In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

L'obiettivo generale di questa tecnica è registrare l'attività nervosa afferente splancnica in vitro da un singolo fascio nervoso del digiuno o del colon in risposta a distensioni progressive e all'applicazione di composti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio se i nervi afferenti che innervano il tratto gastrointestinale risultino ipersensibilizzati o desensibilizzati in diverse condizioni patologiche. I principali vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di registrare la scarica nervosa in vitro e la capacità di quantificare l'attività nervosa senza la modulazione o gli input del sistema nervoso centrale.

L'implicazione di questa tecnica si estende alla terapia o alla diagnosi di diverse sindromi dolorose, come la sindrome dell'intestino irritabile, poiché la sensibilizzazione nervosa svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la dissezione dei fasci nervosi e l'analisi dell'unità singola del segnale registrato richiederanno un tempo considerevole di addestramento. Per iniziare questa procedura, posizionare il topo sacrificato in posizione supina.

Eseguire un'incisione mediana addominale attraverso la cute e lo strato muscolare addominale utilizzando un bisturi, estendendola dal processo xifoideo fino all'osso pubico. Successivamente, risciacquare la cavità addominale con soluzione di Krebs fredda per evitare che i tessuti intra-addominali si secchino. Quindi, asportare rapidamente l'intero tratto del digiuno utilizzando forbici affilate, rimuovendo circa 20 centimetri dell'intestino tenue a partire immediatamente dalla flessura duodeno-digiunale.

Attenzione a non danneggiare le strutture circostanti e mantenere intatto il mesentere dell'intestino tenue, che contiene i vasi sanguigni digiunali e i nervi afferenti. Successivamente, posizionare il digiuno asportato in soluzione di Krebs fredda su ghiaccio, continuando a ossigenarla con Carbigen. Quindi, tagliare il digiuno in anelli lunghi circa tre centimetri.

Individuare il fascio mesenterico contenente i vasi e il nervo splancnico vicino al centro del rispettivo anello per facilitare il montaggio dell'anello nella camera di registrazione. Successivamente, lavare ogni segmento con soluzione di Krebs utilizzando un catetere ottuso per rimuovere i contenuti luminari e il chimo, poiché contengono enzimi digestivi che accelereranno il deterioramento del campione di tessuto in vitro. Dopodiché, selezionare un segmento per misurare l'attività nervosa afferente e posizionarlo nella camera di registrazione codificata con uno strato di elastomero al silicone.

Mantenere la temperatura di Krebs nella camera di registrazione a 34 gradi Celsius. Quindi montare il segmento digiunale nel bagno d'organo, in modo che l'estremità orale sia collegata al sistema di infusione che fornisce il flusso luminale e l'estremità aborale sia collegata all'effluente. Allungare leggermente il segmento, avendo cura di non esercitare una tensione eccessiva.

Fissare saldamente entrambe le estremità utilizzando legature di seta ai connettori di ingresso e uscita. Successivamente, collegare il driver della siringa all'estremità orale e perfondere il segmento digiunale intraluminalmente con soluzione di Krebs a 10 millilitri all'ora. Fissare il mesentere del segmento intestinale montato in posizione piatta contro lo strato inferiore di elastomero di silicone.

Quindi, distendere il mesentere per ottimizzare la visualizzazione del fascio mesenterico. Successivamente, eseguire un test di distensione rampa chiudendo il porto di uscita fino a quando la pressione intraluminale del segmento intestinale non raggiunge 60 millimetri di mercurio, al fine di verificare che non vi siano perdite di soluzione di Krebs intraluminale dal segmento montato. Osservare un aumento regolare della pressione intraluminale senza interruzioni.

Si prevedano piccole contrazioni del segmento durante la fase iniziale di distensione. Se necessario, bloccare l'attività peristaltica aggiungendo un micromole del bloccante dei canali del calcio di tipo L, nifedipina, alla soluzione di Krebs. Sotto un microscopio stereoscopico, iniziare delicatamente a rimuovere il tessuto adiposo dal mesentere tirandolo con due piccole pinzette, avendo cura di non danneggiare i vasi e il nervo afferente che sono sepolti nel tessuto adiposo.

Iniziare a rimuovere il tessuto adiposo a una certa distanza dal digiuno per esporre entrambi i vasi sanguigni nel fascio mesenterico. Identificare il nervo afferente del digiuno tra i due vasi come un sottile filamento bianco incapsulato nel tessuto adiposo. Successivamente, dissezionarlo in direzione più prossimale verso il digiuno, rimuovendo delicatamente il tessuto adiposo con una pinzetta.

Successivamente, dissezionare il nervo mesenterico del segmento dell'intestino tenue rimuovendo il tessuto adiposo aderente al nervo. Recidere il nervo utilizzando forbici da tessuto affilate. Se necessario, rimuovere delicatamente anche il grasso residuo, il tessuto connettivo e la guaina epineurale tirandoli con delicatezza.

In questa procedura, utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo a suggente nel bagno d'organo. Successivamente, aspirare delicatamente un po' di soluzione di Krebs dal bagno d'organo, in modo che la punta dell'elettrodo sia immersa nella soluzione di Krebs. Assicurarsi che la soluzione di Krebs ricopra l'elettrodo metallico all'interno dell'elettrodo a suggente.

Successivamente, posizionare la punta dell'elettrodo di aspirazione immediatamente accanto al tronco nervoso afferente sezionato e aspirare l'intera lunghezza del nervo all'interno della capillare. Portare con delicatezza la punta dell'elettrodo verso il tessuto adiposo e aspirare quest'ultimo all'interno della pipetta di vetro mediante lo stantuffo, sigillando così meccanicamente il nervo all'interno della capillare rispetto al contenuto del bagno d'organo. Un sigillo adeguato della capillare di vetro rispetto alla camera di registrazione, ottenuto aspirando una certa quantità di tessuto adiposo circostante all'interno della capillare, è fondamentale per ridurre al minimo il rumore di fondo indesiderato che comprometterebbe l'analisi finale.

Per verificare la registrazione dell'attività nervosa afferente, eseguire un aumento graduale della frequenza di scarica afferente indotto da una distensione rampa chiudendo il porto di uscita in modo da provocare un incremento progressivo della pressione nel segmento intestinale. Eseguire il protocollo sperimentale desiderato solo quando tre distensioni rampa consecutive producono una scarica multunitaria riproducibile. Dopo l'isolamento del nervo, stabilizzare il preparato per 15 minuti al fine di ottenere un'attività nervosa afferente spontanea stabile prima di eseguire gli esperimenti effettivi.

Qui è mostrata una rappresentazione schematica di diverse unità di fibre afferenti in base al loro profilo meccanosensitivo. Le fibre a basso soglia mostrano prevalentemente un aumento dell'attività nervosa a basse pressioni di distensione, determinando una percentuale di LT superiore al 55%. Al contrario, le unità ad alto soglia mostrano un aumento della frequenza di scarica solo a pressioni dolorose. Le fibre con ampio range dinamico mostrano un incremento graduale dell'attività nervosa durante l'intera distensione, mentre le fibre meccanicamente insensibili non rispondono all'aumento delle pressioni di distensione.

Questa figura mostra la scarica del nervo afferente mesenterico nei topi di tipo selvaggio durante la distensione ramp. Si noti che nel profilo di distensione biphasico, l'aumento iniziale della scarica nervosa è dovuto alle fibre a basso soglia e a vasta gamma dinamica, mentre le fibre ad alto soglia e a vasta gamma dinamica contribuiscono al secondo aumento della scarica. Una volta acquisita padronanza, l'isolamento del nervo del giunoncolo e la registrazione iniziale della linea di base possono essere eseguiti in meno di un'ora se effettuati correttamente.

È necessario più tempo quando si studia l'effetto di composti somministrati nel bagno d'organo. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere un approccio ben standardizzato, come l'identificazione costante dello stesso segmento per tutti gli esperimenti. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'isolamento dei gangli delle radici dorsali con successiva imaging del calcio, al fine di valutare quali stazioni di relè nel sistema nervoso gastrointestinale siano coinvolti nella patogenesi di diverse malattie.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la patogenesi di diversi sindromi dolorosi nella ricerca gastrointestinale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i nervi afferenti del digiuno dal tratto gastrointestinale del topo e registrare l'attività durante distensioni progressive.