Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

L'obiettivo generale di questa analisi è quantificare la velocità dei fagociti nei macrofagi infettati dal virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) utilizzando un semplice metodo di tracciamento manuale. Il vantaggio di questo protocollo consiste nel fornire un metodo agevole per calcolare i movimenti relativi di gruppi di oggetti all'interno di una cellula, che possono essere in movimento o deformarsi. Questo metodo permette di ottenere informazioni sul movimento dei fagociti nei macrofagi infetti positivi per la GFP, ma potrebbe essere utilizzato anche per altri compartimenti intracellulari in cellule marcate con fluorescenza.

Dopo aver infettato i macrofagi derivati dai monociti umani e opsonizzato le cellule del sangue di pecora, secondo il protocollo descritto, impostare un saggio di fagocitosi utilizzando un sistema di imaging confocale, come un microscopio a disco rotante, dotato di una camera riscaldata a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica. Prima dell'esperimento, accendere la camera riscaldata per portare il piano del microscopio a 37 gradi Celsius. Successivamente, accendere il microscopio e il computer, e avviare il software di imaging.

Ottimizzare le impostazioni di acquisizione delle immagini, come velocità di scansione, ingrandimento, risoluzione, ecc., in modo da avere almeno una cellula per campo e acquisire un fotogramma ogni minuto tra i 60 e i 120 minuti. Posizionare la piastra per imaging sul palchetto del microscopio. Regolare la messa a fuoco e la posizione per individuare un singolo macrofago infetto da HIV-1 intero nel campo.

Utilizzare impostazioni di eccitazione e di emissione adeguate in base al sistema di imaging e alla sonda utilizzati. Includere un canale in campo chiaro. Ottimizzarne l'aspetto regolando il tempo di esposizione.

Successivamente, rimuovere la piastra per imaging e aggiungere un millilitro di sospensione di globuli rossi di pecora, o SRBC, a sette decimi alla sesta di SRBC per millilitro, alla piastra. Centrifugare la piastra a 500 ×g per due minuti a temperatura ambiente per sincronizzare la fagocitosi, quindi registrare il tempo al termine della centrifugazione e reinserire la piastra sul palchetto. Ottimizzare il fuoco e impostare l'inizio e la fine dello stack con una distanza tra i passi di 0,3 micrometri.

Avviare l'acquisizione degli stack Z delle immagini GFP e BF attraverso tutta la spessore della cellula e salvare il video in time-lapse nel formato file nativo del sistema di imaging. Per eseguire la modifica del video, nel software di editing video, fare clic sul menu a discesa Applicazioni e sulla scheda Rivedi Dati Multidimensionali. Per aprire il file, fare clic su Seleziona File di Base, quindi su Seleziona Directory.

Nella casella Set di dati, selezionare l'acquisizione da analizzare e fare clic su Visualizza. Per rappresentare l'infezione in una proiezione Z, nella casella Lunghezze d'onda, selezionare la lunghezza d'onda di 491 nanometri e fare clic sulla scheda proiezione Z con tutti i piani. Successivamente, per analizzare una sequenza temporale, nella casella Lunghezze d'onda selezionare la lunghezza d'onda BF e scegliere il piano ottimale sull'asse Z per distinguere gli eritrociti ovini (SRBC) esterni, gli SRBC interni e il nucleo.

Salvare i montaggi video facendo clic sulla scheda Selezione Xs e quindi su Carica immagini. Infine, salvare le immagini caricate in formato tif. Dopo aver scaricato il plugin di tracciamento manuale di Image J, aprire il plugin in Image J, quindi aprire la sequenza di immagini da analizzare.

Immettere le impostazioni, come l'intervallo di tempo, che rappresenta la quantità di tempo tra fotogrammi adiacenti, e la calibrazione XY, che rappresenta la distanza per pixel. Per iniziare il tracciamento, fare clic su Aggiungi tracciato e quindi sul centro di un globulo rosso al primo istante in cui viene internalizzato. Il fotogramma successivo appare automaticamente.

Per comodità, per visualizzare le SRBC nel canale BF, utilizzare la finestra di luminosità e contrasto durante il tracciamento. Continuare a fare clic sul centro delle SRBC in tutti i fotogrammi per ottenere diverse posizioni nel tempo. Tra un tracciamento e l'altro delle SRBC, fare clic su Fine Tracciamento e quindi su Aggiungi Tracciamento per iniziare un nuovo tracciamento.

Il numero di tracciamento verrà modificato nella seconda colonna della tabella dei risultati. Iniziare a tracciare il nucleo per ottenerne la posizione in tutti i fotogrammi, cliccando sul suo centro come fatto in precedenza. Salvare i dati in un foglio elettronico, aprirlo con un software per fogli di calcolo e creare un nuovo file di foglio elettronico.

Trasferire in questo nuovo file il tempo e le coordinate X e Y dei globuli rossi di montone (SRBC) e del nucleo. Infine, utilizzare il software per fogli di calcolo per calcolare la distanza percorsa dai fagosomi contenenti SRBC in direzione del nucleo e la velocità dei fagosomi durante i primi cinque minuti successivi all'internalizzazione degli SRBC, come indicato nel protocollo. L'analisi del movimento dei fagosomi in macrofagi viventi infettati da HIV, effettuata in tempo reale mediante microscopia confocale a disco rotante, è mostrata qui.

Le impostazioni del canale in campo chiaro sono fondamentali per visualizzare il nucleo e per discriminare gli eritrociti di montone (SRBC) esterni da quelli internalizzati. Questo grafico mostra la distanza percorsa da un fagosoma in HMDM non infetti nei primi cinque minuti successivi all'internalizzazione di un SRBC, in funzione del tempo. La velocità del fagosoma corrisponde alla pendenza della curva di regressione lineare mostrata qui.

Infine, in questo studio, si è osservato che la velocità del fagosoma durante i primi cinque minuti successivi all'internalizzazione nei macrofagi derivati da monociti umani (HMDM) infettati da HIV è inferiore rispetto ai macrofagi non infetti. Questi metodi hanno dimostrato che il movimento del fagosoma verso il centro della cellula, e quindi la sua maturazione in fagolisosomi, era compromesso nei macrofagi infettati da HIV. Dopo l'acquisizione, una singola cellula può essere ulteriormente processata per microscopia elettronica correlativa oppure l'intera popolazione cellulare può essere fissata per l'analisi mediante microscopia a immunofluorescenza classica e analisi statistica.

La fagocitosi è molto sensibile alla temperatura e pertanto la temperatura all'interno della camera di riscaldamento e del mezzo nella piastra di coltura deve essere mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius durante tutta la procedura. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come lavorare in una stanza a norma di biosicurezza e indossare dispositivi di protezione individuale, in conformità alla normativa locale.