Name: In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Impara a registrare l'attività dei nervi afferenti splancnici in vitro da segmenti digiunali o colici del topo. Questo metodo consente di quantificare la risposta nervosa a distensioni e composti senza interferenze del sistema nervoso centrale.

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SN ha eseguito gli esperimenti descritti sopra, ha eseguito l'analisi dei dati e ha redatto il manoscritto. AD e JDM hanno implementato la tecnica presso le nostre strutture di ricerca e hanno aiutato nell'analisi dei dati. HC ha aiutato nell'esecuzione degli esperimenti. WJ, CK e DG hanno assistito nell'implementazione della tecnica di misurazione afferente nel nostro laboratorio, nell'analisi dei dati e nell'interpretazione dei risultati. SF, JDM e BDW hanno progettato lo studio. Tutti gli autori hanno letto criticamente e approvato il manoscritto finale. SN è un aspirante del Fondo per la ricerca scientifica (FWO), Fiandre (11G7415N). Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal FWO (G028615N e G034113N).

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<li>Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+and+gastrointestinal+sensory+function%3A+Altered+colonic+mechanosensory+and+chemosensory+function+in+the+aged+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse.</a> J Physiol. , (2015).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo in questo documento descrive una tecnica di laboratorio riproducibili per studiare mesenterica attività del nervo afferente nei roditori usati per il nostro gruppo e altri 3,4,7,8,12,20,21,31. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo includono l&#39;isolamento rapido del tessuto, l&#39;aspirazione del filamento nervoso nell&#39;elettrodo di aspirazione e l&#39;adeguata &#39;tenuta&#39; del capillare di vetro dal bagno per organi aspirando tessuto adiposo circostante nel capillare. L&#39;a...

segnalazione sensoriale e la percezione del dolore è un processo complesso che deriva da una complessa interazione tra nervi afferenti, i neuroni spinali, ascendente e discendente percorsi facilitatori e inibitori e diverse regioni del cervello differenti. Come tale, modifiche in uno o più di questi livelli possono provocare segnalazione sensoriale alterata e dolore viscerale negli stati di malattia. Per studiare tutti questi diversi aspetti della segnalazione sensoriale più tecniche sono state sviluppate che vanno da esperimenti sulle cellule singole (ad esempio, l&#39;imaging del calcio sui neuroni) per modelli animali interi (ad esempio, le risposte comportamentali, come la risposta visceromotoria). La tecnica descritta in questo documento permette ai ricercatori di valutare in concreto l&#39;attività del nervo afferente in vitro da un segmento isolato di piccolo intestino o colon nei roditori. In breve, un isolato segmento gastrointestinale (di solito digiuno o del colon) è montato in una camera di registrazione costruito appositamente perfusi con K fisiologicasoluzione Rebs. Il nervo splancnico è sezionato libero e collegato ad un elettrodo che permette la registrazione dell&#39;attività neuronale afferenti a nervi afferenti splancnici o pelviche. L&#39;attività del nervo può essere registrato basale o in risposta alle crescenti pressioni intraluminali e / o composti farmacologici che possono essere applicati direttamente nella camera di registrazione (serosally), o tramite il perfusato endoluminale (mucosally) per valutare il loro effetto sul discarico afferente 1-6 . Da segnalare, nervi splancnici contengono anche fibre efferenti e afferenze viscerofugal in aggiunta alle afferenze sensoriali. Uno dei principali vantaggi di ex vivo registrazione nervo splancnico è il fatto che i ricercatori possono quantificare l&#39;attività del nervo senza modulazione o ingresso dal sistema nervoso centrale, che permette di studiare l&#39;effetto diretto dei composti applicati localmente sulla attività del nervo. Inoltre, il monitoraggio dei parametri vitali, come è necessario, utilizzando l&#39;approccio in vivo (vedi sotto), è no è più rilevante. In vitro registrazione splancnico è finalmente molto meno in termini di tempo rispetto al suo omologo in vivo. Afferent attività neuronale in risposta ad altri stimoli, come mucosale carezze, tastatura utilizzando peli von Frey o allungamento del segmento, può essere studiata in una configurazione sperimentale modificata, in cui il tessuto intestinale viene immobilizzato e aperto longitudinalmente (che è in contrasto la nostra messa a punto utilizzando un segmento intatto), come è stato descritto in un numero precedente 7,8. Inoltre, solo di recente, una tecnica è stata descritta per studiare attivazione nervosa afferente del colon nella stessa parete del colon tramite l&#39;imaging di calcio, ancora una volta con un immobilizzato, longitudinalmente aperto segmento 9. Una versione alternativa di questa tecnica in vivo consiste di misurazione attivazione neuronale in prossimità dell&#39;ingresso del afferente nel midollo spinale. In breve, l&#39;animale sedato viene posto in posizione prona, exposing il midollo spinale lombosacrale cui afferente nervo progetti di interesse mediante laminectomia, costruendo una paraffina pieno pozzetto utilizzando la pelle dell&#39;incisione e copertura del rootlet dorsale su un elettrodo di platino bipolare 10,11. Questa tecnica permette inoltre ai ricercatori di caratterizzare le fibre in base al loro velocità di conduzione, e distinguono fibre C amieliniche da sottili mieliniche Aδ fibre. Inoltre, radichette dorsali contengono esclusivamente fibre afferenti sensoriali, in contrasto con i afferenti ed efferenti nervi splancnici misti citati in precedenza. Registrazione afferente scarico nervoso in vitro da segmenti intestinali isolate può anche essere fatto usando campioni umani, come due gruppi di ricerca pubblicati in modo indipendente prime-in-man manoscritti registrazione del colon attività del nervo afferente a resezione umana provini 12,13. L&#39;attuazione di questa tecnica potrebbe risultare in un più facilmente translatisu dei dati murini allo stato umano, e potrebbe consentire ai ricercatori di identificare facilmente farmaci destinati al nervo sensitivo sensibilizzata. L&#39;importanza clinica di caratterizzare l&#39;attività afferente del nervo, così come la scoperta di nuovi reagenti terapeutici che hanno come target esorbitante attività del nervo afferente, è stato elaborato discusso da molti esperti nel campo 14-19. Il suddetto tecnica in vitro integra il più comunemente noto nella misurazione vivo di attività afferente del nervo. Durante la misura attività neuronale in vivo, attività nervosa può essere misurata direttamente nell&#39;animale sedato durante il quale viene identificato il segmento di interesse e intubato in seguito, e un liquido di paraffina riempito pozzo è costruito utilizzando la parete addominale e la pelle del roditore 20. Il nervo afferente di interesse viene identificato, sezionato e posto su un elettrodo di platino bipolare, consentendo MISURE attività neuronalet. Questa tecnica permette al ricercatore di modulare l&#39;attività del nervo afferente a vivere anche se gli animali sedati; come tale, si può studiare l&#39;attività neuronale rispondere alle interferenze come distensione luminale o la somministrazione endovenosa di un composto. Ricerca traslazionale si concentra oggi principalmente sull&#39;applicazione dei surnatanti di derivazione umana (ad es., Da biopsie del colon, le cellule mononucleate del sangue periferico coltivate, ecc) su afferenze digiunali e / o del colon del mouse 21,22. I ricercatori possono applicare direttamente surnatanti o nel bagno di organo o nella soluzione endoluminale che perfuses il segmento intestinale, in modo che gli effetti differenziali della sierosa rispetto dell&#39;applicazione della mucosa possono essere studiate sul discarico nervose afferenti. Come tale, è stato dimostrato che le colon supernatans biopsia della mucosa di pazienti con sindrome dell&#39;intestino irritabile possono causare ipersensibilità nel topo afferenze del colon, cavia neuroni sottomucosi e la radice del mouse dorsalineuroni gangliari 21,23,24. Infine, la registrazione dell&#39;attività neuronale non è limitata alla mesenterica e / o neuroni pelvici innervano il tratto gastrointestinale. Altri hanno dimostrato che le registrazioni nervose possono essere eseguite in afferenti fornitura del ginocchio 25, mentre altri hanno caratterizzato vescica attività nervosa afferente e 26-28, e ha dimostrato che afferenze pelvici dalla vescica e anche il tratto gastrointestinale convergono, possibilmente con conseguente neuronale crosstalk 29.

<table><tbody><tr><td>cloruro di sodio (NaCl)</td><td>VWR Chemicals</td><td>27.810.295</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>cloruro di potassio (KCl)</td><td>Acros organics</td><td>196770010</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>diidrogeno fosfato di sodio (NaH2PO4)</td><td>VWR Chemicals</td><td>1.063.461.000</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.063.291.000</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1.058.861.000</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>23.811.000</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>VWR Chemicals</td><td>1011175P</td><td>composto Krebs soluzione</td></tr><tr><td>Composto di acqua</td><td></td><td></td> distillata <td>Soluzione di Krebs</td></tr><tr><td>Tubi in PVC</td><td>Forniture</td><td></td> per laboratori scientifici <td>Il segmento intestinale deve essere montato su tubi in PVC</td></tr><tr><td>Tubi in silicone</td><td>Forniture</td><td></td> per laboratori scientifici <td>Il resto del tubo, idealmente a base di silicone, - rimuove più facilmente i detriti nel tubo</td></tr><tr><td>Filo di seta</td><td>Pearsall Limited</td><td>10B15S220</td><td>Fissaggio del segmento sul tubo in PVC</td></tr><tr><td>Driver per siringa</td><td>Apparecchio Harvard 55-2222</td><td></td><td>Infusione intraluminale di Krebs</td></tr><tr><td>Binocolo - incluso ingrandimento 10X in oculair</td><td>Zeiss STEMI 2000</td><td></td><td>Visualizzazione ottimale per la dissezione del nervo afferente Unità di</td></tr><tr><td>controllo della coperta omeotermica</td><td>Apparecchio</td><td>di Harvard 507214</td><td>Riscaldamento della camera</td></tr> <tr><td>dell'organoBagno d'organo su misura con fondo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> coperto Sylgard<td>Software Spike2</td><td>Registrazione e analisi dei dati</td></tr><tr><td>Perni per insetti, 500 pezzi, acciaio inossidabile, diametro 0,2 mm</td><td>Perni per insetti Austerlitz minuzia Dissezione</td><td></td><td>del nervo afferente</td></tr><tr><td>Pinzetta Dumont #5 inox 11 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>Dissezione del nervo</td></tr> <tr><td>afferenteForbici, molla, 14 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>15905</td><td>Dissezione del nervo afferente</td></tr><tr><td>DB digitimer&nbsp;</td><td>Trasduttore di pressione</td> <td>NL 108T2/10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>M-3333</td><td>Manipolazione 3D dell'elettrodo di aspirazione</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>X-4 blocco</td><td></td> rotante <td>Manipolazione 3D dell'elettrodo di aspirazione</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>GJ-8 supporto</td><td></td> magnetico <td>Manipolazione 3D dell'elettrodo di aspirazione</td></tr><tr><td>LightSource</td><td>Euromex Microscopi Olanda EK-1</td><td></td><td>Visualizzazione ottimale per la dissezione del nervo afferente</td></tr><tr><td>CED 1401 Apparecchio</td><td></td><td></td><td>di registrazione Registrazione dell'attività del nervo afferente</td></tr><tr><td>Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator</td><td>Quest Scientific Instruments</td><td></td><td>Eliminazione del rumore di fondo</td></tr><tr><td>Pompa di infusione</td><td>Gibson Minipuls 2</td><td></td><td>Infusione della camera dell'organo in cui è montato</td></tr> <tr><td>il segmentoSupporto per Microelettrodi Semicelle 1,5 mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>MEH2SW</td><td>Elettrodo di aspirazione per l'isolamento della fibra afferente</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato, 300 pz; 1,5/0,84 OD/ID</td><td>World Precision Instrument</td><td>1B150-4</td><td>Capillare per l'isolamento del nervo afferente</td></tr></tbody></table>

in vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

nervi afferenti non solo forniscono informazioni relative normale fisiologia, ma anche segnale omeostasi disturbato e processi patofisiologici dei diversi organi dalla periferia verso il sistema nervoso centrale. Come tale, l&#39;aumentata attività o &#39;sensibilizzazione&#39; dei nervi afferenti mesenterici è stato attribuito un ruolo importante nella fisiopatologia dell&#39;ipersensibilità viscerale e sindromi da dolore addominale. Mesenterica attività del nervo afferente può essere misurata in vitro in un segmento intestinale isolato che è montato in un bagno per organi appositamente costruito e da cui il nervo splancnico è isolato, consentendo ai ricercatori di valutare direttamente attività nervosa adiacente al segmento gastrointestinale. L&#39;attività può essere registrata al basale in condizioni standardizzate, durante la distensione del segmento o dopo l&#39;aggiunta di composti farmacologici consegnati via endoluminale o serosally. Questa tecnica permetteil ricercatore di studiare facilmente l&#39;effetto di farmaci destinati al sistema nervoso periferico nei campioni di controllo; inoltre, fornisce informazioni cruciali su come neuronale attività è alterato durante la malattia. Va notato, tuttavia, che la misura afferenti l&#39;attività neuronale costituisce solo una stazione di rilancio del complesso neuronale cascata di segnalazione, ed i ricercatori dovrebbero tenere a mente di non trascurare l&#39;attività neuronale in altri livelli (ad esempio, gangli spinali, midollo spinale o centrale del sistema nervoso ) al fine di chiarire completamente il complesso fisiologia neuronale in salute e malattia. applicazioni comunemente utilizzate comprendono lo studio dell&#39;attività neuronale in risposta alla somministrazione di lipopolisaccaride, e lo studio delle attività del nervo afferente in modelli animali della sindrome dell&#39;intestino irritabile. In un approccio più traslazionale, il segmento isolato mouse intestinale può essere esposto a supernatanti colon da pazienti affetti da IBS. Inoltre, una modificadi questa tecnica è stato recentemente dimostrato di essere applicabile in campioni umano del colon.

Digiunale attività del nervo afferente è stata misurata al basale e in risposta alla rampa distensione in 9 di otto settimane vecchio maschio OF-1 topi. Gli animali sono stati alloggiati in gruppi in condizioni standardizzate (6 animali per gabbia, 20 - 22 ° C, umidità 40 - 50%, 12 ore ciclo luce-buio) con accesso illimitato all&#39;acqua di rubinetto e chow regolare. segmenti digiunale di topi esposti irregolare scarico nervo afferente spontanea al basale ad una pressione endoluminale d...

I nervi afferenti mesenterici trasmettono informazioni dal tratto gastrointestinale verso il cervello riguardanti la normale omeostasi e la fisiopatologia. L'attività del nervo afferente gastrointestinale può essere valutata montando segmenti intestinali isolati con nervi afferenti attaccati in un bagno d'organo, isolando il nervo e valutando l'attività basale e stimolata.

In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è registrare l'attività nervosa afferente splancnica in vitro da un singolo fascio nervoso del digiuno o del colon in risposta a distensioni progressive e all'applicazione di composti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio se i nervi afferenti che innervano il tratto gastrointestinale risultino ipersensibilizzati o desensibilizzati in diverse condizioni patologiche. I principali vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di registrare la scarica nervosa in vitro e la capacità di quantificare l'attività nervosa senza la modulazione o gli input del sistema nervoso centrale.L'implicazione di questa tecnica si estende alla terapia o alla diagnosi di diverse sindromi dolorose, come la sindrome dell'intestino irritabile, poiché la sensibilizzazione nervosa svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la dissezione dei fasci nervosi e l'analisi dell'unità singola del segnale registrato richiederanno un tempo considerevole di addestramento. Per iniziare questa procedura, posizionare il to

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Questo video dimostra un metodo per registrare l'attività dei nervi afferenti del colon in un colon di ratto ex-vivo, incannulati ad entrambe le estremità e infusi con soluzione salina per aumentare la pressione intraluminale. All'aumentare della pressione, il segnale nervoso aumenta, indicando la sua stimolazione.

Registrazione elettrofisiologica dai nervi afferenti del colon in un colon di ratto ex vivo

Questo video mostra il processo di registrazione dei segnali elettrici dai nervi afferenti mesenterici in un segmento digiunale di topo sezionato per studiare gli effetti della pressione tissutale e dei cambiamenti di movimento sull'attività del nervo afferente.

Registrazione dell'attività del nervo afferente mesenterico in un segmento di digiuno di topo ex vivo

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia,...

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete di neuroni e glia situata nella parete intestinale che controlla i riflessi intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per registrare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni vive di ENS utilizzando l'imaging Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Questo articolo descrive una tecnica di imaging video e una mappatura spazio-temporale ad alta risoluzione per identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità del colon nei topi adulti. Effetti sottili sulla funzione gastrointestinale (GI) possono essere rilevati utilizzando questo approccio in preparati tissutali isolati per migliorare la nostra comprensione della malattia gastrointestinale.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

Anormale funzione sensoriale è alla base di dolore viscerale e altri sintomi delle malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Un protocollo per la registrazione elettrofisiologica dei nervi afferenti colici in una preparazione di colorectum del ratto ex vivo è presentato qui.

In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati...

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

Dimostriamo variazioni del extracellulare più unità tecnica di registrazione per la caratterizzazione degli odori-risposte evocate nelle prime tre fasi del percorso olfattivo invertebrati. Queste tecniche possono essere facilmente adattati per esaminare l'attività ensemble in altri sistemi neuronali pure.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Impara a registrare l'attività dei nervi afferenti splancnici in vitro da segmenti digiunali o colici del topo. Questo metodo consente di quantificare la risposta nervosa a distensioni e composti senza interferenze del sistema nervoso centrale.

In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

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