Name: In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Scopri il trasferimento genico in vivo nelle cellule di Schwann del nervo sciatico di roditori mediante elettroporazione. Questa tecnica semplice permette di studiare i meccanismi molecolari della mielinizzazione e della demielinizzazione nel sistema nervoso periferico.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia a M.I. (21229004 e 25221304).

L&#39;uso di topi per la ricerca era in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato di benessere degli animali l&#39;Università di Tokyo. 1.Preparazione di plasmidi DNA <ol><li> Generare plasmidi DNA per elettroporazione in vivo subcloning cDNA o la sequenza shRNA in un plasmide di espressione per cellule di mammifero 12. Utilizzare un citomegalovirus immediato primi enhancer e pollo β-actina promotore di fusione (CAG) promotore-driven plasmide 13 perché permette l&#39;espressione forte e stabile. Per espressione shRNAs sotto il controllo di un promotore CAG, utilizzare un sistema a cassette shRNA mir30-based per la subcloning shRNA 14. </li><li> Purificare il DNA plasmide con un kit di maxi-prep secondo le istruzioni del fabbricante, e risospendere il DNA con soluzione salina HEPES-buffered (140 mM NaCl, 0,75 mm Na 2 HPO 4, 25 mM HEPES, pH 7,40). Regolare la concentrazione del DNA per ≥4 mg / mL. </li><li&gt; Preparare la soluzione plasmide DNA ad una concentrazione di 4 mg / mL, e aggiungere una quantità minima di colorante verde veloce (concentrazione finale di 0,01%) per etichettare il sito di iniezione. Quando è richiesto elettroporazione simultanea di più plasmidi, regolare la concentrazione totale della soluzione plasmide DNA a 4 mg / mL. Nota: La composizione ottimale dei DNA plasmidici deve essere determinata secondo la efficienza di trasfezione di ciascun plasmide. </li></ol> 2. sterilizzazione degli strumenti chirurgici e Saline <ol><li> strumenti chirurgici autoclave e la soluzione di NaCl allo 0,9%. </li></ol> 3. Preparazione della micropipetta di vetro <ol><li> Tirare pipette di vetro con un estrattore pipetta. Tagliare la punta della pipetta ad un diametro di 30-50 micron. Utilizzare i seguenti parametri: Calore, 600; Velocity, 50; Ora, 75. </li></ol> 4. Chirurgia Animale, iniezione del DNA ed elettroporazione Nota: Un overvista di questa fase è descritta in Figura 1. Sebbene la procedura di cuccioli di ratto sono descritti qui, il metodo è applicabile anche ad animali più maturi utilizzando la stessa procedura. <ol><li> Anestetizzare ratto con isoflurano nella casella di induzione finché l&#39;animale diventa immobile regolando il flusso di ossigeno al 0,4 L / min e la concentrazione isoflurano al 4% (vol / vol). Eseguire punta pizzicare per confermare il corretto anestesia. </li><li> Mettere il topo sul caldo caldo sotto un microscopio binoculare, e mantenere l&#39;anestesia con la somministrazione continua isoflurano attraverso la maschera. Regolare il flusso di ossigeno al 0,2 L / min e la concentrazione isoflurano al 2% (vol / vol). Utilizzare collirio per prevenire la secchezza degli occhi se gli occhi dell&#39;animale sono aperte. </li><li> Fissare le gambe con nastro chirurgico. </li><li> Pulire la pelle sulla coscia posteriore con iodopovidone, e fare un&#39;incisione con un bisturi. Nota: Rasatura aree chirurgiche se le aree chirurgiche sono coperte con haria. </li><li> Esporre il nervo sciatico, creando un varco tra le muscolo quadricipite femorale e del muscolo bicipite femorale con aghi da cucito. </li><li> Bagnare il nervo con 0,9% soluzione di NaCl. Assorbire l&#39;acqua in eccesso con carta privo di lanugine. </li><li> Inserire la base di una micropipetta di vetro sulla tubazione flessibile, e riempire la quantità adeguata di soluzione di DNA (almeno un microlitro) nella micropipetta aspirando delicatamente. </li><li> Sollevare il nervo scoperto tirando delicatamente la parte distale del nervo utilizzando un ago. Nota: Non applicare tensione al nervo per minimizzare lo stress meccanico. </li><li> Inserire la micropipetta di vetro nel sito distale sul nervo, ed iniettare la soluzione di DNA dalla pressione applicando (cioè soffiando nell&#39;estremità aperta del tubo flessibile). Iniettare soluzione di DNA fino a quando il nervo appare verde (massimo 1 ml). A causa frequente inserimento del micropipetta può danneggiare il nervo, non inserire la micropipetta più di due volte. </li><li> Posizionare un tweEzer-tipo di platino elettrodo circa 1-2 mm di distanza dal nervo. Colmare il divario tra l&#39;elettrodo e il nervo con 0,9% soluzione di NaCl. Nota: Non tenere il nervo con l&#39;elettrodo per evitare sollecitazioni meccaniche sul nervo. </li><li> Applicare impulsi elettrici al sito di iniezione utilizzando un elettroporatore con l&#39;elettrodo. Dopo il primo set impulso, invertire l&#39;elettrodo e applicare un altro set di impulso. Utilizzare i seguenti parametri: tensione, 50 V; durata dell&#39;impulso, 5 msec; Intervallo di impulso, 100 msec; numero di impulsi, 4 volte. </li><li> Pulire il sito di elettroporazione con il 0,9% soluzione di NaCl. </li><li> Ripetere i passaggi 4,4-4,11 sul nervo sciatico controlaterale. </li></ol> 5. Post-elettroporazione <ol><li> Chiudere le incisioni con la colla cianoacrilato. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione della colla, pulire la ferita con povidone-iodio. </li><li> Rilasciare il cucciolo dalla maschera facciale. Riscaldare il cucciolo su un riscaldatore per almeno un&#39;ora in modo da consentire di recuperare completamente dall&#39;anestesia. Do non lasciare il cucciolo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente. </li><li> Dopo il recupero dall&#39;anestesia, restituire il cucciolo di ratto madre. Non restituire il cucciolo fino alla completa guarigione. </li></ol> 6. post-intervento chirurgico <ol><li> Casa i cuccioli di ratto in gabbia fino a condurre gli esperimenti 11 (si vedano gli esempi in figura 3). Somministrare carprofen (5 mg / kg, ip), un farmaco non steroideo anti-infiammatori, o buprenorfina (0,1 mg / kg, sc), un analgesico oppioide, se necessario. Nota: se il cucciolo di ratto non cresce bene o infiammazione si osserva attorno al sito chirurgico, escludere l&#39;animale dagli esperimenti. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo articolo, descriviamo un metodo semplice ed efficiente che consente il trasferimento genico in vivo alle SC mielinizzanti nel nervo sciatico di ratto utilizzando l'elettroporazione. Questo metodo consente un'espressione genica altamente selettiva nelle SC mielinizzanti semplicemente applicando impulsi elettrici al nervo sciatico iniettato con DNA plasmidico. Poiché i meccanismi molecolari della mielinizzazione e della demielinizzazione nel sistema nervoso periferico rimangono poco chiari, l'attuale metodo di elettroporazione in vivo sarà un potente strumento per chiarire i ruoli di più geni di interesse negli animali viventi.
Un requisito fondamentale di questo metodo è quello di mantenere al minimo i danni al nervo durante l'intervento chirurgico. Se il danno chirurgico causa un'infiammazione eccessiva, il nervo sciatico può degenerare. Per evitare ciò, è necessario eseguire un intervento chirurgico con estrema cura, in modo da non danneggiare i vasi sanguigni attorno al nervo. Anche lo stress meccanico al nervo durante l'intervento chirurgico può essere una causa di danni ai nervi. Per ridurre al minimo lo stress meccanico, il sollevamento del nervo esposto deve essere effettuato il più delicatamente possibile e l'elettrodo a pinzetta deve essere posizionato vicino al nervo senza contatto. Inoltre, impulsi elettrici troppo forti possono causare un movimento indesiderato delle gambe, che porta a stress meccanico, o possono bruciare il nervo. Se si osservano danni significativi ai nervi, si consiglia di ridurre l'intensità dell'impulso elettrico o di posizionare l'elettrodo più lontano dal nervo.
Nel nostro attuale protocollo, i plasmidi CAG guidati dal promotore sono stati utilizzati come vettori di espressione. I plasmidi guidati dal promotore CAG consentono alti livelli di espressione genica nelle SC mielinizzanti in vivo. Abbiamo anche provato un promotore del CMV, un altro promotore universale ampiamente utilizzato per l'espressione genica dei mammiferi, ma l'espressione del prodotto genico era molto debole. Ciò è coerente con i risultati precedenti, in cui la trasfezione mediata dall'elettroporazione è stata condotta nel cervello embrionale20. Pertanto, si consiglia di utilizzare plasmidi guidati da promotori CAG per il metodo di elettroporazione in vivo .
Poiché la segnalazione assonale è un fattore chiave nella mielinizzazione/demielinizzazione21, anche la modificazione genica nei neuroni è importante. Tuttavia, la somministrazione di transgeni utilizzando il nostro metodo di elettroporazione in vivo è limitata alle SC. È stato riportato che il rilascio genico negli assoni del nervo sciatico può essere ottenuto quando l'elettroporazione in vivo viene applicata ai neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) nei ratti adulti22. Ciò suggerisce che la consegna del DNA plasmidico al corpo cellulare è probabilmente fondamentale per la trasfezione in vivo degli assoni periferici. Pertanto, per esaminare il coinvolgimento delle molecole assonali nella mielinizzazione/demielinizzazione, i ricercatori dovrebbero utilizzare metodi genetici specifici per i neuroni come animali geneticamente modificati, vettori virali neurone-specifici o elettroporazione in vivo per i neuroni DRG.
Rispetto ai metodi attuali, come la generazione di linee animali geneticamente modificate23 e la somministrazione di transgeni da parte dei vettori virali4-6, la modifica genica delle SC mediante elettroporazione in vivo è più semplice. Questo metodo richiede solo alcuni giorni per la costruzione del DNA plasmidico e un giorno per la chirurgia di elettroporazione. La costruzione del DNA plasmidico non richiede una camera a rischio biologico che di solito è essenziale per la manipolazione dei vettori virali. Inoltre, uno dei vantaggi del metodo dell'elettroporazione è la capacità di espressione simultanea di più prodotti genici utilizzando un semplice protocollo. La nostra nuova tecnica sarà utile per analizzare l'interazione di una varietà di molecole di segnalazione coinvolte nella mielinizzazione e demielinizzazione. In particolare, consentendo la cotrasfezione di un certo numero di diverse sonde fluorescenti intracellulari, il nostro metodo dovrebbe essere un potente strumento per studiare le dinamiche di segnalazione intracellulare nelle SC utilizzando esperimenti di imaging dal vivo.

La rapida trasmissione di informazioni sensoriali e motorie nel sistema nervoso periferico è consentita dalla guaina mielinica, che è formata da cellule di Schwann mielinizzanti (SC)1. L'isolamento degli assoni da parte della guaina mielinica consente la conduzione saltatoria, che aumenta la velocità degli impulsi nervosi. Nei disturbi in cui lo sviluppo o il mantenimento della guaina mielinica è compromesso, la velocità di conduzione nervosa è ridotta. Ciò si traduce in neuropatia che coinvolge disfunzioni motorie e sensoriali. Sebbene esistano molti studi sui meccanismi molecolari della mielinizzazione e della demielinizzazione nel sistema nervoso periferico, i ruoli delle numerose proteine coinvolte in questi processi rimangono poco chiari.
Per studiare i meccanismi molecolari della mielinizzazione/demielinizzazione SC in vivo, sono stati utilizzati approcci genetici per modificare l'espressione genica negli animali. Un approccio potente è l'uso di animali knockout/knockin o transgenici. Tuttavia, la generazione di questi animali è costosa e richiede tempo. Per la manipolazione genica specifica per SC, è necessario incrociare ceppi floxati con topi Cre o altri metodi di espressione genica condizionale. Anche in questo caso si tratta di un lavoro laborioso e dispendioso in termini di tempo. Negli ultimi anni, una tecnologia genetica all'avanguardia, il sistema CRISPR-Cas9, ha reso la generazione di topi geneticamente modificati molto più veloce (circa 4 settimane)2,3, ma questo metodo è ostacolato da limitazioni della sequenza bersaglio e soffre di effetti fuori bersaglio. Come metodo alternativo, il trasferimento genico mediato da vettori virali è un metodo più rapido e semplice per ottenere il trasferimento genico nelle SC in vivo4-6. In effetti, la generazione di vettori virali è meno costosa e richiede un tempo più breve (entro poche settimane) e la manipolazione genica delle SC può essere ottenuta semplicemente iniettando vettori virali ingegnerizzati, come vettori adenovirali, vettori virali adeno-associati (AAV) e vettori lentivirali, nel nervo sciatico. Poiché questi vettori virali hanno caratteristiche diverse, gli utenti devono scegliere quello più adatto al loro scopo. I vettori adenovirali infettano gli assoni e le SC sia nei nervi sciatici giovani che in quelli maturi. In particolare, i vettori adenovirali hanno una selettività più elevata per le SC non mielinizzanti rispetto alle SC mielinizzanti. Gli adenovirus possono causare risposte immunitarie e, di conseguenza, dovrebbero essere utilizzati ceppi immunodeficienti5. I vettori AAV sono attualmente i vettori virali più utilizzati e consentono il trasferimento genico in vivo con una tossicità inferiore7. L'AAV può trasdurre sia gli assoni che gli SC mediante iniezione diretta nelle fibre nervose8,9. Tuttavia, l'espressione proteica mediata da AAV di solito richiede 3 settimane o più per raggiungere i livelli massimidi 7,9. Pertanto, è difficile analizzare la mielinizzazione, che progredisce attivamente durante il periodo postnatale di due settimane. I vettori lentivirali hanno una maggiore selettività per le SC mielinizzanti rispetto alle SC non mielinizzanti e non hanno effetti tossici sui nervi sciatici. Tuttavia, i vettori lentivirali non infettano le SC nei nervi più maturi5 e quindi non sono adatti per analizzare eventi come il processo di demielinizzazione.
L'elettroporazione è un altro approccio più rapido e semplice per ottenere il trasferimento genico in vivo. È stato riportato che la trasfezione in vivo delle SC può essere ottenuta quando l'elettroporazione viene applicata ai nervi sciatici di ratto sezionati10. Tuttavia, poiché questo metodo richiede la transezione nervosa per la consegna del gene, l'applicazione è limitata all'analisi dei nervi danneggiati. Qui, descriviamo un metodo alternativo che consente la somministrazione di transgeni in SC mielinizzanti in nervi sciatici di ratto intatti utilizzando l'elettroporazione11. Questo metodo richiede la costruzione di plasmidi, che di solito può essere completata entro una settimana. Quindi, semplicemente fornendo impulsi elettrici al sito sul nervo sciatico in cui è stato iniettato il DNA plasmidico, è possibile ottenere una trasfezione altamente selettiva di SC mielinizzanti sia negli animali neonatali che in quelli più maturi. Elettroporando più plasmidi, è possibile ottenere facilmente l'espressione simultanea di una varietà di geni. La capacità di esprimere simultaneamente più molecole, come le proteine di segnalazione, gli RNA a forcina corta (shRNA) e le sonde funzionali, è fondamentale per studiare processi complessi come la mielinizzazione e la demielinizzazione. Il nuovo metodo di elettroporazione in vivo descritto in questo articolo sarà uno strumento potente, che consentirà ai ricercatori di analizzare la funzione di una moltitudine di molecole e le loro interazioni nelle SC mielinizzanti.

<table><tbody><tr><td>Maxi Kit Plasmidico Genopure</td><td>Roche</td><td>03 143 422 001</td><td>Kit di purificazione DNA plasmidico</td></tr><tr><td>Fast Green CFC</td><td>WAKO</td><td>069-00032</td><td>Colorante per iniezione di DNA</td></tr><tr><td>GC 150T-10</td><td>HARVARD APPARATUS</td><td>30-0062</td> Tubo di aspirazione <td>capillare in vetro</td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>05-2000-00</td><td>Tubo di aspirazione per micro iniezione</td></tr><tr><td>MODELLO P-97</td><td>SUTTER INSTRUMENT Co.</td>Estrattore <td></td><td>per micropipette</td></tr><tr><td>CUY21 Elettroporatore</td><td>BEX</td> a cellula <td>singola CUY21</td><td>Generatore di impulsi</td>a cellula singola</tr><tr><td>Riscaldatore elettrico</td><td>KODEN</td><td>CAH-6A</td><td>Riscaldatore durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Isofluolane</td><td>Mylan</td><td>1119701G1076</td><td>Anestetico</td></tr></tbody></table>

in vivo gene transfer di cellule di schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

La formazione della guaina mielinica da parte delle cellule di Schwann (SC) è essenziale per la rapida conduzione degli impulsi nervosi lungo gli assoni nel sistema nervoso periferico. La manipolazione genetica selettiva per le SC negli animali viventi è una tecnica potente per studiare i meccanismi molecolari e cellulari della mielinizzazione e della demielinizzazione delle SC in vivo. Mentre i topi knockout/knockin e transgenici sono strumenti potenti per studiare la biologia delle SC, questi metodi sono costosi e richiedono tempo. L'introduzione del transgene mediato da vettori virali nel nervo sciatico è un metodo più semplice e meno laborioso. Tuttavia, i metodi virali hanno dei limiti, come la tossicità, i vincoli delle dimensioni dei transgeni e l'infettività limitata a determinate fasi di sviluppo. Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente la trasfezione selettiva di SC mielinizzanti nel nervo sciatico del roditore utilizzando l'elettroporazione. Applicando impulsi elettrici al nervo sciatico nel sito di iniezione del DNA plasmidico, i geni di interesse possono essere facilmente silenziati o sovraespressi nelle SC sia negli animali neonatali che in quelli più maturi. Inoltre, questo metodo di elettroporazione in vivo consente l'espressione simultanea altamente efficiente di più transgeni. La nostra nuova tecnica dovrebbe consentire ai ricercatori di manipolare in modo efficiente l'espressione genica della SC e facilitare gli studi sullo sviluppo e la funzione della SC.

Un esempio di un nervo sciatico transfettate con la proteina fluorescente rossa (RFP) esprimente il plasmide è mostrato in Figura 2A. Le cellule che mostrano la morfologia bipolare, una caratteristica della SCS, sono stati scarsamente trasfettate con RFP. No RFP fluorescenza è stato rilevato negli assoni. Noi di solito troviamo ~ 100 SC trasfettate in ogni nervo. Questa efficienza trasfezione sembra simile alla SC efficienza in vivo infezione utilizzando vettori lentivirali 4. Esperimenti immunostaining hanno dimostrato che la maggior parte (~ 96%) cellule RFP-positive a P7 co-marcato per S100, un marcatore SC (Figura 2B) e 91% di cellule RFP-positive a P14 co-marcato per MBP, un marcatore myelinating SC (Figura 2C), suggerendo che il trasferimento genico mediante elettroporazione è altamente selettivo per mielinizzanti SC. L&#39;introduzione di geni multipli in SC <em&gt; in vivo sarà estremamente utile per studiare i meccanismi di mielinizzazione / demielinizzazione. Uno dei principali vantaggi del metodo nel vivo elettroporazione qui descritto è la capacità di trasferire geni multipli con una procedura semplice. La figura 2D mostra un&#39;immagine rappresentativa di un nervo sciatico trasfettate con una miscela di GFP e RFP plasmidi che esprimono l&#39;utilizzo nel elettroporazione in vivo. Circa il 97% di SC erano GFP e RFP doppio positive, suggerendo che la consegna altamente efficiente di geni multipli può essere ottenuto semplicemente electroporating miscele di diversi plasmidi. Nei roditori, mielinizzazione inizia intorno nascita, aumentando notevolmente durante le prime due settimane dopo la nascita, e quindi diminuisce gradualmente. Così, manipolando geneticamente SC durante queste finestre temporali di sviluppo, i meccanismi alla base di queste diverse fasi di mielinizzazione possono essere chiarite. vettori lentivirali sono un ottimo strumento per unnalyzing mielinizzazione, in particolare per quanto hanno tossicità minima, ma lentivirus di infettare solo neonatale nervi sciatico 5,6. In confronto, il trasferimento genico elettroporazione mediata funziona bene quando trasfezione viene condotta su P3 (figura 2E, in alto) o P14 (Figura 2E, bottom). Le applicazioni del romanzo nel metodo di elettroporazione in vivo sono descritte qui. La figura 3A mostra le immagini microscopiche luce di GFP che esprimono SC mielinizzanti a vari stadi di sviluppo (P7, P14, P21 e P31). Con analisi al microscopio ottico, alterazioni dei parametri morfologici, come la lunghezza e il diametro, possono essere valutate. Si noti che questi parametri hanno valori simili rispetto al intatto ratto nervi periferici 15,16, il che suggerisce che i nervi elettroporate si sviluppano senza rilevanti conseguenze dannose. La figura 3B mostra un elettrone un&#39;immagine microscopica della LacZ-espresssing mielinizzanti SC. In questo caso, LacZ è stato utilizzato come indicatore di espressione. β-galattosidasi colorazione utilizzando bluO-gal, un substrato di etanolo insolubile, consente l&#39;analisi della struttura della mielina del SC trasfettate al microscopio elettronico 11,17. In questi esperimenti, il ruolo delle molecole di segnalazione può essere esaminato da tacere o aumentando la loro espressione, consentendo in tal modo l&#39;analisi di perdita-di-funzione o il guadagno-di-funzione effetti. Oltre all&#39;analisi di tessuto fissato, in vivo trasferimento genico elettroporazione mediata può essere applicato anche a vivere esperimenti di imaging. Ad esempio, la Figura 3C mostra una myelinating SC co-esprimono G-GECO1.1 18, un indicatore verde fluorescente citosolico Ca 2+, e R-GECO1mt 19, un indicatore rosso fluorescente mitocondriale Ca 2+. Esprimendo questi indicatori, abbiamo identificato un percorso di segnalazione che controlla citosoliche e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni in mielinizzanti SC<html> . Pertanto, il presente metodo può essere usato per studiare una varietà di meccanismi di segnalazione, in particolare quando le sonde fluorescenti geneticamente codificati sono disponibili per rilevare i segnali di interesse. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig1.jpg" /> Figura 1:. Schematica della i n elettroporazione in vivo Metodo Innanzitutto, il nervo sciatico del ratto anestetizzato è esposto. In secondo luogo, il plasmide DNA viene iniettato nel nervo sciatico. In terzo luogo, gli impulsi elettrici vengono consegnati al sito di iniezione attraverso l&#39;elettrodo a forma di pinza. Infine, la ferita viene chiusa con colla. Questa procedura può essere ripetuta sul nervo controlaterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig2.jpg" /> Figura 2: Risultati Rappresentante sui nervi sciatico trasfettate (A) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico transfettate.. Il nervo è stato transfettate con plasmide RFP che esprimono al P3, e fissato a P7. (B) Una immagine rappresentativa di una cellula RFP-transfettate a P7 mostrando colocalizzazione con S100, un marker SC. (C) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico RFP-trasfettate a P14 che mostra colocalizzazione con MBP, un marker myelinating SC. (D) Una immagine rappresentativa di un nervo sciatico cotransfected con GFP e RFP plasmidi che esprimono. SC trasfettate espresso contemporaneamente GFP e RFP. (E) Un&#39;immagine di mielinizzanti SC a P31 trasfettate al P3, quando inizia la mielinizzazione (in alto), e un&#39;immagine della SCS mielinizzanti a P31 transfettate a P14, quando la maggior parte di grandi assoni diventano mielinato (in basso), suggerendo che trasfezione di SC mielinizzanti può essere raggiunto non solo nei nervi neonatale, ma anche nei nervi più maturi. Barre di scala = 200 micron (A); 50 micron (BE). Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54567/54567fig3.jpg" /> Figura 3: Applicazione di elettroporazione in vivo (A) L&#39;analisi al microscopio luce dello sviluppo di mielinizzanti SC.. nervo sciatico sono stati elettroporate con plasmide GFP che esprimono al P3, e sono stati fissati a vari stadi di sviluppo (P7, P14, P21 e P31). Immagini rappresentative della SC GFP-positive sono mostrati sulla sinistra. La lunghezza media e diametro sono riassunti come media ± SEM (n = 30-47 da 3 nervi) sulla destra. La lunghezza e il diametro mielinizzanti SCs aumenta al procedere dello sviluppo. (B) Un elettrone immagine al microscopio di un nervo sciatico trasfettate con un plasmide codificante LacZ. A transfettate SC (asterisco bianco, sinistra) è stato finemente etichettato con precipitati del prodotto di reazione β-galattosidasi. (C) L&#39;immagine di una SC cotransfected con G-GECO1.1, un indicatore verde fluorescente citosolico Ca 2+, e R-GECO1mt, un indicatore rosso fluorescente mitocondriale Ca 2+. Le regioni all&#39;interno dei bianchi rettangoli tratteggiate sono mostrati ampliata nei pannelli a destra. Barre di scala = 50 micron (A e C); 1 micron (B). Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54567/54567fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo una tecnica in vivo per il trasferimento genico alle cellule di Schwann (SC) nel nervo sciatico del roditore. Questa semplice tecnica è utile per studiare i meccanismi di segnalazione coinvolti nello sviluppo e nel mantenimento delle SC mielinizzanti.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

L'obiettivo generale di questo nuovo protocollo sperimentale è condurre in modo efficiente il trasferimento genico in vivo nelle cellule di Schwann dei nervi sciatici di roditori mediante elettroporazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come i meccanismi molecolari della mielinizzazione e della demielinizzazione nel sistema nervoso periferico. Il vantaggio principale di questo metodo è che i chirurghi possono eseguire la trasfezione in vivo sulle cellule di Schwann mediante una procedura semplice.Per iniziare la procedura, sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e la soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. Successivamente, tirare alcune pipette di vetro utilizzando un tiratore di pipette e tagliare la punta di ciascuna pipetta fino a ottenere un diametro compreso tra 30 e 50 micron. Dopo aver anestetizzato un ratto neonato con isoflurano in una camera di induzione, posizionare il ratto su un riscaldatore elettrico preriscaldato sotto un microscopio binoculare.Eseguire una leggera compressione delle dita dei piedi per verificare un'adeguata anestesia. Applicare quindi un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione durante l'intervento chirurgico. Mantenere l'anestesia somministrando continuamente isoflurano attraverso una maschera facciale.Successivamente, fissare le zampe dell'animale con nastro chirurgico e pulire la cute della coscia posteriore con iodopovidone. Praticare un'incisione con il bisturi. Esporre il nervo sciatico creando un'apertura tra il muscolo quadricipite femorale e il muscolo bicipite femorale mediante due aghi da cucito.Quindi, applicare una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% sul nervo e assorbire l'eccesso di acqua con carta senza pelucchi. Successivamente, inserire la base di una micropipetta di vetro in un tubo flessibile. Riempire delicatamente la micropipetta con una quantità adeguata di soluzione di DNA mediante aspirazione.Ora, tirare delicatamente il lato distale del nervo utilizzando un ago per sollevare il nervo esposto. Inserire la micropipetta di vetro nel sito distale del nervo e iniettare la soluzione di DNA applicando una leggera pressione positiva fino a quando il nervo appare verde. Successivamente, posizionare un elettrodo in platino a forma di pinzetta a circa uno o due millimetri dal nervo.Riempire lo spazio tra l'elettrodo e il nervo con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. Applicare impulsi elettrici al sito di iniezione utilizzando un elettroporatore. Dopo il primo insieme di impulsi, invertire l'elettrodo e applicare un altro insieme di impulsi.In seguito, pulire il sito di elettroporazione con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e ripetere la procedura sul nervo sciatico controlaterale. Dopo l'elettroporazione, chiudere l'incisione con colla a base di cianoacrilato. Quindi, pulire la ferita con iodopovidone.Rimuovere la maschera facciale dall'animale e mantenerlo sul riscaldatore elettrico per almeno un'ora per consentire un completo recupero dall'anestesia. Successivamente, restituire il cucciolo alla ratto madre. Somministrare carprofene, un farmaco antinfiammatorio non steroideo, o buprenorfina, un analgesico oppioide, se necessario.Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di un nervo sciatico trasfettato. Il nervo è stato trasfettato con un plasmide esprimente RFP a P3 ed fissato a P7. Questa è un'immagine rappresentativa di una cellula trasfettata con RFP a P7, che mostra la colocalizzazione con S100, un marcatore delle cellule di Schwann. E questa è un'immagine rappresentativa di un nervo sciatico trasfettato con RFP a P14, che mostra la colocalizzazione con MBP, un marcatore delle cellule di Schwann mielinizzanti.Un'immagine rappresentativa di un nervo sciatico co-trasfettato con plasmidi esprimenti GFP e RFP è mostrata qui. Le cellule di Schwann trasfettate hanno espresso contemporaneamente GFP e RFP. Questa figura mostra un'immagine di cellule di Schwann mielinizzanti a P31, che erano state trasfettate a P3, quando inizia la mielinizzazione, e un'immagine di cellule di Schwann mielinizzanti a P31 che erano state trasfettate a P14, quando la maggior parte delle fibre nervose di grosso calibro diventa mielinizzata.Queste immagini indicano che la trasfezione delle cellule di Schwann mielinizzanti può essere ottenuta non solo nei nervi neonatali, ma anche in nervi più maturi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'elettroporazione sui nervi sciatici.

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