Name: Preparazione di CD4 + Le cellule T per lanalisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri la preparazione di cellule CD4+ T per l'analisi dei gangliosidi GD3 e GD2 mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di valutare l'espressione con pochi campioni cellulari.

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Siamo grati al Dr. José Luis Daniotti per i commenti. Si ringrazia il Dr. J. Arturo Pimentel e il Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM per l'acquisizione delle immagini confocali. I.M.-D. e T.M.V.C. sono stati sostenuti da sovvenzioni 157634 e 253596 dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), dalla Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, dall'A.C. T.M.V.-C. è beneficiario di una borsa di studio (245192) da CONACYT. Ringraziamo anche il sostegno della Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Il sangue periferico da donatori sani di sesso maschile è stato ottenuto con il consenso informato e l&#39;approvazione del Comitato di Bioetica del Centro de Investigación en Dinamica Celular- Universidad Autonoma del Estado de Morelos. 1. L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di cellule T CD4 umana Naïve <ol><li> Raccogliere 2 ml di sangue periferico derivano da donatori umani sani attraverso il consenso informato e diluire con 2 ml di PBS sterile-EDTA (1x tampone fosfato (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Aggiungere il sangue diluito lentamente sulla cima di 3 ml di soluzione di saccarosio con 1.077 densità come precedentemente descritto 8. Nota: migrazione differenziale durante la centrifugazione causata da differenze di densità causerà eritrociti sedimentano completamente e uno strato di cellule mononucleate meno dense formerà sopra. 2 ml di sangue periferico renderanno circa 0,5 x 10 6 ingenui cellule T CD4 + dopo la purificatisui gradini. </li><li> Centrifugare 30 min a 250 xga 21 ° C (rotore uso per i tubi a fondo tondo con angolo fisso di 30 mm) senza interruzione per generare il gradiente di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Dopo centrifugazione, il PBMC può osservare chiaramente come un anello bianco. Raccogliere le PBMC con una pipetta e trasferimento in provetta sterile per il lavaggio. </li><li> Dopo tre lavaggi con soluzione PBS-EDTA a 250 xg per 10 min procedere alla purificazione di cellule T CD4 + naive. metodi di cernita o diversi tipi di kit di purificazione sono disponibili per questo scopo. Preferibilmente, utilizzare&gt; 1 x 10 7 PBMC per la purificazione. <ol><li> Purificare cellule T CD4 + naive per selezione negativa con sfere magnetiche. Eseguire la selezione negativa con l&#39;anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A) anticorpi. Valutare la percentuale di purezza attraverso la determinazione delle cellule CD4 + CD45RA + a Fbasso citometria. Nota: Facoltativamente, procedere alla incubazione delle PBMC notte a 37 ° C e 5% CO 2 con una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in 10 ml di mezzo integrato per promuovere monociti aderenza e continua con la purificazione naif cellule T CD4 +. Il recupero efficiente di cellule naïve T CD4 + da sangue periferico dipende in gran parte il sistema di depurazione. </li></ol></li><li> Preparare 24-pozzetti di coltura cellulare aggiungendo 250 microlitri per pozzetto di PBS con 5 mg / ml anticorpo monoclonale anti CD3 e incubare per almeno 2 ore a 37 ° C. Nota: Piastre con 96 pozzetti possono essere utilizzati quando si utilizzano un numero minore di cellule T CD4 + naive (ad esempio, 2 x10 4 -1 x 10 5). </li><li> Rimuovere l&#39;anti diluizione degli anticorpi CD3 dal 24 bene o 96 pozzetti e lavare i piatti due volte con sterile PBS 1x. </li><li> Diluire le cellule naive T CD4 + con&gt; 95% di purezza (CD4 +CD45RA +) ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in advanced terreno RPMI 1640 supplementato con 3% di siero fetale bovino (o RPMI supplementato con 10% di siero), 2 mM glutammina e antibiotici (1 U / ml di penicillina, 1 ug / ml di streptomicina). Nota: Se è richiesta la localizzazione ganglioside in PBMC, seguire lo stesso protocollo per la diluizione e la stimolazione come descritto di seguito. </li><li> Aggiungere 500 ml di diluizione cella per pozzetti anti-CD3 rivestiti e non rivestiti pozzetti (cellule di controllo) nella piastra 24 pozzetti. In alternativa, aggiungere 100 ml di diluizione cella per i pozzetti della piastra da 96 pozzetti. </li><li> Completare le condizioni di stimolazione delle cellule T CD4 + naive nei pozzi anti-CD3 rivestiti con l&#39;aggiunta di 1 mg / ml di anticorpi anti CD28. </li><li> Mantenere le riposo cellule T CD4 + il controllo nei pozzetti non rivestiti, senza aggiunta di anticorpi anti CD28. Incubare il riposo e attiva cellule T CD4 + per 0 72 ore in condizioni standard di 37 °C e 5% di CO 2. </li><li> Per verificare l&#39;attivazione adeguata valutare mediante citometria a flusso l&#39;espressione del marcatore precoce attivazione CD69 (16 ore post-attivazione) o marcatore di attivazione ritardo CD25 (48 ore post-attivazione) in riposo e attivato ingenui cellule T CD4 + incubate a 37 ° C e il 5% di CO 2 in assenza o presenza di anticorpi anti CD3 / CD28 anticorpi 9,10. </li></ol> 2. L&#39;aderenza del Riposo e Attivato cellule T CD4 Naïve <ol><li> Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave e l&#39;esposizione ai raggi UV per almeno 15 min. </li><li> Luogo coprioggetto in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti sterili. Nota: Per le culture con meno di 1 x 10 5 cellule è preferibile utilizzare camere di scorrimento con pozzetti adattate per evitare la dispersione delle cellule del vetrino. </li><li> coprioggetto Coat (o camera di scorrimento) con 200 ml di poli-L-lisina (MW 150-300 KDa) 0,1% (w / v) e incubare per 5 minuti a rtemperatura OOM (RT), rimuovere e asciugare per almeno 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare con cura e raccogliere il riposo e le cellule T CD4 + naive attivati dalle piastre da 24 pozzetti. Contare le cellule e, se necessario, regolare con terreno fresco integrato per trasferire 1 x 10 5 cellule per i vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Incubare le cellule per un minimo di 6 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. La raccolta e la fissazione di Riposo e attivato cellule naive T CD4 + <ol><li> Rimuovere con attenzione il supporto dal riposo colto e cellule T CD4 + naive attivati. </li><li> Aggiungere 500 ml di RT PBS sterile lentamente. Nota: attenta aggiunta e la rimozione di soluzioni da pozzi impedisce il distacco delle cellule dal vetrino. </li><li> Eliminare il PBS e aggiungere un altro 500 microlitri di PBS per rimuovere completamente terreni di coltura. </li><li> Fissare le cellule mediante aggiunta di 500 microlitri filtrata 4% paraformaldeide (filtrazione rimuove microparticelle che possono interferire con l&#39;analisi al microscopio) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (preferito) o per una notte a 4 ° C. Attenzione: Paraformaldeide è un composto tossico e volatile. E &#39;noto per essere cancerogeno per l&#39;uomo. Usare con cautela con un adeguato protocollo di sicurezza. </li><li> Rimuovere il fissativo e lavare almeno due volte con PBS a temperatura ambiente. </li><li> Procedere alla fase successiva o mantenere i pozzetti della piastra con 500 ml di PBS a 4 ° C per diversi giorni fino a colorazione. Nota: La sterilità durante questo processo consente di evitare la crescita di microrganismi. </li></ol> 4. La colorazione, montaggio e visualizzazione per Microscopia confocale <ol><li> Rimuovere la PBS dai pozzetti. Aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio freddo (1x PBS, 0,5% qualità standard di albumina sierica bovina, 1% di siero fetale bovino pH 7,4). Incubare per 20 min in ghiaccio. </li><li> Rimuovere con attenzione il tampone di bloccaggio e aggiungere gli anticorpi primari (gangliosidi anti-GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),PE-coniugato contro CD25 e APC-coniugato contro TCR e isotipi controlli diluiti in tampone di bloccaggio a 2,5 mg / ml. </li><li> Incubare 2 ore sul ghiaccio o una notte a 4 ° C. Nota: lenta agitazione orbitale è preferibile. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo con attenzione e aggiungere lentamente 500 ml di PBS. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere gli anticorpi secondari (FITC coniugato IgG3 contro per R24 ​​contro GD3, Alexa Fluor 488 coniugato o Alexa Fluor 647 coniugato IgG2a contro per 14G2a anti- GD2) diluito in tampone di bloccaggio a 0,1 mg / ml. </li><li> Incubare per 1 ora in ghiaccio al buio senza agitare. </li><li> Lavare tre volte in PBS come descritto in 4.4). Mantenere i pozzetti con PBS sufficiente per evitare la disidratazione dei campioni. </li><li> Aggiungere Hoechst 333.258 macchia diluito in PBS a 0,1 mg / ml. </li><li> Incubare 15 minuti a temperatura ambiente e rimuovere. Lavare tre volte in PBS. </li><li> Porre i vetrini su un tovagliolo di carta e aggiungere 20 ml di soluzione di montaggio (50% glicerolo in PBS) o soluzione di montaggio commerciales per evitare lo scolorimento e tempra da campioni. </li><li> scegliere con cura il vetrino con le pinzette sottili e posizionarlo sulla soluzione di montaggio. Assicurarsi che il lato del vetrino su cui sono fissati cellule è in contatto con la soluzione. Sigillare il coprioggetto con smalto e analizzare utilizzando la fluorescenza o microscopia confocale. </li></ol> 5. L&#39;isolamento di RNA <ol><li> Preparare anticorpi anti CD3 (5 mg / ml) rivestito in piastre da 96 pozzetti. Incubare 4 x 10 4 cellule T CD4 + naive / e in 100 ml di terreno di coltura integrato con anticorpi CD28 contro (1 mg / ml) per completare lo stimolo. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 0 72 ore. </li><li> Dopo diversi tempi post-attivazione mettere le cellule in una provetta. </li><li> Aggiungere 500 ml di PBS e centrifugare a 250 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di reagente Trizol. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e conservare il campione a -8076; C per almeno 24 ore. Procedere con l&#39;isolamento di RNA quando necessario. Nota: Lasciare il campione a -80 ° C per almeno 24 ore migliora la resa RNA. Inoltre, l&#39;uso di guanti è essenziale per evitare la degradazione dell&#39;RNA da RNasi. </li><li> Scongelare il campione mediante incubazione a 37 ° C per 2 minuti in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio e agitare vigorosamente a mano per 30 sec (per evitare la miscelazione aggressiva di RNA nel vortex). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare 15 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Recuperare la fase acquosa in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 500 microlitri isopropanolo e capovolgere il tubo tre volte. </li><li> Incubare 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante per inversione. </li><li> Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo 75% di etanolo e centrifugare 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Completamente scartare il surnatante e asciugare il pellet di RNA lasciando il tappo del tubo aperto. None: A questo punto il pellet non è chiaramente visibile. Procedere comunque. </li><li> Risospendere il pellet in 20 ml di acqua di grado molecolare. Calcolare la concentrazione e la purezza di acidi nucleici misurando l&#39;assorbanza 260 nm e 280 nm usando NanoDrop. </li><li> Procedere con attenzione per la sintesi di cDNA utilizzando qualsiasi kit trascrittasi inversa convenzionale e seguendo il protocollo del produttore di. Nota: circa 0,5-2 mg di RNA è ottenuto da cellule T CD4 + 4 x 10 4 ingenuo. cDNA può essere sintetizzato da 100 ng di RNA e usati in reazioni di PCR in tempo reale senza la necessità di kit ingresso di basso RNA. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare gangliosidi o proteine in sospensioni cellulari di cellule T CD4 + o altre cellule immunitarie (ad esempio, PMBCs, Figura 5) a partire da un piccolo numero di cellule. A causa delle piccole dimensioni di cellule T e proprietà antiaderenti, l&#39;acquisizione di fluorescenza immagini microscopiche comporta informazioni scarsa o bassa qualità se le cellule non siano rispettati correttamente. Ques...

Le cellule T CD4 + orchestrare la risposta immunitaria attraverso le loro funzioni effettrici dopo l&#39;attivazione da parte delle cellule presentanti l&#39;antigene 1. Lo studio dei meccanismi cellulari che vengono modulati durante l&#39;attivazione permette spaccato un processo di base della funzione immunitaria. Tuttavia, lo studio delle cellule T CD4 + naive può essere complicato perché rappresentano una piccola frazione di cellule nella periferia del sangue 2. Attraverso la microscopia a fluorescenza diversi rapporti hanno studiato la localizzazione di diverse molecole coinvolte nella attivazione delle cellule T CD4 +, principalmente proteine associate alla membrana plasmatica 3. I gangliosidi sono glicosfingolipidi acido sialico che contiene e, anche se sono stati ampiamente studiati nelle cellule nervose dove sono abbondanti, altre cellule, come le cellule immunitarie esprimono anche gangliosidi con funzioni biologicamente rilevanti 4,5. Abbiamo precedentemente riportato that durante l&#39;attivazione delle cellule T CD4 + naive umane vi è un up-regolazione del α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 sintasi) e la sintasi GM2 / GD2, che inducono il significativo neoexpression superficie GD2 e l&#39;up-regolazione di GD3 ganglioside 6. Ulteriori studi di GD3, GD2 e altri gangliosidi nelle cellule immunitarie è necessario per completare una vista parziale a base di proteine ​​della funzione immunitaria. Comunemente, lo studio dell&#39;espressione ganglioside si basa su tecniche quali la cromatografia su strato sottile (TLC) 7, ma questa tecnica non consente la localizzazione spaziale dei gangliosidi a livello della membrana plasmatica o in compartimenti subcellulari, limitando analisi biologiche. In questo lavoro, si descrive un protocollo per l&#39;identificazione anticorpo-mediata e la localizzazione di GD3 e GD2 gangliosidi nelle cellule T CD4 + naive umani e PBMC dopo l&#39;attivazione anti-CD28 anti-CD3 /. Con questo protocollo è is anche possibile analizzare l&#39;espressione genica e molecolare di gangliosidi in un basso numero di cellule in sospensione, con l&#39;acquisizione di immagini di alta qualità 6, considerando le piccole dimensioni dei linfociti (9 micron).

<table><tbody><tr><td>RPMI avanzato 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Integrato con il 3% di</td></tr><tr><td>anticorpo CD3 umano di topo</td><td>FBS eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>di topo anticorpo CD28 umano</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>di topo anti umano GD3&nbsp; anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>di topo anti umano GD2 anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>clone 14G2a</td></tr><tr><td>anticorpo IgG3 coniugato FITC-consorte</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antitopo coniugato</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tifico</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr>anticorpo <td></td><td></td><td></td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 antitopo coniugato</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr>anticorpo <td></td><td></td><td></td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule T CD4+ Naive II,</td><td>umano MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema di scorrimento a camera Nunc Lab-tek</td> Microscopio confocale laser <td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 (Olympus)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Trolley BX61WI e IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>Primer di sequenza diretta GD3 sintasi</td><td>5&acuto;-GAGCGTTCAGGAAAACAAATGG- 3&acuto;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Primer a sequenza inversa GD3 sintasi</td><td>5&acuto;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&acute;</td><td></td><td>Rif. 7</td></tr><tr><td>Primer di sequenza diretta GM2/GD2 sintasi</td><td>5&acuto;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Primer a sequenza inversa GM2/GD2 sintasi</td><td>5&acuto;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&acute;</td><td></td><td>Rif. 7</td></tr></tbody></table>

preparazione di cd4<sup&gt; +</sup&gt; le cellule t per l&#39;analisi di gd3 e gd2 gangliosidi membrana expression al microscopio

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

I metodi qui descritti per l&#39;attivazione delle cellule T CD4 + naive in sospensione e la loro adesione a lamelle per l&#39;analisi al microscopio confocale consentono la localizzazione spaziale e la visualizzazione dei gangliosidi coinvolti nella attivazione delle cellule T CD4 +, che l&#39;espressione di complemento profiling esperimenti come la citometria a flusso, occidentale assorbente o real-time PCR. La quantificazione di espressione ganglioside tramite citometria di flusso e la loro localizzazione cellulare mediante microscopia può essere ottenuta con l&#39;uso di anticorpi anti-gangliosidi con alta affinità e specificità. Tuttavia, una adeguata gestione delle cellule in sospensione comporta il trattamento di piastre di coltura per promuovere l&#39;adesione necessaria richiesta per la fluorescenza o acquisizione microscopia confocale. In questo lavoro, si descrive un protocollo per la determinazione GD3 e GD2 espressione ganglioside e colocalization con il TCR durante l&#39;attivazione ingenuo cellule T CD4 +. Inoltre, real-tesperimenti ime PCR utilizzando &lt;40.000 cellule sono descritti per la determinazione del GD3 e geni sintasi GM2 / GD2, dimostrando che gli esperimenti di analisi gene possono essere eseguite con un basso numero di cellule e senza la necessità di ulteriori kit bassa RNA ingresso.

Il protocollo descritto in questo manoscritto rende una buona qualità di colto e di riposo aderito e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani (Figura 1). Le cellule T CD4 + attivate mostrano la caratteristica profilo proliferativa (Figura 1B) rispetto alla condizione di riposo (Figura 1A). Il marcatore di attivazione ritardo CD25 è utile per valutare l&#39;attivazione efficiente a 72 h osservato mediante microscopia c...

Descriviamo un protocollo di colorazione degli anticorpi standard per l&#39;uso in microscopia per determinare l&#39;espressione di membrana e la localizzazione di gangliosidi a riposo e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani. sono descritte anche in tempo reale esperimenti di PCR utilizzando &lt;40.000 cellule che non necessitano di ulteriori kit a basso RNA ingresso.

Preparazione di CD4<sup&gt; +</sup&gt; Le cellule T per l&#39;analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la preparazione di una sospensione di cellule T CD4+ per la colorazione al fine di visualizzare la localizzazione dei gangliosidi GD3 e GD2 sulla superficie cellulare utilizzando un numero ridotto di cellule. Questo metodo consente la visualizzazione di glicolipidi di membrana in un piccolo numero di cellule in sospensione, come nel caso delle cellule mononucleate. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di valutare l'espressione e la localizzazione dei gangliosidi in quantità ridotte di cellule T CD4+, ottimizzando l'uso del campione.Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla ricerca e alla diagnosi di alcuni tipi di leucemia a cellule T. Come abbiamo osservato, alcune linee cellulari leucemiche aumentano l'espressione dei gangliosidi GD3 e GD2. Iniziare diluendo due millilitri di sangue periferico proveniente da donatori umani sani con due millilitri di PBS EDTA sterile.Dispensare lentamente il sangue diluito sulla parte superiore di tre millilitri di soluzione di saccarosio con densità 1.077. Quindi, centrifugare per 30 minuti a 250 ×g a 21 °C senza frenata per generare il gradiente di cellule mononucleate del sangue periferico. Dopo la centrifugazione, le PBMC possono essere chiaramente osservate come un anello bianco.Raccogliere i PBMC con una pipetta e trasferirli in un tubo sterile per il lavaggio. Dopo aver lavato le cellule con PBS EDTA, purificare le cellule T CD4+ naive mediante selezione negativa con microsferette magnetiche utilizzando un kit disponibile in commercio. Una volta ottenuta una popolazione di cellule T CD4+ con purezza superiore al 95%, preparare delle piastre per coltura cellulare a 24 pozzetti aggiungendo 250 microlitri di anticorpo monoclonale anti-CD3 a cinque microgrammi per millilitro in PBS in ciascun pozzetto.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno due ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere la diluizione dell'anticorpo anti-CD3 dalle piastre e lavare due volte utilizzando PBS 1x sterile. Successivamente, diluire le cellule T naive CD4+ con mezzo RPMI 1640 avanzato integrato fino a una densità di uno per 10 alla sesta cellule per millilitro.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di cellule diluite nei pozzetti del piatto da 24 pozzetti rivestiti con anti-CD3. Completare quindi la stimolazione delle cellule T CD4+ naive nei pozzetti rivestiti con anti-CD3 aggiungendo un microgrammo per millilitro di anticorpo anti-CD28. Incubare le cellule T CD4+ a riposo e attivate da zero a 72 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Trascorso il tempo di incubazione previsto, raccogliere le cellule T naive a riposo e attivate dalle piastre a 24 pozzetti. Eseguire un conteggio cellulare e, se necessario, diluire le cellule con mezzo fresco supplementato fino a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Seminare 500 microlitri di cellule diluite nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente coprioggetti rivestiti con poli-L-lisina o una camera da coltura su vetrino e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un minimo di sei ore.Dopo l'incubazione, le cellule T CD4+ aderiranno ai coverslip. Rimuovere con attenzione il mezzo dai pozzetti e quindi aggiungere lentamente 500 microlitri di PBS sterile. L'aggiunta di PBS durante il lavaggio deve essere eseguita con molta cautela, in particolare quando si utilizzano camere a vetrino preparate con meno di 50.000 cellule per pozzetto.Aspirare il PBS e aggiungere altre 500 microlitri di PBS nei pozzetti per rimuovere completamente il mezzo di coltura. Dopo aver rimosso tutto il PBS, aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% filtrata e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule. Al termine della fissazione, rimuovere il fissativo e lavare almeno due volte con PBS.Se desiderato, la piastra può essere conservata con 500 microlitri di PBS in ciascun pozzetto per diversi giorni a quattro gradi Celsius. Prima di tutto, rimuovere il PBS dalle cellule fissate e aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante freddo. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio.Durante l'incubazione, è fondamentale non agitare vigorosamente la piastra, poiché l'agitazione potrebbe staccare le cellule. Aspirare con attenzione il buffer di blocco e aggiungere il buffer di blocco contenente 2,5 microgrammi per millilitro di uno degli anticorpi primari o anti-CD25 coniugato con PE, anti-TCR coniugato con APC o un controllo isotipico. Incubare per due ore sul ghiaccio, al riparo dalla luce, oppure durante la notte a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione la soluzione di anticorpi e aggiungere lentamente 500 microlitri di PBS. Quindi aggiungere gli anticorpi secondari appropriati, diluiti nel buffer di blocco a 0,1 microgrammi per millilitro. Proteggere dalla luce e incubare per un'ora sul ghiaccio, avendo cura di evitare agitazioni.Dopo aver lavato tre volte in PBS come in precedenza, aggiungere il colorante Hoecht diluito in PBS a 0,1 microgrammi per millilitro e incubare al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi posizionare le vetrate lavate su un tovagliolo di carta e aggiungere 20 microlitri di soluzione montante o soluzione montante commerciale per prevenire lo sbiadimento e l'oscuramento della fluorescenza. Infine, prendere un coprioggetto con pinzette fini, capovolgerlo e posizionarlo sopra la soluzione montante in modo che il lato del coprioggetto a cui sono attaccate le cellule sia a contatto con la soluzione.Sigillare i coprioggetti con smalto per unghie e analizzare mediante microscopia a fluorescenza o microscopia confocale. Questa immagine mostra la visualizzazione in campo chiaro di cellule T CD4+ fissate a 72 ore dall'attivazione. La validazione dell'attivazione efficiente dopo la colorazione viene valutata utilizzando l'anticorpo anti-CD25 mostrato in rosso.Il ganglioside GD3 è localizzato all'interno della cellula e sulla superficie delle cellule T CD4+, come valutato mediante colorazione con anticorpo anti-GD3 mostrato in verde. GD3, nuovamente mostrato in verde, non co-localizza con il TCR, mostrato nuovamente in rosso, come valutato mediante colorazione con anticorpi anti-GD3 e anti-TCR. Tuttavia, il ganglioside GD2 co-localizza con il TCR e le cellule T CD4+, come valutato mediante colorazione con anticorpo anti-GD2, mostrato in verde, e colorazione con anticorpo anti-TCR, mostrato in rosso.La colorazione del ganglioside GD3 mostra la localizzazione intracellulare e sulla superficie cellulare in un sottoinsieme di PBMC attivati. Mentre la colorazione del ganglioside GD2 mostra la localizzazione intracellulare e sulla superficie cellulare in tutti i PBMC attivati. Dopo questa procedura di adesione e manipolazione delle cellule T CD4+, possono essere eseguiti altri metodi come la colorazione dei compartimenti intracellulari per rispondere a ulteriori domande, come la localizzazione o il processamento intracellulare specifico dei gangliosidi.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come manipolare e fissare un basso numero di cellule T CD4+ per ottenere immagini di microscopia fluorescente di alta qualità da analizzare nell'espressione dei gangliosidi.

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Immunologia e Infezioni

Questa procedura dimostra la purificazione e l'espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Questo video dimostra la differenziazione in vitro del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi o delle cellule T helper produttrici di GM-CSF (THGM). Le cellule T naïve isolate sono stimolate per la differenziazione in THGM, che è confermata dal rilevamento di un'elevata produzione intracellulare di GM-CSF e di una bassa espressione di altre citochine specifiche delle cellule T helper.

Una tecnica in vitro per differenziare le cellule T helper produttrici di GM-CSF dalle cellule T naive

Questo video dimostra lo screening di composti immunomodulatori tramite test basati sulla fluorescenza. I linfociti T transgenici derivati da topi con cassette di espressione proteica fluorescente verde sono trattati con questi composti. I segnali GFP potenziati e ridotti consentono l'identificazione degli effetti stimolatori e inibitori dei composti, rispettivamente.

Un test basato sulla fluorescenza che utilizza linfociti ingegnerizzati per lo screening di composti immunomodulatori

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Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l&#39;immunità reattiva dell&#39;inferta

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