Name: Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri come misurare la velocità dei fagosomi in macrofagi umani infettati con HIV-1 utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo permette di tracciare il movimento cellulare in tempo reale.

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Ringraziamo il dottor Jamil Jubrail per aver letto il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del CNRS, dell'Inserm, dell'Université Paris Descartes, dell'Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), della Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 inclusa una borsa di dottorato per GLB) e dell'Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, inclusa una borsa di studio post-dottorato per CD) alla FN. A. Dumas è stato sostenuto da borse di dottorato dell'Université Paris Descartes e di Sidaction.

Il protocollo deve essere effettuata in stretta conformità con le normative nazionali ed internazionali e le normative locali. Il sangue da donatori sani che hanno dato il loro consenso a donare il sangue per scopi di ricerca è stato ottenuto dal sangue centri trasfusionali con la quale le istituzioni hanno firmato un accordo. protezioni speciali devono essere prese quando si utilizza il sangue umano. Esperimenti con HIV-1 devono essere eseguite in un livello di biosicurezza 3 o 2 (BSL-3 o 2) di laboratorio in base alla legislazione locale. 1. Preparazione di macrofagi umani derivate da monociti (hMDMs) per gradiente di densità centrifugazione e selezione per adesione <ol><li> Inizia con sangue fresco da donatori sani (9 ml). Diluire l&#39;intero volume di sangue fresco con 1x tampone fosfato sterile (PBS) senza Ca 2 + e Mg 2+ a ottenere un volume finale di 70 ml e aggiungere delicatamente il sangue diluito in due provette da 50 ml coniche (35 ml per provetta) , in cima a 15 ml di unaeutral, altamente ramificata, di massa elevata, polisaccaride idrofila in soluzione già in ciascun tubo. </li><li> Centrifuga entrambi i tubi di sangue al 537 xg per 20 minuti a 20 ° C senza freno. Poi raccogliere le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) contenuti nel ring cellule nuvoloso a livello di interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml contenente 15 ml di 1x PBS senza Ca 2+ e Mg 2+. </li><li> Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 minuti a 20 ° C e risospendere il pellet in 45 ml di 1x PBS senza Ca 2+ e Mg 2+. </li><li> Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 min a 20 ° C, risospendere il pellet in 10 ml di PBS 1x senza Ca 2 + e Mg 2+, e contare le cellule diluendo ad una diluizione finale di 1/200 in Trypan Blue. </li><li> Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 min a 20 ° C e risospendere il pellet in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 integrato con 2 mM L-glutammina e 100 ug / ml PenicIllin-streptomicina avere 7 x 10 6 PBMC per pozzetto in 2 ml di mezzo in ogni pozzetto di una piastra a pozzetti 6. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 ore. Dopo 2 ore monociti avranno aderito alla plastica. </li><li> Per consentire monociti appena isolati di differenziarsi in hMDMs, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml hMDM media (RPMI 1640, il 10% decomplemented siero fetale di vitello (FCS), 2 mM L-glutammina e l&#39;1% di penicillina-streptomicina) integrato con ricombinante umano macrofagi fattore stimolante le colonie (RHM-CSF) ad una concentrazione finale di 10 ng / ml. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 11 giorni (Figura 1). </li><li> Al giorno 11 rimuovere il supporto e lavare 2 volte con 2 ml di terreno hMDM freddo per pozzetto. Successivo lavare i pozzetti 2 volte con 1 ml di freddo 1x PBS. </li><li> Per staccare hMDMs completamente differenziate, lavare ogni tempo ben 1 con 1 ml di freddo 1x PBS con 2 mm di acido ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) e incubare le cellule in 2 ml di PBS freddo 1x con 2 mM EDTA per pozzetto per 15-60 minuti a 4 ° C. NOTA: Metodi alternativi per staccare esistono le cellule (ad esempio, tripsina o attività tripsina-simile) che potrebbe dare buoni risultati 11. </li><li> Dopo il distacco (completato pipettando gentilmente su e giù nel pozzo), raccogliere le cellule e metterli in un tubo da 50 ml in ghiaccio contenente 10 ml di terreno hMDM freddo. </li><li> Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 min a 20 ° C, risospendere il pellet in 10 ml di terreno hMDM fredda, e contare le cellule diluendo 1/20 in Trypan Blue. </li><li> Seme le cellule a 1 x 10 6 hMDMs a 35 millimetri di vetro microscopia grade piatto fondo e incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 1 giorni. </li></ol> 2. Produzione e quantificazione di HIV-1 Stocks virali NOTA: NLR4.3 HIV-1 gag-iGFP (Green Fluorescent Protein) che trasportano una busta R5-tropico, dono di M. Schindler 10 viene utilizzato per infettare i macrofagi e le cellule infette vedere in tempo reale. <ol><li> Produrre stock virali mediante trasfezione delle cellule embrionali umane del rene 293T (2 x 10 6 in 100 millimetri piatto) con 6 ug del corrispondente DNA provirale utilizzando un reagente di trasfezione commerciale. </li><li> Quantificare l&#39;infettività delle riserve di virus utilizzando le cellule indicatore HeLa TZM-bl (recanti il ​​gene beta-galattosidasi sotto il controllo di HIV-1 LTR) utilizzando diluizioni seriali dei titoli virali seguita da una colorazione ß-galattosidasi delle cellule e il conteggio le cellule di blu 12. </li></ol> 3. L&#39;infezione di hMDMs con HIV-1 <ol><li> Aggiungere il virus ad una molteplicità di infezione (MOI) 0,02-0,03 in 1 ml di terreno hMDM per hMDMs (cellule placcati in 1.13). Per controllare pozzetti aggiungere solo 1 ml di terreno hMDM e incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 giorni (Figura 1). </li><li> Al giorno 2 Lavare le cellule con hMDM medIUM 3 volte e aggiungere 1 ml di terreno hMDM fresco per ogni piatto. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 6 giorni (Figura 1). </li></ol> 4. Opsonizzazione di pecore Globuli rossi <ol><li> Per la preparazione di 7 x 10 6 GRP che per piatto, lavare i GRP che due volte con 100 ml di soluzione contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS 1x con centrifugazione a 600 xg per 4 min. </li><li> Risospendere le GRP che lavata in 500 microlitri 1x PBS / BSA 0,1% con IgG di coniglio anti-GRP che ad una concentrazione sub-agglutinante per 5 ml di GRP che e incubare con rotazione a temperatura ambiente per 30 min. NOTA: per determinare la concentrazione sub-agglutinante di anti-GRP che IgG, preparare diluizioni seriali di IgG (magazzino di concentramento di 13,1 mg / ml) da 1/50 a 1 / 25.600 in 20 microlitri in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 2 x 10 6 GRP che in 20 microlitri di ogni bene e mettere il piatto in una stanza buia durante diverse ore. La concentrazione sub-agglutinante è ildiluizione del pozzo poco prima del bene con agglutinazione (IgG + GRP che formano una rete). </li><li> Dopo la rotazione, centrifugare le-GRP che IgG-opsonizzati a 600 xg per 4 minuti e lavare con 100 ml di 1x PBS / BSA 0,1% con centrifugazione a 600 xg per 4 minuti. </li><li> Risospendere le-GRP che IgG-opsonizzati in media pre-riscaldato rosso fenolo-libero RPMI integrato con 2 mM L-glutammina e l&#39;1% di penicillina-streptomicina (1 ml / piatto). </li></ol> 5. cellulare dal vivo microscopio video fagocitosi Assay <ol><li> Utilizzare un sistema di imaging confocale come un sistema disco rotante dotato di una camera di riscaldamento a 37 ° C con CO 2 passa attraverso una bottiglia con acqua per umidificazione. </li><li> Accendere la camera di riscaldamento prima dell&#39;esperimento di avere palco microscopio a 37 ° C prima dell&#39;inizio del saggio fagocitosi. Accendere il microscopio e il computer, e caricare il software di imaging. </li><li> Ottimizzare le impostazioni di imaging come la velocità di scansione, magnification, risoluzione, ecc avere almeno una cella per campo e all&#39;immagine un fotogramma ogni minuto tra 60 a 120 min. NOTA: Qui, il campione viene ripreso un fotogramma ogni minuto durante 60 minuti con 63X lente. </li><li> Porre la capsula di imaging sul palco microscopio. Regolare la messa a fuoco e la posizione per trovare una sola intera HIV-1 macrofagi infettati nel campo. Utilizzare le impostazioni di eccitazione / emissione appropriate in base al sistema di imaging utilizzata e sonda. Includere un canale luminoso campo (BF) per osservare phagosomes (Figura 1ii). Ottimizzare l&#39;aspetto delle diverse immagini del canale regolando la percentuale di tempo di luce e l&#39;esposizione trasmessa. NOTA: Qui, NLR4.3 HIV-1 gag-iGFP è stato eccitato con un laser a 491 nm con 50 msec di tempo di esposizione con il 20% di laser (Figura 1i). </li><li> Rimuovere il piatto di imaging e aggiungere 1 ml di sospensione SRBC a 7 x 10 6 / ml GRP che al piatto (Figura 1). </li><li> Centrifugare a 500 xg per2 min a RT per sincronizzare fagocitosi, registrare il tempo alla fine di questa centrifugazione e tornare il piatto allo stadio. </li><li> Ottimizzare la messa a fuoco e cattura GFP e immagini BF in Z-stack (tutto lo spessore della cella con un passo distanza di 0,3 micron - solitamente 20 aerei) ogni minuto per almeno 1 ora. Salvare il video time-lapse nel file-formato nativo del sistema di imaging utilizzato. NOTA: Qui, filmati time-lapse sono stati salvati nel formato nativo, i file * .stk. </li></ol> 6. L&#39;analisi dei filmati time-lapse <ol><li> Per l&#39;editing video, fare clic sul menu a discesa &quot;Apps&quot; e nella scheda &quot;Review Multi Dimensional Data&quot; nel software di editing video. <ol><li> Per aprire il file, cliccare su &quot;Seleziona file base&quot; e poi su &quot;Seleziona Directory&quot;. Nella casella &quot;Set di dati&quot;, selezionare l&#39;acquisizione da analizzare (in formato .nd) e cliccare su &quot;Visualizza&quot;. I dati sono rappresentati in una tabella nel tempo in una colonnad Z-piano in linea. </li><li> Per rappresentare l&#39;infezione in un Z-proiezione (Figura 2, i pannelli di sinistra), selezionare 491 nm di lunghezza d&#39;onda nella casella &quot;lunghezze d&#39;onda&quot; e fare clic sulla scheda &quot;proiezione Z&quot; con &quot;tutti i piani&quot;. </li><li> Per analizzare una sequenza temporale, selezionare la lunghezza d&#39;onda BF nella casella &quot;lunghezze d&#39;onda&quot; e scegliere il piano ottimale su l&#39;asse Z per distinguere GRP che esterni (Figura 2, punta di freccia rossa), GRP che interni (Figura 2, cerchio rosso) e il nucleo ( Figura 2, cerchio blu). </li><li> Per salvare i montaggi video, cliccare su &quot;Selezione [di X] scheda&quot; e poi su &quot;Load Image (s)&quot;. Infine, salvare le immagini caricate in formato tif e aprirli prossima sul software ImageJ. </li></ol></li><li> Utilizzare il plug &quot;Manual Tracking&quot; sul software ImageJ per misurare la posizione del nucleo e le diverse phagosomes osservate nel canale BF (Figura 3). <ol><li> Download il plugin &quot;Allineamento manuale&quot; sul sito web ImageJ. Su ImageJ, aprire il plugin e la sequenza di immagini da analizzare (Figura 3, punti 1 e 2). </li><li> Inserire le impostazioni quali &quot;Intervallo di tempo&quot;, che rappresenta quantità di tempo tra i fotogrammi adiacenti, e la &quot;taratura x / y&quot;, che rappresenta la distanza per pixel (Figura 3, punto 3). NOTA: Qui, salvare la sequenza di immagini con un intervallo di tempo di 1 min tra ogni fotogramma e x / y calibrazione di 0,205 micron perché lo zoom 63X e una fotocamera con dimensioni pixel di 6,45 x 6,45 micron 2 vengono utilizzati. </li><li> Per avviare il monitoraggio, cliccare su &quot;Add Track&quot; (Figura 3, punto 4) e fare clic su un centro di SRBC a la prima volta quando viene interiorizzato. Il fotogramma successivo appare automaticamente. </li><li> Continuare a fare clic sul centro SRBC in tutti i fotogrammi di avere posizioni diverse nel corso del tempo (figura 3, passo 6 nel riquadro rosso). <ol><li> Iniziare a monitorare il nucleo che la sua posizione in tutti i fotogrammi facendo clic sul suo centro. Traccia successiva le phagosomes (cliccando sul suo centro) uno per uno, al momento (frame) della loro internalizzazione, diversa in funzione della GRP che. Per comodità di vedere SRBC sul canale BF, utilizzare la finestra &quot;Luminosità e contrasto&quot; durante l&#39;inseguimento (Figura 3, punto 5). </li></ol></li><li> Tra ogni monitoraggio SRBC, cliccare su &quot;Add Track&quot; (Figura 3, punto 4) per avere una nuova traccia. Il numero di inseguimento sarà cambiata nella seconda colonna, &quot;Track n °&quot; della tabella dei risultati (Figura 3, punto 6). </li><li> Salvare i dati in un foglio di continuare alla fase successiva dell&#39;analisi. </li></ol></li><li> Utilizzare il software foglio di calcolo per calcolare la distanza percorsa di fagosomi contenenti GRP che verso il nucleo e la velocità dei phagosomes durante i primi 5 minuti dopo l&#39;internalizzazione di GRP che (Fifigura 4). <ol><li> Aprire la tabella foglio di calcolo e un nuovo file di foglio di calcolo. Trasferire in questo nuovo file solo i seguenti parametri, il tempo, gli assi X e Y coordinate del nucleo e tutti i GRP che (figura 4a). </li><li> Per calcolare la distanza tra GRP che il nucleo e con solo loro coordinate, considerare il nucleo e un SRBC in un piano XY coordinata (Figura 4B). NOTA: La distanza tra due punti è la lunghezza del percorso che li collega. Nel piano, la distanza tra SRBC e il nucleo è dato dal teorema di Pitagora. <ol><li> Se c (la distanza tra il nucleo e il SRBC) indica la lunghezza dell&#39;ipotenusa e ae b indicano le lunghezze degli altri due lati, esprimere teorema di Pitagora &#39;come equazione di Pitagora: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> NOTA: Allo stesso tempo, il ortonormale, la distanza orizzontalea è (x nucleo -x SRBC) e la distanza verticale b è (y nucleo -y SRBC). </li><li> Così, calcolare la distanza tra il nucleo e il SRBC (Figura 4A, scatola viola) da: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> NOTA: Moltiplicare il valore della distanza ottenuto (in pixel) mediante calibrazione x / y di avere distanza in micron. Qui, la calibrazione x / y è 0,205 micron. </li><li> Ad ogni volta, sottrarre la distanza tra il nucleo e il SRBC alla distanza iniziale (Figura 4C). </li><li> Tracciare la misura contro il tempo per il primo 5 min. Applicare un trend-line lineare (Figura 5A) per la trama e determinare la pendenza della linea di tendenza lineare che rappresenta la velocità phagosome verso il nucleo durante i primi 5 minuti dopo l&#39;internalizzazione SRBC. </li><li> Collazionare i dati per calcolare l&#39;errore medio e statistica dii valori di velocità e li trama in forma adeguata utilizzando il software appropriato (Figura 5B). </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Toyohara, A., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica ha diversi passaggi critici. In primo luogo, la preparazione di hMDMs e l&#39;infezione da HIV-1 è critico poiché la percentuale di infezione è donatore dipendente. Da notare, abbiamo deciso di utilizzare macrofagi che non sono polarizzati in vitro prima dell&#39;infezione, perché lo stato macrofagi potenzialmente incontrate dal virus in vivo non è stata ben caratterizzata finora. Abbiamo controllato l&#39;espressione di diversi marcatori di superficie, il che indica che i macrofagi M1 n...

I macrofagi svolgono un ruolo importante nel sistema immunitario innato e nell'omeostasi. Sono fagociti professionali che internalizzano ed eliminano agenti patogeni e detriti mediante un processo chiamato fagocitosi 1,2. Il fagosoma, il compartimento chiuso che si forma dopo l'inghiottimento di materiale particellare, subisce una serie di eventi di fusione e fissione con i compartimenti endocitici, portando a un compartimento degradativo chiamato fagolisosoma. Questo compartimento ha un pH acido, dovuto all'acquisizione di v-ATPasi che pompano protoni, contiene enzimi idrolitici ed è arricchito in proteine di membrana associate ai lisosomi (LAMP). La maturazione dei fagosomi è accompagnata dalla loro migrazione sui microtubuli 3,4 verso il centro cellulare per raggiungere una posizione perinucleare dove si accumulano i lisosomi.
Molti agenti patogeni sono stati segnalati per dirottare la maturazione dei fagosomi, inclusi batteri con stili di vita intracellulari che modificano l'ambiente vacuolare in cui risiedono 5. Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1 prende di mira i macrofagi oltre alle cellule T. Poiché i macrofagi sono resistenti agli effetti citopatici del virus, a differenza delle cellule T, possono essere considerati un serbatoio per il virus. Inoltre, i macrofagi infettati da HIV-1 mostrano funzioni fagocitiche difettose e contribuiscono all'insorgenza di malattie opportunistiche. In particolare, la grave malattia invasiva da Salmonella non tifoide causata da Salmonella Typhimurium ST313 è stata prevalente negli ultimi tre decenni nei bambini o negli adulti dell'Africa subsahariana infettati da HIV 6. È stato stimato che il rischio di sviluppare la tubercolosi è più di 20 volte maggiore nelle persone che vivono con l'HIV rispetto a quelle senza infezione da HIV. 
Per tutti questi motivi, è importante definire meglio i meccanismi molecolari alla base dei difetti fagocitici nei macrofagi infetti da HIV. Abbiamo dimostrato che l'assorbimento di materiale particellare, particelle opsonizzate, batteri o funghi, è stato inibito nei macrofagi infetti da HIV 7. Dato che questa inibizione è parziale, ci siamo quindi proposti di analizzare il destino dei fagosomi internalizzati nei macrofagi umani infetti da HIV 8. Poiché la maturazione dei fagosomi è strettamente connessa con la migrazione verso il centro cellulare e la fusione con i lisosomi, un difetto nella maturazione fagosomiale può essere dovuto a modifiche delle modalità di traffico nella cellula infetta. Il metodo qui descritto utilizza i globuli rossi di pecora opsonizzati con IgG (IgG-SRBC) come modello per colpire la fagocitosi mediata dal recettore e in particolare i recettori per la porzione Fc delle immunoglobuline (FcR). Queste particelle sono più facili da visualizzare in campo chiaro (BF) rispetto alle perle di lattice perché le SRBC extracellulari e intracellulari mostrano diverse proprietà di rifrazione 9. Per misurare la velocità dei fagosomi che si muovono verso il nucleo nei macrofagi infetti da HIV, abbiamo utilizzato un virus fluorescente 10 e abbiamo impostato un semplice metodo di tracciamento manuale descritto qui. Il metodo non richiede una programmazione avanzata e utilizza semplicemente ImageJ. È suscettibile alle cellule aderenti e a qualsiasi tipo di particella o agente patogeno che può essere visualizzato con la microscopia a campo chiaro o con l'imaging fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm Piastra per colture cellulari trattate con TC Corning</td><td></td><td>353003</td><td>Per la produzione virale</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro 35 mm non rivestite 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Custodia</td><td>Per l'acquisizione</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali Falcon a 6 pozzetti</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>Per macrofagi umani derivati da monociti</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>un polisaccaride idrofilo neutro, altamente ramificato, ad alta massa, in soluzione per centrifugazione per densità</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquido (ad alto glucosio)</td><td>GIBCO, Sonde molecolari</td><td>31966-021</td><td>Conservato a 4 &deg; C ; per coltura di cellule HEK</td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreno GLUTAMAX&nbsp; Supplemento</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td>Conservato a 4 gradi C; per colture hMDM</td></tr><tr><td>F&oelig; Siero per vitelli (FCS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>Conservato a -20 &deg; C ; decomplementato</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Conservato a -20 &deg; C ; per colture hMDM</td></tr><tr><td>Terreno RPMI 1640, senza rosso fenolo (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso; per test di fagocitosi</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione FuGENE6</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Conservato a 4 gradi C ; per la produzione virale</td></tr><tr><td>Globuli rossi di pecora (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conservato in tampone Alsever a 4 gradi; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Globuli rossi anti-pecora IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Frazione di shock termico dell'albumina sierica bovina, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Microscopio invertito DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Spinning Disk Unit&nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW laser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>Obiettivo ; Ingrandimento 100X ; Apertura numerica 1,40 ; Olio da immersione</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire)</td><td>Fotometria</td><td></td><td>della fotocamera Dimensione pixel 6,45 &; micro; m x 6,45 &micro; m ; Definizione 1.392 x 1.040 ; Codifica dell'immagine nel</td></tr><tr><td>software Metamorph 7.7.5</td> a 14 bit <td>Dispositivi</td><td></td> molecolari <td>Per il controllo del microscopio</td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>Per l'analisi statistica</td></tr></tbody></table>

migrazione phagosome e velocità misurata in live primarie macrofagi umani infettati con hiv-1

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

I macrofagi sono cellule fagocitiche che svolgono un ruolo importante all'incrocio tra l'immunità innata e quella specifica. Possono essere infettati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1 e, a causa della loro resistenza ai suoi effetti citopatici, possono essere considerati serbatoi virali persistenti. Inoltre, i macrofagi infetti da HIV mostrano funzioni difettose che contribuiscono allo sviluppo di malattie opportunistiche.
L'esatto meccanismo con cui l'HIV-1 altera la risposta fagocitaria dei macrofagi era sconosciuto. In precedenza avevamo dimostrato che l'assorbimento di vari materiali particellari da parte dei macrofagi era inibito quando venivano infettati da HIV-1. Questa inibizione era solo parziale e i fagosomi si sono formati all'interno dei macrofagi infetti da HIV. Pertanto, ci siamo concentrati sull'analisi del destino di questi fagosomi. La maturazione dei fagosomi è accompagnata dalla migrazione di questi compartimenti verso il centro cellulare, dove si fondono con i lisosomi, generando fagolisosomi, responsabili della degradazione del materiale ingerito. Abbiamo utilizzato i globuli rossi di pecora opsonizzati con IgG come bersaglio per la fagocitosi. Per misurare la velocità del movimento centripeto dei fagosomi nei singoli macrofagi infetti da HIV, abbiamo utilizzato una combinazione di microscopia confocale a campo chiaro e a fluorescenza. Abbiamo stabilito un metodo per calcolare la distanza dei fagosomi verso il nucleo, e quindi per calcolare la velocità dei fagosomi. Le cellule infette da HIV sono state identificate grazie a un virus che esprime GFP, ma il metodo è applicabile a cellule non infette o a qualsiasi tipo di infezione o trattamento.

FCR-mediata fagocitosi da parte hMDMs HIV-1-infetti e non infetti è descritto qui utilizzando GRP che IgG-opsonizzati come bersagli modello (Figura 1). I passaggi critici di questo protocollo sono la preparazione del hMDMs e l&#39;infezione da HIV-1. Infatti, la resa e la qualità dei macrofagi differenziati varia tra i donatori, così come il tasso di infezione con efficienze nell&#39;intervallo 10-40%. Inoltre, la preparazione di IgG-opsonizzati-GRP che è anche important...

Descriviamo un metodo per misurare la velocità dei fagosomi che si muovono verso il centro cellulare in cellule viventi infettate con o senza il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) di tipo 1, utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale a disco rotante per identificare le cellule infette fluorescenti e la microscopia a campo chiaro per rilevare i fagosomi.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

L'obiettivo generale di questa analisi è quantificare la velocità dei fagociti nei macrofagi infettati dal virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) utilizzando un semplice metodo di tracciamento manuale. Il vantaggio di questo protocollo consiste nel fornire un metodo agevole per calcolare i movimenti relativi di gruppi di oggetti all'interno di una cellula, che possono essere in movimento o deformarsi. Questo metodo permette di ottenere informazioni sul movimento dei fagociti nei macrofagi infetti positivi per la GFP, ma potrebbe essere utilizzato anche per altri compartimenti intracellulari in cellule marcate con fluorescenza.Dopo aver infettato i macrofagi derivati dai monociti umani e opsonizzato le cellule del sangue di pecora, secondo il protocollo descritto, impostare un saggio di fagocitosi utilizzando un sistema di imaging confocale, come un microscopio a disco rotante, dotato di una camera riscaldata a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica. Prima dell'esperimento, accendere la camera riscaldata per portare il piano del microscopio a 37 gradi Celsius. Successivamente, accendere il microscopio e il computer, e avviare il software di imaging.Ottimizzare le impostazioni di acquisizione delle immagini, come velocità di scansione, ingrandimento, risoluzione, ecc., in modo da avere almeno una cellula per campo e acquisire un fotogramma ogni minuto tra i 60 e i 120 minuti. Posizionare la piastra per imaging sul palchetto del microscopio. Regolare la messa a fuoco e la posizione per individuare un singolo macrofago infetto da HIV-1 intero nel campo. Utilizzare impostazioni di eccitazione e di emissione adeguate in base al sistema di imaging e alla sonda utilizzati. Includere un canale in campo chiaro. Ottimizzarne l'aspetto regolando il tempo di esposizione.Successivamente, rimuovere la piastra per imaging e aggiungere un millilitro di sospensione di globuli rossi di pecora, o SRBC, a sette decimi alla sesta di SRBC per millilitro, alla piastra. Centrifugare la piastra a 500 ×g per due minuti a temperatura ambiente per sincronizzare la fagocitosi, quindi registrare il tempo al termine della centrifugazione e reinserire la piastra sul palchetto. Ottimizzare il fuoco e impostare l'inizio e la fine dello stack con una distanza tra i passi di 0,3 micrometri.Avviare l'acquisizione degli stack Z delle immagini GFP e BF attraverso tutta la spessore della cellula e salvare il video in time-lapse nel formato file nativo del sistema di imaging. Per eseguire la modifica del video, nel software di editing video, fare clic sul menu a discesa Applicazioni e sulla scheda Rivedi Dati Multidimensionali. Per aprire il file, fare clic su Seleziona File di Base, quindi su Seleziona Directory.Nella casella Set di dati, selezionare l'acquisizione da analizzare e fare clic su Visualizza. Per rappresentare l'infezione in una proiezione Z, nella casella Lunghezze d'onda, selezionare la lunghezza d'onda di 491 nanometri e fare clic sulla scheda proiezione Z con tutti i piani. Successivamente, per analizzare una sequenza temporale, nella casella Lunghezze d'onda selezionare la lunghezza d'onda BF e scegliere il piano ottimale sull'asse Z per distinguere gli eritrociti ovini (SRBC) esterni, gli SRBC interni e il nucleo.Salvare i montaggi video facendo clic sulla scheda Selezione Xs e quindi su Carica immagini. Infine, salvare le immagini caricate in formato tif. Dopo aver scaricato il plugin di tracciamento manuale di Image J, aprire il plugin in Image J, quindi aprire la sequenza di immagini da analizzare.Immettere le impostazioni, come l'intervallo di tempo, che rappresenta la quantità di tempo tra fotogrammi adiacenti, e la calibrazione XY, che rappresenta la distanza per pixel. Per iniziare il tracciamento, fare clic su Aggiungi tracciato e quindi sul centro di un globulo rosso al primo istante in cui viene internalizzato. Il fotogramma successivo appare automaticamente.Per comodità, per visualizzare le SRBC nel canale BF, utilizzare la finestra di luminosità e contrasto durante il tracciamento. Continuare a fare clic sul centro delle SRBC in tutti i fotogrammi per ottenere diverse posizioni nel tempo. Tra un tracciamento e l'altro delle SRBC, fare clic su Fine Tracciamento e quindi su Aggiungi Tracciamento per iniziare un nuovo tracciamento.Il numero di tracciamento verrà modificato nella seconda colonna della tabella dei risultati. Iniziare a tracciare il nucleo per ottenerne la posizione in tutti i fotogrammi, cliccando sul suo centro come fatto in precedenza. Salvare i dati in un foglio elettronico, aprirlo con un software per fogli di calcolo e creare un nuovo file di foglio elettronico.Trasferire in questo nuovo file il tempo e le coordinate X e Y dei globuli rossi di montone (SRBC) e del nucleo. Infine, utilizzare il software per fogli di calcolo per calcolare la distanza percorsa dai fagosomi contenenti SRBC in direzione del nucleo e la velocità dei fagosomi durante i primi cinque minuti successivi all'internalizzazione degli SRBC, come indicato nel protocollo. L'analisi del movimento dei fagosomi in macrofagi viventi infettati da HIV, effettuata in tempo reale mediante microscopia confocale a disco rotante, è mostrata qui.Le impostazioni del canale in campo chiaro sono fondamentali per visualizzare il nucleo e per discriminare gli eritrociti di montone (SRBC) esterni da quelli internalizzati. Questo grafico mostra la distanza percorsa da un fagosoma in HMDM non infetti nei primi cinque minuti successivi all'internalizzazione di un SRBC, in funzione del tempo. La velocità del fagosoma corrisponde alla pendenza della curva di regressione lineare mostrata qui.Infine, in questo studio, si è osservato che la velocità del fagosoma durante i primi cinque minuti successivi all'internalizzazione nei macrofagi derivati da monociti umani (HMDM) infettati da HIV è inferiore rispetto ai macrofagi non infetti. Questi metodi hanno dimostrato che il movimento del fagosoma verso il centro della cellula, e quindi la sua maturazione in fagolisosomi, era compromesso nei macrofagi infettati da HIV. Dopo l'acquisizione, una singola cellula può essere ulteriormente processata per microscopia elettronica correlativa oppure l'intera popolazione cellulare può essere fissata per l'analisi mediante microscopia a immunofluorescenza classica e analisi statistica.La fagocitosi è molto sensibile alla temperatura e pertanto la temperatura all'interno della camera di riscaldamento e del mezzo nella piastra di coltura deve essere mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius durante tutta la procedura. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come lavorare in una stanza a norma di biosicurezza e indossare dispositivi di protezione individuale, in conformità alla normativa locale.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.

Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

Scopri come misurare la velocità dei fagosomi in macrofagi umani infettati con HIV-1 utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo permette di tracciare il movimento cellulare in tempo reale.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

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