeostasi delle proteine. L'adenofemazione consente analisi funzionali delle proteine all'interno di processi biologici che si basano su dinamiche basate sull'actina finemente sintonizzate, come la divisione cellulare mitotica e la miogenesi, a livello di singola cellula.

Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

L'obiettivo generale di questo metodo è consentire la realizzazione di esperimenti di recupero dopo deplezione in condizioni che preservino l'integrità cellulare e l'omeostasi proteica, per analisi funzionali di processi biologici a livello di singola cellula.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo le funzioni proteiche e i requisiti strutturali nella dinamica cellulare, come la mitosi e la differenziazione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nell'eliminare una proteina di interesse e nel reintrodurre contemporaneamente una variante di tale proteina a un livello prossimo a quello fisiologico nella maggior parte delle cellule di una popolazione.Iniziare rivestendo le piastre con fondo in vetro con fibronectina. Per fare ciò, diluire un campione stock di fibronectina da un milligrammo per millilitro di un rapporto di uno a 100 con PBS sterile.Aggiungere un millilitro in ogni piastra da 35 millilitri per coprire l'intera superficie. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Durante l'incubazione, preriscaldare l'alpha MEM integrato con il 10% di FBS e un'aliquote di tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius.Dopo 45 minuti di incubazione, iniziare a preparare la soluzione cellulare. Aspirare il mezzo da una piastra da 10 centimetri di cellule HeLa-RFP-H2B e risciacquare delicatamente due volte con 1,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05%.Lasciare 0,5 millilitri di tripsina EDTA sulla piastra dopo l'ultima aspirazione e incubare le cellule per due o tre minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Battere leggermente sulla piastra e osservare il livello cellulare al microscopio per verificare che tutte le cellule siano state distaccate. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo e pipettare delicatamente più volte per separare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri.Contare un campione di 10 microlitri della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro. Successivamente, aspirare la soluzione di fibronectina dalle piastre con fondo in vetro. Non permettere alla fibronectina di asciugarsi prima della semina delle cellule.Preparare una sospensione cellulare per seminare 1,5 × 10⁵ cellule per piatto da 35 millimetri in due millilitri di mezzo. Seminare un piatto aggiuntivo da 35 millimetri rispetto al numero delle condizioni, al fine di contare il numero di cellule prima della trasduzione virale. Incubare per 30-45 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, verificare le cellule al microscopio per assicurarsi che siano ben separate, come mostrato qui. Rimettere i piatti nell'incubatore e coltivare le cellule fino al giorno successivo.Il giorno successivo alla semina, assicurarsi che le cellule abbiano raggiunto una densità di almeno il 50%. Una densità cellulare inferiore al 50% determina una ridotta efficienza di trasduzione virale, un aumento della variabilità dell'espressione proteica per cellula e un incremento della tossicità cellulare. Successivamente, raccogliere le cellule dalla piastra aggiuntiva come in precedenza e contare il numero di cellule. Calcolare il volume di virus necessario per una trasduzione efficiente delle cellule. Etichettare un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro per ogni condizione e aggiungere 400 microlitri di alpha MEM privo di siero, mantenuto caldo. Dopo aver scongelato lentamente le aliquote di virus su ghiaccio, aggiungere il volume richiesto di ciascun virus ai tubi e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Successivamente, dopo aver aspirato il mezzo dalle cellule, aggiungere delicatamente la miscela virale goccia a goccia. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Ogni 15 minuti per un'ora, agitare delicatamente le piastre all'interno della cappa sterile per garantire un contatto uniforme tra il virus e le cellule. L'uso di una piccola quantità di mezzo favorisce il contatto tra il virus e le cellule.Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente 1,6 millilitri di alpha MEM privo in ogni piastra per ottenere un volume totale di due millilitri. Quindi avviare la sincronizzazione cellulare aggiungendo timidina 2 millimolare prima di incubare le cellule per ulteriori due ore.Nel frattempo, preparare la miscela di transfezione con siRNA aggiungendo in un microtubo 139 microlitri di acqua sterile, 50 microlitri di cloruro di calcio uno molare e 11 microlitri di siRNA venti micromolare. Se non è necessario alcun siRNA, sostituire la quantità di siRNA con acqua sterile per eseguire una transfezione vuota. Aggiungere lentamente, goccia a goccia, la soluzione HBSS-2X sulla miscela di cloruro di calcio e siRNA. Mescolare delicatamente due volte per iniezione d'aria utilizzando una pipetta da 200 microlitri, poiché precipitati più piccoli determinano una maggiore efficienza di transfezione. Incubare quindi la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere lentamente 200 microlitri goccia a goccia in ogni piastra e agitare per mescolare. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 16 ore.Il giorno successivo, rimuovere le piastre dall'incubatrice e trasportarle in una cappa a flusso laminare per colture cellulari. Dopo aver lavato le cellule due volte con due millilitri di HEPES tiepido, aggiungere due millilitri di alpha MEM privo di siero prima di reinserire le piastre nell'incubatrice.Sette ore più tardi, aggiungere timidina 2 millimolare alle piastre prima di riposizionarle nell'incubatrice. Lavorare con non più di quattro piastre cellulari alla volta, poiché le variazioni di temperatura influiscono sulla durata del ciclo cellulare. Il giorno seguente, 48 ore dopo la trasfezione con siRNA e l'infezione virale, risciacquare le cellule due volte con due millilitri di PBS caldo, quindi aggiungere due millilitri di MEM alfa senza rosso fenolo per l'acquisizione di immagini su cellule vive. Incubare per sette ore. Eseguire esperimenti di imaging cellulare vitale a breve termine su cellule mitotiche mediante un microscopio invertito dotato di una camera umidificata regolata termicamente con anidride carbonica al 5%. Prima dell'acquisizione, verificare che la camera abbia raggiunto la temperatura appropriata di 37 gradi Celsius.Posizionare le piastre di coltura nella camera del microscopio un'ora prima dell'acquisizione per consentire un adeguato equilibrio del mezzo ed evitare spostamenti del fuoco dovuti a variazioni di temperatura. Esaminare lo stato mitotico delle cellule. A questo punto, dal 10 al 15% delle cellule dovrebbe trovarsi nelle fasi iniziali della mitosi.Durante il tempo di equilibrazione, impostare i parametri di acquisizione determinati in esperimenti precedenti. È importante ottenere una risoluzione adeguata senza causare fotoblescimento, poiché ciò provoca danni cellulari e altera il decorso mitotico. Selezionare diversi campi contenenti cellule in ingresso mitotico per ogni condizione, in modo da ottenere un numero significativo di cellule da analizzare senza superare l'intervallo di acquisizione. Una volta scelti tutti i campi, ripristinare il fuoco e avviare l'acquisizione il più rapidamente possibile.Utilizzando un sistema confocale a disco rotante, un'impostazione tipica includerebbe quattro condizioni diverse, sette campi per piastra e due canali di colore con un intervallo da 1,5 a due minuti su un periodo di 75 minuti. Stabilire criteri ben definiti per analizzare i fenotipi mitotici nelle cellule, i quali dipenderanno dai marcatori fluorescenti utilizzati. A differenza della trasfezione di BAG3-GFP, il DNA plasmidico, come mostrato a sinistra, l'adenofezione con adenovirus ricombinanti, mostrata qui a destra, consente un'espressione più omogenea ed efficiente di BAG3-GFP nella maggior parte della popolazione cellulare a bassa multiplicità di infezione. Questo rappresentativo immunoblot mostra che l'adenofezione con siRNA specifici per BAG3 e l'adenovirus ricombinante BAG3-GFP permette un efficiente esaurimento del BAG3 endogeno e la reintroduzione della proteina BAG3-GFP a livelli quasi endogeni. Come mostrato qui, l'adenofezione può preservare l'omeostasi proteica poiché non si osserva un aumento rilevabile dei livelli delle proteine da shock termico indotte da stress in cellule HeLa sottoposte ad adenofezione, a differenza delle cellule HeLa trattate con l'induttore di stress proteotossico MG132. Qui osserviamo che il progresso delle cellule attraverso la mitosi non è significativamente alterato dall'adenofezione, come mostrato da queste immagini al microscopio confocale a intervalli di tempo da cellule HeLa sottoposte ad adenofezione con siRNA di controllo e BacMam-GFP alfa Tubulina, e BacMam-RFP Actina.Il grafico indica la proporzione di cellule con mitosi anomala. Le cellule adenofettate solo con siRNA specifico per BAG3 hanno mostrato un aumento di circa due volte del livello di difetti mitotici, come rappresentato dalla barra rossa, che è stato ripristinato a livelli vicini a quelli delle cellule di controllo mediante la re-introduzione di BAG3-GFP, indicata dalla barra nera.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di recupero mediante deplezione utilizzando l'adenofezione. Questo metodo fornisce un sistema rapido e semplice per creare silenziamenti ipomorfi finalizzati all'analisi struttura-funzione in diversi contesti cellulari. Applicando questo approccio, è possibile identificare i requisiti strutturali fondamentali della proteina di interesse per una determinata funzione. Altri metodi di editing del genoma possono quindi essere utilizzati per approfondire i meccanismi coinvolti.

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