Name: Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri come determinare lo zeta potenziale di nanoparticelle modificate con DNA usando il TRPS. Questa tecnica permette l'analisi particella per particella, fornendo informazioni dettagliate sulla chimica superficiale per lo sviluppo di bioassay avanzati.

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Gli autori ringraziano Izon Science Ltd per il loro sostegno. Il lavoro è stato sostenuto dalla Commissione Europea per la Ricerca (PCIG11-GA-2012-321.836 Nano4Bio).

1. Rendere il tampone fosfato con Tween-20 (PBST) Buffer <ol><li> Sciogliere un PBS tablet (0,01 tampone M di fosfato, 0,0027 M cloruro di potassio, 0,137 M di sodio cloruro, pH 7,4) in 200 ml di acqua deionizzata (18,2 MW cm). </li><li> Aggiungere 100 pl (0.05 (v / v)%) Tween-20 per la soluzione di 200 ml di buffer come un tensioattivo. </li></ol> 2. Preparazione La particella Standards Carboxyl polistirolo <ol><li> Agitare le particelle di calibrazione per 30 sec prima sonicazione per 2 min a 80 watt per creare monodispersity delle particelle. </li><li> Diluire le particelle di calibrazione 1 in 100 ad una concentrazione di 1x10 10 particelle / ml in tampone PBST e vortex per 30 sec. </li></ol> 3. Preparazione particelle rivestite di streptavidina <ol><li> Agitare le particelle per 30 sec prima sonicazione per 2 min a 80 watt per garantire monodispersity. </li><li> Diluire le ricoperto streptavidina particelle 1 su 100 in PBST buffer per achieve una concentrazione risultante di 1x10 9 particelle / ml e vortex per 30 sec. Nota: Un volume tipico del campione è di 200 ml. Ad esempio, se indagare cinque concentrazioni di DNA preparare 1 ml di particelle rivestite con streptavidina diluiti. </li></ol> 4. Preparazione di oligonucleotidi <ol><li> Ricostituire oligonucleotidi con acqua deionizzata ad una conseguente concentrazione di 100 pM. </li></ol> 5. L&#39;aggiunta di sonda DNA Capture (CP) alle particelle rivestite di streptavidina <ol><li> Prima di legame al DNA, vortex i rivestito streptavidina particelle (volume di 200 ml del campione) per 30 secondi seguiti da 2 minuti a ultrasuoni a 80 watt. </li><li> Sulla base della capacità di legame fornito dal fornitore (4.352 pmol / mg), aggiungere la concentrazione appropriata di DNA alle particelle per risultanti concentrazioni di 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, e 210 nM DNA. </li><li> Vortice i campioni per 10 sec e posto su una ruota girevole a temperatura ambienteper 30 minuti per consentire il DNA di legarsi alle superfici delle particelle tramite un&#39;interazione streptavidina-biotina. </li><li> Una volta che il DNA di cattura è stato aggiunto e incubato con le particelle rivestite di streptavidina, rimuovere l&#39;eccesso DNA in soluzione tramite separazione magnetica ponendo i campioni su un sostegno magnetico per 30 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il cluster di nuova formazione di particelle più vicini al magnete, e sostituirlo con lo stesso volume di nuovo buffer PBST. </li></ol> 6. Ibridazione DNA complementare al CP-particelle <ol><li> Aggiungere la quantità di DNA bersaglio (superiori a 500 nM) per garantire la massima possibile target vincolante è stato raggiunto. </li><li> Vortex i campioni per 10 sec e posto su una ruota rotante a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Dopo l&#39;ibridazione, rimuovere il DNA bersaglio eccesso tramite separazione magnetica ponendo i campioni su un sostegno magnetico per 30 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, Facendo attenzione a non disturbare il cluster di nuova formazione di particelle più vicini al magnete, e sostituirlo con lo stesso volume di nuovo buffer PBST. </li><li> Ripetere i punti da 6.1 a 6.4 per i campioni duplicati e mettere questi campioni su una ruota girevole a temperatura ambiente per 16 ore per studiare i tempi di ibridazione del DNA. </li></ol> Setup 7. TRPS <ol><li> Collegare lo strumento in un sistema di computer con software a posto. </li><li> Calibrare il tratto iniziale utilizzando una pinza. <ol><li> Misurare la distanza tra l&#39;esterno di due ganasce parallele. </li><li> Ingresso nel software digitando il tratto nel campo &#39;stretch&#39; nella scheda &#39;Instrument Impostazioni&#39; e cliccando su &#39;Calibra tratto&#39; sotto la scheda. </li></ol></li><li> Lateralmente montare una membrana poliuretanica nanoporo di adeguato dimensionamento per l&#39;analisi sulle mascelle con il numero ID nanoporo rivolto verso l&#39;alto. Poi, allungare le ganasce per il tratto necessario per l&#39;analisi utilizzando lamanopola di regolazione tratto sul lato dello strumento. Allungare le ganasce tra i 43 ei 48 mm. Nota: Il valore esatto del tratto è determinato a fianco di tensione applicata in modo che i blocchi di particelle di taratura sono almeno 0,3 nA in termini di dimensioni. Il tratto è già immesso nel software nel passo 7.2 e regola automaticamente le ganasce sono allungati. </li><li> Mettere 80 ml di tampone PBST nella cella inferiore fluida, sotto il nanoporo, garantire che vi siano bolle presenti che possono influenzare la misura. Se ci sono bolle visibili, rimuovere e sostituire il buffer. </li><li> Fare clic sulla cella fluido superiore in posizione e mettere 40 ml di tampone in esso, ancora una volta garantire che vi siano bolle presenti. Se le bolle sono presenti nella cellula fluido superiore, rimuoverli sostituendo il liquido. </li><li> Quando una corrente di riferimento riproducibile è stato raggiunto dalla sostituzione della cella di fluido superiore con tampone, aggiungere 40 ml di campione alla cella fluido superiore e misura cliccando &#39;stl&#39;arte &#39;in la&#39; scheda di acquisizione dati &#39;sullo schermo del software. Nota: L&#39;acquisizione dei dati è stata completata ad una frequenza di 50 kHz con il limite di un blocco grandezza inferiore di 0,05 nA, anche se questo può essere modificato tramite il software tramite la scheda &#39;Analyse dati&#39; (sotto &#39;impostazioni di analisi&#39; e &#39;resistivo Blocchi&#39;) . </li><li> Inserire una gabbia di Faraday sopra la parte superiore del sistema cellulare di liquidi per ridurre il rumore di fondo elettrico sulle misurazioni. </li><li> Utilizzare un modulo di pressione variabile (VPM) per applicare una pressione o vuoto per i campioni. <ol><li> Per applicare una pressione esterna collegare l&#39;ugello alla cella di fluido superiore, poi ruotare il braccio di pressione e agganciarla (a seconda che verranno applicate una pressione positiva (PRE) o vuoto (VAC)). </li><li> Applicare pressione in un &#39;cm&#39; o scala &#39;mm&#39; utilizzando la manopola stadio di pressione situata sulla sommità della VPM. Premere la manopola verso il basso per fare pressione sulla scala &#39;cm&#39; e tirarlo verso l&#39;alto to applicare una pressione sulla scala &#39;mm&#39;. </li></ol></li></ol> 8. preparazione dei campioni per l&#39;analisi TRPS <ol><li> campioni Vortex per 30 secondi e ultrasuoni per 2 min a 80 watt prima dell&#39;analisi TRPS. </li></ol> 9. Calibrazione del nanoporo per l&#39;analisi Zeta <ol><li> Dopo aver posizionato 40 particelle di calibrazione microlitri (1x10 10 particelle / ml) nella cella fluido superiore, completare una misurazione TRPS (messa a punto come nella sezione 7) a 3 tensioni applicate. Modificare la tensione facendo clic sul &#39;+&#39; e &#39;-&#39; pulsanti sulla scala di tensione nella scheda &#39;Instrument Settings&#39; sul software. </li><li> Verificare che le 3 tensioni tornano correnti di circa 140, 110 di fondo, e 80 nA. Assicurarsi che alla tensione media delle particelle di calibrazione producono una magnitudine media blocco di almeno 0,3 nA. </li><li> Applicare una pressione in modo che la media ampiezza metà massimo (FWHM) durate delle particelle di taratura sono almeno0.15 msec. Fare questo manualmente utilizzando il braccio di pressione collegato al modulo di pressione variabile. Selezionare pressione (PRE) o vuoto (VAC) ruotando il braccio fino a farlo scattare nella posizione desiderata e applicano di conseguenza seguente set up istruzioni al punto 7.8.2. Una volta che queste condizioni sono stati raggiunti, inizia la corsa facendo clic su &#39;Start&#39; sul software nella scheda &#39;acquisizione dati&#39;. </li><li> Completa la corsa premendo il tasto &#39;stop&#39; nella scheda &#39;Data Acquisition&#39; quando almeno 500 particelle sono state misurate (vedi &#39;Conte di particelle&#39; nella parte inferiore della schermata del software durante la misura) e la pista ha superato 30 sec (vedere &#39; Run Time &#39;anche verso la parte inferiore dello schermo). </li><li> Calibrare il sistema completando una corsa di taratura come descritto ogni volta che viene introdotto un nuovo nanoporo o per ogni nuovo giorno di analisi completando passo 9,1-9,4. </li></ol> 10. L&#39;esecuzione di un campione <ol><li> Eseguire i campioni al più alto osecondo più alto a tensione di campioni di calibrazione a garantire un simile (± 10 nA), se non la stessa corrente di base. <ol><li> Una volta che la corrente di base del caso si ottiene, sostituire l&#39;elettrolita nella cella di fluido superiore con 40 ml di campione. Quando viene introdotto un campione, i blocchi saranno visibili sulla traccia del segnale. Avviare il campione di eseguire cliccando su &#39;Start&#39; nella scheda &#39;acquisizione dati&#39; e registrare un minimo di 500 particelle (controllare &#39;Conte di particelle&#39; situata sotto la traccia del segnale) e di garantire il tempo di esecuzione è un minimo di 30 secondi (vedere &#39;Run tempo &#39;situato anche sotto la traccia del segnale). </li><li> Per completare la misurazione, cliccare su &#39;stop&#39; in la &#39;scheda di acquisizione dati&#39; e salvare il file di dati. </li></ol></li><li> Per salvare il file, inserire le informazioni sul file nel seguente formato; &#39;Indagine&#39; è la cartella il file verrà salvato in, &#39;Nanopore ID&#39; è il numero di serie del poro in uso, &#39;Parte #&#39; is il tipo di pori (cioè, NP150 / NP200), &#39;ID campione&#39; è il nome del campione, &#39;calibrazione o campione&#39; dettagli se si tratta di una misura di calibrazione o campione, viene utilizzato &#39;diluizione&#39; se il campione è stato diluito ( digitare 100 se il campione è stato diluito 100 volte), &#39;Pressure&#39; è la pressione applicata al campione (in cm - vedere paragrafo 7.8), &#39;elettrolito ID&#39; è il nome del tampone campione è costituito, e &#39; Note &#39;sono delle note personali sul campione o correre. </li><li> Tra ogni corsa del campione, lavare il sistema, ponendo 40 ml di PBST tampone nella cella fluido superiore diverse volte e l&#39;applicazione di varie pressioni (di solito a -10, -5 cm (a vuoto), e 5 e 10 cm (pressione positiva)) fino a altri eventi del blocco sono presenti, garantendo l&#39;assenza di particelle residue rimangono nel sistema e quindi nessuna contaminazione incrociata tra i campioni. campioni analizzato in triplicato con questa fase di lavaggio completato tra ogni campione di ripetizione corrono come well come tra i diversi campioni. </li></ol>

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<html> Il calcolo per il potenziale zeta ha utilizzato un metodo basato calibrazione relativi al lavoro in Arjmandi et al. 21. La durata della traslocazione di particelle, e attraversa un nanoporo viene misurata in funzione della tensione applicata, utilizzando un campo e particella media velocità elettrici sulla totalità di un poro conica regolare. La mobilità elettroforetica è la derivata di 1 / T (dove T è la durata blocco) rispetto alla tensione, moltiplicata per il quadrato della lunghezza della ...

nanoparticelle funzionalizzate stanno diventando sempre più popolare come biosensori in entrambi i campi medico e ambientale. La capacità di alterare la chimica di superficie di una nanoparticella, con il DNA, per esempio, si sta rivelando utile per i sistemi di somministrazione di farmaci mirati 1 e monitoraggio interazioni DNA-proteina 2-4. Una proprietà di nanoparticelle sempre più comune di essere utilizzato nel test biologici e nella consegna di terapie è superparamagnetismo 5. particelle superparamagnetiche (SPP) sono estremamente utili per identificare e rimuovere analiti specifici da miscele complesse e possono farlo con il semplice uso di un unico magnete. Una volta rimosse, le particelle di analiti-bound possono essere caratterizzate e analizzati adatto allo scopo. I metodi precedenti utilizzati per la rilevazione e la caratterizzazione di nanoparticelle comprendono tecniche ottiche quali light scattering dinamico (DLS), altrimenti noti come la spettroscopia di correlazione di fotoni. Anche se un hitecnica di throughput gh, DLS si limita ad essere una tecnica basata compensazione e nell&#39;analisi di campioni multimodali senza l&#39;aggiunta di software specializzato, le particelle più grandi produrranno un segnale molto più dominante, lasciando alcune delle particelle più piccole completamente inosservato 6,7. Particle-by-particella tecniche di caratterizzazione sono quindi molto più favorevole per analizzare i sistemi di nanoparticelle funzionalizzati nanoparticelle e. tecnologie basate RPS sono basati su applicazione di un campo elettrico per un campione e monitorare il meccanismo di trasporto delle particelle attraverso un nanoporo sintetico o biologico. Un relativamente recente tecnica di rilevazione e la caratterizzazione di nanoparticelle sulla base di RPS è sintonizzabile resistivo impulso di rilevamento (TRPS) 8-16. TRPS è un sistema a due elettrodi separati da una membrana elastomerica pori sintonizzabile. Metodo pori sintonizzabile permette di analiti di una serie di forma 17 e la dimensione deve essere misurata tramite il loro transmeccanismi di porta attraverso il poro. Pori sintonizzabili sono stati precedentemente utilizzati per la rilevazione di piccole particelle (70-95 nm di diametro) producendo risultati paragonabili a altre tecniche come la spettroscopia elettronica a trasmissione (TEM) 10. Quando un campo elettrico viene applicato, una corrente ionica viene osservata e come particelle / molecole passano attraverso il poro, essi bloccare temporaneamente il poro, provocando una riduzione della corrente che può essere definita come un &#39;evento blocco&#39;. Ogni evento blocco è rappresentativo di una singola particella in modo che ogni particella di un campione può essere caratterizzato individualmente in base alla grandezza blocco, Δ <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq1.jpg" /> E larghezza a metà massimo FWHM, così come altre proprietà del blocco. Analizzando le singole particelle che passano attraverso un nanoporo è vantaggioso per i campioni multimodali come TRPS grado di distinguere correttamente ed efficacemente una gamma di dimensioni delle particelle amonGST un singolo campione. Sintonizzabile rilevamento impulso resistivo completa dimensione 10, potenziale zeta 12,18 e la concentrazione di 15 misurazioni simultaneamente in un unico passaggio e quindi può ancora distinguere campioni di simile, se non la stessa dimensione con la loro carica di superficie 19; un vantaggio rispetto alle tecniche dimensionali alternative. Potenziale Zeta è definito come il potenziale elettrostatico in corrispondenza del piano di taglio 20, e viene calcolato le velocità delle particelle, e attraversa un poro 19. Zeta potenziali misure delle singole particelle dà quindi informazioni sui meccanismi di traslocazione e il comportamento dei sistemi di nanoparticelle in soluzione, informazioni preziose per il futuro dei disegni di analisi nanoparticelle per una gamma di applicazioni. l&#39;analisi delle particelle-by-particella di natura tale permette anche per la diffusione e la distribuzione dei valori potenziale zeta tra un campione di popolazione da esplorare, consentendo per ulteriori informazioni ocinetica di reazione n (single-stranded di DNA a doppia elica, per esempio) e stabilità di particelle in soluzione da raggiungere. Qui, descriviamo una tecnica che individua e caratterizza entrambe le superfici modificate e DNA modificato spp. Il protocollo qui descritto è applicabile ad una gamma di nanoparticelle inorganiche e biologiche, ma dimostrano la procedura utilizzando superfici DNA modificato per la loro vasta gamma di applicazioni. La tecnica consente all&#39;utente di distinguere tra obiettivi a filamento singolo e doppio filamento di DNA su una superficie di nanoparticelle, sulla base delle velocità di traslocazione particelle attraverso un sistema di pori e quindi i loro potenziali zeta.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P4417</td><td>1 compressa disciolta in 200&nbsp; ml di acqua deionizzata per fare la soluzione tampone.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich, Regno Unito</td><td>P1379</td><td>0,05% (v/v) in tampone PBS come tensioattivo</td></tr><tr><td>Nanoparticelle di carbossilpolistirene</td><td>Bangs Laboratories, US</td><td>CPC200</td><td>Diametro nominale di 220&nbsp; nm, concentrazione grezza di 1 x 1012 particelle/ml, carica superficiale specifica di 86 &micro; eq/g (equivalente a una densità di carica superficiale di 3,2 x 1019 C/nm2.</td></tr><tr><td>Nanoparticelle rivestite di streptavidina</td><td>Ademtech, Francia</td><td>3121</td><td>Il lotto aveva una capacità di legame di 4.352 pmol/mg (188 nM di capacità teorica di legame al DNA) a una concentrazione grezza di 1,1 x 1011 particelle/ml.</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi biotinilati</td><td>Sigma Aldrich, Regno Unito</td><td>VC00001</td><td>Specifiche del fornitore: Purificazione di fase 1 inversa (scala 0,05); Modifica della biotina all'estremità 3'; Polveri liofilizzate ricostituite al 100&nbsp; &micro; M utilizzando acqua deionizzata e diluita secondo necessità. Sequenze: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC
GCGTGGC[Btn]</td></tr><tr><td>3'Olignonucleotidi standard</td><td>Sigma Aldrich, Regno Unito</td><td>VC00001</td><td>Specifiche del fornitore: Purificazione di fase 1 inversa (scala 0,05); Polveri liofilizzate ricostituite a 100 &micro; M utilizzando acqua deionizzata e diluita secondo necessità. Sequenze di bersagli del DNA: Completamente complementare - 5'GCCACGCGTAGTGA
GGTTTAACCAT3', Rilegatura centrale - 5'GTAGTGAGGT3', Rilegatura finale - 5'GTTTAACCAT3', Strapiombo parzialmente complementare - 5'GTGAGGTTTAACCAT
TTTTTTTTTTTTTTT3".</td></tr><tr><td>Izon qNano</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Pressione intrinseca sul sistema di 47&nbsp; Pa</td></tr><tr><td>Izon Variable Pressure Module (VPM)</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Ogni 'cm' di pressione equivale a circa 100 Pa.</td></tr><tr><td>Membrane poliuretaniche nanopori Izon</td><td>Science, NZ</td><td>NP150</td><td>Intervallo di dimensioni dell'analita 60-480 nm, diametro dei pori calcolato in 799 nm con un tratto di 45 mm.</td></tr><tr><td>Magrack 6</td><td>GE Healthcare, Regno Unito</td><td>28-9489-64</td><td></td></tr><tr><td>Bagno sonico</td><td>Fisher Scientific, Regno Unito</td><td>10692353</td><td>80</td></tr><tr><td>Watt Vortexer</td><td>IKA, Germania</td><td>0003365000</td><td></td></tr><tr><td>Ruota rotante&nbsp;</td><td>Labnet International, Stati Uniti</td><td>H5500-230 V</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione della zeta potenziale tramite nanoparticelle traslocazione le velocità attraverso una tunable nanopore: usando le particelle di dna modificato come esempio

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

tecnologie nanoporo, noti collettivamente come sensori resistivi Pulse (RPS), vengono utilizzati per rilevare, quantificare e caratterizzare le proteine, molecole e nanoparticelle. sensing sintonizzabile impulso resistivo (TRPS) è relativamente recente adattamento di RPS che incorpora un poro sintonizzabile che può essere alterato in tempo reale. Qui, usiamo TRPS di monitorare i tempi di traslocazione di nanoparticelle DNA modificato, e attraversa la membrana pori sintonizzabile in funzione della concentrazione di DNA e struttura (cioè, a singolo filamento di DNA a doppio filamento). TRPS si basa su due elettrodi Ag / AgCl, separate da una membrana elastomerica pori che stabilisce una corrente ionica stabile su un campo elettrico applicato. A differenza di varie tecnologie di caratterizzazione delle particelle ottiche a base, TRPS possono caratterizzare le singole particelle, tra un campione di popolazione, permettendo per i campioni multimodali da analizzare con facilità. Qui, dimostriamo misurazioni potenziale zetatramite velocità traslocazione delle particelle di standard noti e applicarle per assaggiare i tempi traslocazione analiti, con il risultato di misura del potenziale zeta di questi analiti. Oltre ad acquisire valori di potenziale zeta medi, i campioni sono tutti misurati utilizzando una prospettiva particelle-by-particella esibendo ulteriori informazioni su un determinato campione attraverso distribuzioni di popolazione campione, per esempio. Di conseguenza, il metodo illustrato potenziale all&#39;interno applicazioni di rilevamento per entrambi i campi medico e ambientale.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica dei processi di purificazione magnetica e una misurazione TRPS. A) Esempio di purificazione magnetica del campione a partire da un campione contenente eccesso, non legato DNA sonda di cattura. B) TrPs esempio di misura i) di particelle che passa attraverso il nanoporo e ii) evento blocco prodotta da particelle occlusione temporan...

Qui usiamo un nanoporo sintonizzabile poliuretano integrato in una tecnica di rilevamento di impulsi resistivo caratterizzare nanoparticelle chimica di superficie tramite la misura della velocità di traslocazione delle particelle, che può essere utilizzato per determinare il potenziale zeta delle singole nanoparticelle.

Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la chimica superficiale delle nanoparticelle utilizzando la rilevazione con pori resistivi regolabili, o TRPS, e determinare il potenziale zeta del materiale. Questo viene dimostrato caratterizzando nanoparticelle modificate con DNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella caratterizzazione dei nanomateriali e nello sviluppo di saggi biologici.Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di completare l'analisi particella per particella. Ogni segnale proveniente da una particella di DNA viene tradotto in una misura del potenziale zeta, fornendo un quadro completo del campione in esame. Il metodo più antico poteva offrire informazioni utili sulla caratterizzazione dei materiali.È inoltre applicabile ad altre applicazioni, come lo sviluppo di saggi biologici per il rilevamento di cellule, virus, DNA e proteine. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché non si tratta di un semplice "inietta il campione e attendi la risposta". È necessario un certo intervento da parte dello scienziato.Per iniziare questa procedura, vortexare le particelle rivestite con streptavidina per 30 secondi prima della sonificazione per due minuti a 80 watt per assicurare una distribuzione monodispersa. Diluire le particelle rivestite con streptavidina di uno a cento nel buffer PBST per ottenere una concentrazione finale di uno per dieci alla nona particelle per millilitro. Successivamente, vortexare le particelle per 30 secondi.In base a una capacità di legame di 4.352 picomoli per milligrammo alla concentrazione appropriata di DNA rispetto alle particelle, per concentrazioni risultanti di 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 e 210 nanomolari. Dopo aver agitato i campioni per 10 secondi, posizionarli su una ruota rotante a temperatura ambiente per 30 minuti, consentendo al DNA di legarsi alle superfici delle particelle tramite un'interazione streptavidina-biotina. Una volta aggiunto il DNA catturato e incubato con le particelle, rimuovere il DNA in eccesso e la soluzione mediante separazione magnetica, posizionando i campioni su un supporto magnetico per 30 minuti.In seguito, rimuovere il soprannatante, avendo cura di non disturbare l'aggregato di particelle appena formato, situato più vicino al magnete. Quindi sostituire il soprannatante con lo stesso volume di tampone PBST fresco. Aggiungere ora la quantità necessaria di DNA bersaglio a ciascun campione per assicurare il massimo legame possibile del bersaglio.Vortexare i campioni per 10 secondi e posizionarli sulla ruota rotante a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'ibridazione, rimuovere l'eccesso di DNA bersaglio mediante separazione magnetica posizionando i campioni sul supporto magnetico per 30 minuti.Successivamente, rimuovere il soprannatante, avendo cura di non disturbare l'aggregato di particelle appena formato, situato più vicino al magnete. Quindi sostituire il soprannatante con lo stesso volume di tampone PBST fresco. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti per i campioni in duplicato, posizionare i campioni sulla ruota rotante a temperatura ambiente per 16 ore per studiare i tempi di ibridazione del DNA.A questo punto, collegare uno strumento TRPS a un sistema informatico dotato di software. Utilizzando un calibro, misurare la distanza tra l'esterno di due ganasce parallele. Inserire la distanza nel campo allungamento nella scheda delle impostazioni dello strumento e fare clic su calibra allungamento situato al di sotto della scheda.Successivamente, posizionare lateralmente sulle ganasce una membrana nanoporosa in poliuretano delle dimensioni appropriate per l'analisi, con il numero identificativo del nanoporo rivolto verso l'alto. Quindi allungare le ganasce fino all'allungamento richiesto per l'analisi, utilizzando la manopola di regolazione dell'allungamento situata sul lato dello strumento. Aggiungere 80 microlitri di tampone PBST nella cella fluidica inferiore al di sotto del nanoporo, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria che potrebbero influenzare la misurazione.Ora posizionare la cella fluida superiore e aggiungere 40 microlitri di tampone, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria. Successivamente, posizionare una gabbia di Faraday sul sistema ed applicare una pressione esterna come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver inserito 40 microlitri delle particelle di calibrazione nella cella fluida superiore, eseguire una misurazione TRPS a tre tensioni applicate.Modificare la tensione facendo clic sui pulsanti più e meno sulla scala della tensione nella scheda delle impostazioni dello strumento nel software. Verificare che le tre tensioni restituiscano le correnti di fondo appropriate. Assicurarsi inoltre che, alla tensione media, le particelle di calibrazione producano una magnitudine media del blocco di almeno 0,3 nanoampere.Una volta raggiunte le condizioni descritte nel protocollo testuale, avviare la corsa facendo clic su "start" nel software nella scheda di acquisizione dati. Per completare la misurazione, fare clic su "stop" nella scheda di acquisizione dati e salvare il file dei dati. Lavare il sistema sostituendo più volte le particelle di calibrazione con 40 microlitri di tampone PBST nelle celle fluidiche superiori.E applicare diverse pressioni fino a quando non si osservano ulteriori eventi di blocco, assicurandosi che non siano presenti particelle residue né contaminazioni incrociate. Una volta raggiunta la corrente di base appropriata, sostituire l'elettrolita nella cella fluida superiore con 40 microlitri di campione. Avviare l'analisi del campione cliccando su "inizia" nella scheda di acquisizione dati.Registrare un minimo di 500 particelle e assicurarsi che il tempo di esecuzione sia di almeno 30 secondi. Per completare la misurazione, fare clic su "stop" nella scheda di acquisizione dati e salvare il file di dati. Di seguito è riportato un esempio di analisi della dimensione e del potenziale zeta di particelle rivestite con streptavidina senza modifiche e di particelle rivestite con streptavidina sature di DNA a filamento singolo sulla superficie.Sebbene entrambi i campioni avessero dimensioni simili, il potenziale zeta era significativamente diverso e molto più elevato quando il DNA era funzionalizzato sulla superficie delle particelle. Qui vengono mostrati i dati di dimensione e potenziale zeta per i campioni con le concentrazioni più basse e più alte di DNA ibridato alle particelle rivestite con streptavidina. Viene registrato un valore di potenziale zeta più elevato per le particelle ibridate con una concentrazione maggiore di DNA.Qui viene mostrata la variazione del potenziale zeta misurata per il DNA con sonda di cattura soltanto, un bersaglio di DNA completamente complementare, un bersaglio di DNA con legame centrale, un bersaglio di DNA con legame terminale e un bersaglio di DNA con prolungamento. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di lavare accuratamente un nanopolipo tra ogni calibrazione e campione per assicurare l'assenza di contaminazione incrociata tra i campioni e prevenire qualsiasi ostruzione del nanopolipo.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei biosensori per esplorare interazioni proteina-proteina e proteina-DNA in saggi multiplex. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere il potenziale zeta utilizzando TRPS e preparare particelle modificate con DNA per saggi biologici.

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Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine ​​su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l'assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine ​​singolo è lontano dall'equilibrio, proponiamo l'impiego di matrici parallele di nanopori sintetici, permettendo per la determinazione...

Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

Un protocollo per l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Una metodologia per la preparazione di nanopori a stato solido in soluzione per esperimenti di traslocazione biomolecolari è presentato. Applicando brevi impulsi di campi elettrici elevati, il diametro nanoporo può essere ampliata in modo controllabile con precisione subnanometer e le sue caratteristiche di rumore elettrico significativamente migliorata. Questa procedura viene eseguita in situ utilizzando apparecchiature di laboratorio standard in condizioni sperimentali.

Ottimizzazione delle dimensioni e minimizzando il rumore di stato solido Nanopori

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Proponiamo una semplice tecnica di auto-assemblaggio di nanoparticelle colloidali di silice per creare una giunzione nanofluidica tra due microcanali in polidimetilsilossano (PDMS). Utilizzando questa tecnica, una membrana a microsfere nanoporose con una dimensione dei pori fino a ~ 45 nm è stata costruita all'interno di un microcanale e applicata alla preconcentrazione elettrocinetica di campioni di DNA.

Creazione di Sub-50 Nm nanofluidic giunzioni in PDMS Microfluidic Chip tramite processo di auto-assemblaggio di particelle colloidale

Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull'impatto della rigidità del filamento.

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Monitoraggio della dinamica conformazionale di singole proteine non modificate mediante Nanotweezers plasmonici

Scopri come determinare lo zeta potenziale di nanoparticelle modificate con DNA usando il TRPS. Questa tecnica permette l'analisi particella per particella, fornendo informazioni dettagliate sulla chimica superficiale per lo sviluppo di bioassay avanzati.

Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio (Video) | JoVE Journal

Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio

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