Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la chimica di superficie delle nanoparticelle utilizzando il post sensing resistente sintonizzabile, o TRPS, e determinare il potenziale zeta del materiale. Ciò è dimostrato dalla caratterizzazione delle nanoparticelle modificate con DNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella caratterizzazione dei nanomateriali e nello sviluppo di biosaggi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile completare l'analisi particella per particella. Ogni segnale di particella di DNA viene tradotto in una misura del potenziale zeta, fornendo un quadro completo del campione analizzato. Il metodo più antico potrebbe fornire informazioni sulla caratterizzazione dei materiali.

Può essere applicato anche ad altre applicazioni, come lo sviluppo di biotest per il rilevamento di cellule, virus, DNA e proteine. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché non è un semplice iniettare il samp e poi attendere la risposta. C'è bisogno di un input da parte dello scienziato.

Per iniziare questa procedura, vortex le particelle rivestite di streptavidina per 30 secondi prima della sonicazione per due minuti a 80 watt per garantire la monodispersione. Diluire le particelle rivestite di streptavidina una su cento nel tampone PBST per ottenere una concentrazione risultante di una volta dieci per nove particelle per millilitro. Quindi agitare le particelle per 30 secondi.

Basato su una capacità di legame di 4.352 picomoli per milligrammo alla concentrazione appropriata di DNA alle particelle per concentrazioni risultanti di 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 e 210 nanomolari. Dopo aver fatto vorticare i campioni per 10 secondi, posizionarli su una rotella a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire al DNA di legarsi alle superfici delle particelle tramite un'interazione streptavidina e biotina. Una volta che il DNA catturato è stato aggiunto e incubato con le particelle, rimuovere il DNA in eccesso e la soluzione tramite separazione magnetica posizionando i campioni su un rack magnetico per 30 minuti.

Successivamente, rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare l'ammasso di particelle appena formato, più vicino al magnete. Quindi sostituire il surnatante con lo stesso volume di tampone PBST fresco. Ora aggiungi la quantità richiesta di DNA bersaglio a ciascun campione per assicurarti che sia stato raggiunto il massimo legame target possibile.

Agitare i campioni per 10 secondi. E posizionarli sulla rotella a temperatura ambiente per 30 minuti. Una volta completata l'ibridazione, rimuovere il DNA bersaglio in eccesso tramite separazione magnetica posizionando i campioni sul rack magnetico per 30 minuti.

Quindi rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare l'ammasso di particelle appena formato, più vicino al magnete. Quindi sostituire il surnatante con lo stesso volume di tampone PBST fresco. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti per i campioni duplicati, posizionare i campioni sulla rotella a temperatura ambiente per 16 ore per studiare i tempi di ibridazione del DNA.

A questo punto, collegare uno strumento TRPS a un sistema informatico con il software in atto. Utilizzando i calibri, misurare la distanza tra l'esterno di due ganasce parallele. Digitare la distanza nel campo di allungamento nella scheda delle impostazioni dello strumento e fare clic su calibra allungamento sotto la scheda.

Successivamente, inserire lateralmente una membrana di nanopori in poliuretano di dimensioni appropriate per l'analisi sulle ganasce con il numero ID dei nanopori rivolto verso l'alto. Quindi allungare le ganasce fino all'allungamento richiesto per l'analisi utilizzando la maniglia di regolazione dell'allungamento sul lato dello strumento. Posizionare 80 microlitri di tampone PBST nella cella fluida inferiore sotto il nanoporo, assicurandosi che non siano presenti bolle che potrebbero influire sulla misurazione.

Ora fai clic sulla cella del fluido superiore in posizione e aggiungi 40 microlitri di tampone, assicurandoti che non siano presenti bolle. Quindi posizionare una gabbia di Faraday sul sistema e applicare una pressione esterna come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver posizionato 40 microlitri di particelle di calibrazione nella cella del fluido superiore, completare una misurazione TRPS a tre tensioni applicate.

Modificare la tensione facendo clic sui pulsanti più e meno sulla scala della tensione nella scheda delle impostazioni dello strumento nel software. Verificare che le tre tensioni restituiscano le correnti di fondo appropriate. E assicurarsi che alla media tensione, le particelle di calibrazione producano un'ampiezza media del blocco di almeno 0,3 nanoampere.

Una volta raggiunte le condizioni delineate nel protocollo di testo, avviare la corsa facendo clic su start nel software nella scheda di acquisizione dati. Per completare la misurazione, fare clic su stop nella scheda di acquisizione dati e salvare il file di dati. Lavare più volte il sistema sostituendo più volte le particelle di calibrazione con 40 microlitri con tampone PBST nelle celle del fluido superiore.

E applicando varie pressioni fino a quando non sono più presenti eventi di blocco, assicurandosi che non ci siano particelle residue e nessuna contaminazione incrociata. Dopo aver raggiunto la corrente di base appropriata, sostituire l'elettrolita nella cella del fluido superiore con 40 microlitri di campione. Avviare l'esecuzione del campione facendo clic su Avvia nella scheda di acquisizione dati.

Registrare un minimo di 500 particelle e assicurarsi che il tempo di esecuzione sia di almeno 30 secondi. Per completare la misurazione, fare clic su stop nella scheda di acquisizione dati e salvare il file di dati. Qui viene mostrato un esempio di analisi delle dimensioni e del potenziale zeta di particelle rivestite di streptavidina senza modifiche e di particelle rivestite di streptavidina sature di DNA a singolo filamento sulla superficie.

Sebbene entrambi i campioni fossero di dimensioni simili, il potenziale zeta era significativamente diverso e molto più grande quando il DNA è stato funzionalizzato sulla superficie delle particelle. I dati sulle dimensioni e sul potenziale zeta esposti per i campioni con le concentrazioni più basse e più alte di DNA ibridato con le particelle rivestite di streptavidina sono visualizzati qui. Un valore di potenziale zeta maggiore viene registrato per le particelle ibridate con una maggiore concentrazione di DNA.

Qui è mostrata la variazione del potenziale zeta misurata per il solo DNA sondato di cattura, un bersaglio di DNA completamente complementare, un bersaglio di DNA a legame medio, un bersaglio di DNA a legame finale e un bersaglio di DNA sporgente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavare accuratamente un nanopolo tra ogni calibrazione e campione per garantire che non vi sia contaminazione incrociata tra i campioni e prevenire il blocco dei nanopoli.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei biosensi per esplorare le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA in saggi multiplex. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ottenere il potenziale zeta utilizzando TRPS e preparare particelle modificate del DNA per i biosaggi.