Name: Misurazione In Vitro Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Impara a misurare l'attività di integrazione dei complessi preintegrazione HIV-1 in vitro utilizzando estratti citoplasmatici di cellule SupT1. Questo metodo supporta lo sviluppo di nuove terapie antiretrovirali.

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Questo lavoro è in parte sostenuto da sovvenzioni DA024558, DA30896, DA033892, e DA021471 dal NIDA / NIH su CD. Riconosciamo inoltre la concessione G12MD007586 RCMI, la Vanderbilt CTSA concedere UL1RR024975, il Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA concessione U54 RR026140 dal NCRR / NIH, l&#39;U54 concessione MD007593 dal NIMHD / NIH, e il Tennessee CFAR concessione P30 AI110527.

1. Virus Produzione NOTA: Per generare alti titoli di contagioso dell&#39;HIV-1, trasfezione la linea cellulare embrionale umano Rene (HEK) 293T con un contagioso dell&#39;HIV-1 clone molecolare utilizzazione di un reagente di trasfezione dendrimeri basati attivato. È stato osservato che il metodo del calcio fosfato trasfezione produce risultati comparabili. <ol><li> In un laboratorio di biosicurezza di livello 2 (BSL2), semi di 3 x 10 6 293T cellule per 10 centimetri piatto di 8 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), la penicillina, e streptomicina. Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 O / N. </li><li> Il giorno successivo, per trasfezione le cellule in ciascun piatto 10 centimetri, diluire 8 mg di DNA plasmidico pNL4-3 (vedi Materiali tabella) per un volume finale di 300 ml di DMEM privo di siero e antibiotici. Aggiungere 80 ml di reagente di trasfezione, mescolare bene pipettando, e incubare a temperatura ambiente per5 - 10 min per la trasfezione formazione del complesso. </li><li> Rimuovere il supporto dai piatti tramite aspirazione e aggiungere 7 ml per ogni piatto di DMEM fresco contenente siero e antibiotici. </li><li> Aggiungere 1 ml di DMEM contenente siero e antibiotici per il complesso trasfezione, mescolare pipettando, e aggiungere questa miscela alle cellule. Agitare delicatamente il piatto per facilitare la distribuzione uniforme dei complessi trasfezione. </li><li> Trasferire immediatamente le cellule in laboratorio BSL3, posto in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2, e coltivare le cellule per 48 h. </li><li> Raccogliere il tessuto surnatante cultura virus contenenti con una pipetta e poi trasferirlo in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule e detriti, e poi filtrare il surnatante attraverso un filtro siringa da 0,45 micron pori di dimensioni. </li><li> Per eliminare ogni DNA plasmidico riporto in questa preparazione privo di virus-cellula, trattare con DNasi 1 (20 mg / ml) a 37 ° C per 1 h. </li><li> Per quantificare laHIV-1 titolo, utilizzare la specifica-p24 immunoenzimatico (ELISA), in quanto è un metodo rapido e sensibile per l&#39;uso di routine 22. NOTA: Si deve notare che la p24 ELISA misura il titolo fisica (numero di particelle virali). In alternativa, misurando l&#39;attività associata al virus RT (saggio RT esogena) o infettività del virus (test di infettività basati linea cellulare spia TZM-bl) fornirà lettura esclusiva di particelle virali infettive. </li></ol> 2. Infezione da virus di cellule Sup-T1 (BSL3 Lab) <ol><li> In un laboratorio BSL2, mantenere le cellule Sup-T1 tra 1,0 x 10 6 e 2.0 x 10 6 cellule / ml in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementato con 10% inattivato al calore FBS, penicillina e la streptomicina (rapporto di divisione di 1 : 2 ogni 2 - 3 d). Pool le cellule Sup-T1 dalle fiasche di coltura, mescolare bene pipettando, e determinare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro e trypan blu stMetodo aining. <ol><li> Preparare il numero richiesto di aliquote di 80 x 10 6 cellule (per infezione virale) in 50 provette coniche centrifuga mL. </li><li> Centrifugare le cellule in un rotore oscillante secchio a 500 xg e 25 ° C per 5 min. Senza rimuovere il mezzo di coltura cellulare, trasferire le provette contenenti cellule in pellet al laboratorio BSL3 per ulteriori elaborazioni. Con attenzione aspirare il terreno di coltura cellulare dal tubo senza disturbare il pellet. </li></ol></li><li> Aggiungere una quantità appropriata di inoculo virus DNasi I trattati per le cellule nel tubo e mescolare bene delicatamente pipettando. Per 80 x 10 6 celle, utilizzare 30 ml di virus DNasi I-trattati (50 mg di virus p24-equivalente). NOTA: L&#39;isolamento del PIC funzionale richiede di infettare le cellule bersaglio con altissime molteplicità di infezione (MOI). </li><li> Distribuire il composto in modo uniforme tra due piastre di coltura tissutale 6 pozzetti (cioè 12 aliquote x 2,5 mL; utilizzare 2 piastre per infettareion). </li><li> Per spinoculation, posizionare le piastre di coltura nei portatori piastra e centrifugare con un rotore secchio oscillante a 480 xg e 25 ° C per 2 ore. </li><li> Incubare le cellule spinoculated a 37 ° C e 5% CO 2 per 5 ore. </li></ol> 3. Raccolta e lisi delle cellule infette (BSL3 lab) <ol><li> In comune le celle corrispondenti ad ogni infezione dalle piastre di coltura in una provetta da 50 ml centrifuga (~ 30 ml in totale). </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg e 25 ° C per 10 min. Con attenzione aspirare il surnatante dal tubo (in alternativa, utilizzare una pipetta). </li><li> Per rimuovere eventuali particelle virali residui, lavare ciascun pellet cellulare aggiungendo 2 mL di tampone K - / - (150 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM MgCl 2) e centrifugazione del campione a 300 xg e 25 ° C per 10 minuti. Poi, senza disturbare il pellet, rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione o utilizzando una pipetta. </li><li> ripett passo 3.3. </li><li> Rimuovere con cura qualsiasi residuo di tampone utilizzando una micropipetta. Risospendere ogni pellet di cellule in 2 ml di ghiacciata tampone di lisi K + / + (Buffer K - / - integrata con 0,025% digitonina, 1 mM DTT, 20 mg / ml aprotinina), mescolare il contenuto di delicato pipettaggio, e versare in un 2 ml provetta. </li></ol> 4. Preparazione del PIC citoplasmatici (BSL3 lab) <ol><li> Rock the campioni su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare i campioni, con il rotore preraffreddato a 4 ° C, a 1.500 xg e 4 ° C per 4 min. </li><li> Senza disturbare il pellet, trasferire accuratamente il surnatante in una provetta fresco e centrifugare a 16.000 xg e 4 ° C per 1 min. </li><li> trasferire con cautela il surnatante in una provetta fresca. Aggiungere RNasi A (20 mg / ml) ad una concentrazione finale di 20 mg / ml (2 microlitri per 2 mL di PIC) e incubare i contenuti a ta per 30 min (senza dondolo). &lt;/ Li&gt; <li> Aggiungere saccarosio (60% w / v in tampone K - / -) ad una concentrazione finale del 7% e mescolare bene delicatamente pipettando. Preparare aliquote (ad esempio, 200 ml) dei PIC in tubi microcentrifuga, flash-congelamento in azoto liquido, e mettere in un -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 5. In Vitro Integration (IVI) Assays Utilizzando HIV-1 PIC <ol><li> Preparare il DNA bersaglio usato nel saggio IVI amplificando una regione 2,0 kb dal plasmide DNA phiX174 con PCR usando primer su misura, phiX174-F e phiX174-R. <ol><li> Assemblare la miscela di PCR come descritto nella Tabella 1. Eseguire la PCR in un termociclatore base alle condizioni di ciclo termico raccomandate in Tabella 2. Gel-purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit di gel-purificazione (seguendo il protocollo consigliato dal produttore), e memorizzare il DNA bersaglio purificato come aliquote a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere 600 ng di DNA bersaglio a 200 - &amp; #181; L aliquota di PIC, mescolare bene, e incubare a 37 ° C per 45 min. Nota: Le reazioni IVI omettendo DNA bersaglio o tra un inibitore dell&#39;integrasi (ad esempio, raltegravir) sono reazioni di controllo raccomandati. </li><li> Arrestare la reazione IVI con l&#39;aggiunta di SDS, EDTA e proteinasi K a concentrazioni finali di 0.5%, da 8 mm e 0,5 mg / ml, rispettivamente. Mescolare il contenuto di reazione a fondo e incubare una notte a 56 ° C. </li><li> Il giorno successivo, purificare il DNA totale dalla reazione IVI da fenolo / estrazione cloroformio e precipitazione in etanolo. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 16.000 xg e RT. </li><li> Aggiungere un volume uguale di fenolo al campione deproteinizzato, mescolare vigorosamente su vortex e centrifugare per 2 min. Rimuovere con attenzione la fase acquosa superiore e trasferirlo in una nuova provetta. </li><li> Ripetere il punto 5.5. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere un uguale volume di 1: 1 di fenolo: miscela di cloroformio, agitare vigorosamente su vortex e centrifugare for 2 min. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere un uguale volume di cloroformio, agitare vigorosamente con vortex e centrifugare per 2 min. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. </li><li> Per precipitare DNA, aggiungere glicogeno ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL, 3 M di acetato di sodio ad una concentrazione finale di 0,3 M e 2,5 volumi di etanolo 100% (ghiacciata). Vortex per miscelare, centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto, e posizionare il tubo a -80 ° CO / N. </li><li> Il giorno successivo, centrifugare il campione per 30 minuti a 16.000 xg e 4 ° C per 30 min. rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo all&#39;80% (ghiacciata) al pellet e centrifugare a 16.000 xg e 4 ° C per 10 min. Far asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente e accuratamente risospendere in 50 ml di acqua priva di nucleasi. Conservare i campioni di DNA a -20 ° C. </li></ol> 6. PCR per quantificare PIC Activity <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; NOTA: Il numero di copie del virus HIV-1 DNA integrato nel DNA bersaglio è quantificato da una strategia nested PCR che impiega 2 set di primer e 2 giri sequenziali di PCR. <ol><li> Eseguire il primo turno convenzionale PCR usando primer di targeting (rispettivamente LTR e phiX174 primer,) la LTR virale e il DNA phiX174 per amplificare le giunzioni del virus HIV-1 DNA integrato. <ol><li> Montare la miscela primo turno di PCR, come descritto nella tabella 3. Assemblare un master mix di tutti i componenti ad eccezione del DNA stampo, dispensare aliquote di 45 microlitri in tubi PCR separati, e aggiungere 5 ml di stampo di DNA o di acqua priva di nucleasi (controllo). </li><li> Eseguire la PCR in un termociclatore base alle condizioni di ciclo termico raccomandate in Tabella 4. </li></ol></li><li> Eseguire il secondo turno qPCR utilizzando primer che fiancheggiano una breve regione del LTR virale (LTR-R e primer LTR-U) per amplificare selettivamente le sequenze vDNA integrati dal primo-roprodotti und PCR. Per determinare i vDNA integrati copia numeri, generare una curva standard utilizzando 10x diluizioni seriali numero di copie noto (ad esempio, 10 0 - 10 8) del clone molecolare di HIV-1. <ol><li> Montare la miscela secondo turno qPCR come descritto nella Tabella 5. Assemblare un master mix di tutti i componenti ad eccezione del DNA stampo, con attenzione a meno di 25 aliquote microlitri nel numero appropriato di pozzi in un pozzo 96 piastra di reazione PCR e aggiungere 5 ml di non purificata primo turno di PCR prodotti o acqua priva di nucleasi (controllo). Eseguire tutte le reazioni qPCR in triplice copia. </li><li> Caricare la lastra PCR nello strumento PCR in tempo reale ed eseguire qPCR base alle condizioni di ciclo raccomandate in Tabella 6. </li><li> Analizzare i dati utilizzando un software adatto. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari e non finanziari concorrenti.

analisi biochimiche di PIC retrovirali hanno fornito spunti critici nel meccanismo di integrazione del DNA retrovirale. Misurazione dell&#39;attività integrazione dei PIC retrovirali può essere ottenuto mediante saggio di placca formazione, analisi Southern blot, e nested qPCR. La strategia sperimentale del saggio di placca è laboriosa e utilizza un metodo indiretto per misurare integrazione 6, 7, 18. Southern integrazione test...

Replicazione dell&#39;HIV-1 nella cella di destinazione prevede più passaggi, in linea di massima raggruppati in due fasi: eventi precoci e tardive. Gli eventi precoci iniziano quando HIV-1 in sequenza si lega alla superficie del recettore cellula bersaglio CD4 e una delle due co-recettori (CCR5 o CXCR4) 1. Di conseguenza, le membrane fusibile virus-cellula, e il capside virale (CA) nucleo viene rilasciato nel citoplasma 2. Il nucleo CA contiene il genomico RNA virale a singolo filamento (ssRNA) e diverse proteine, sia virali e cellulare in origine. Le proteine ​​virali CA-associati includono trascrittasi inversa (RT) e integrasi (IN), due enzimi che mediano passaggi critici durante eventi precoci nella replicazione virale. La RT ed in funzione nel contesto di complessi nucleoproteina, cioè la trascrizione inversa Complex (RTC) e il complesso di pre-integrazione (PIC), rispettivamente 3, 4, 5 &lt;sup&gt;, 6. Le estremità del virale ssRNA genoma porto terminale di ripetizione (R) elementi adiacenti alla unica sequenze U5 (al 5 &#39;) e U3 (al 3&#39;). Il RTC converte il genoma virale ssRNA in un (ds) copia di DNA a doppia elica (vDNA). Questo processo di trascrizione inversa provoca anche la duplicazione delle U5 e U3 sequenze, generando così ripetizioni terminali lunghe (LTR) ad entrambe le estremità del vDNA 7, 8. Successivamente, il IN PIC-associata catalizza due reazioni biochimiche sequenziali che consentono l&#39;integrazione del vDNA nel cromosoma ospite 9, 10, 11. Innanzitutto, nel citoplasma, IN multimeri coinvolgere sia LTR 12 e fendere un dinucleotide da ciascuna delle estremità 3&#39;-terminali. Questa elaborazione 3&#39;-end genera un gruppo ossidrilico ad ogni 3&#39;-end (CA OH) del vDNA.Avanti, PIC traffici al nucleo, in cui IN utilizza il vDNA CA OH come nucleofilo per tagliare entrambi i filamenti di DNA cromosomico in modo sfalsato. Contemporaneamente, IN giunzioni coordinatamente due estremità del vDNA ai legami fosfodiestere risultanti sui filamenti opposti del DNA cromosomico. A seguito di questa fase di trasferimento filone, il macchinario cellula ospite rimuove i due nucleotidi spaiati alle estremità 5 &#39;del vDNA e riparazioni le conseguenti lacune singolo filamento allo svincolo del sito di integrazione. I primi eventi culminano quindi con la creazione di una copia di DNA integrato (provirus) del virus HIV-1 genoma. Il provirus fornisce un ambiente adatto per l&#39;espressione genica virale efficiente, che avvia eventi successivi, compreso l&#39;espressione delle proteine ​​virali codificate; assemblaggio del virus immaturo; e in erba, il rilascio e la maturazione in virioni infettivi 13. Purificata ricombinante retrovirale IN è competente aeffettuare, in vitro, sia attività di trasformazione e di trasferimento filo 3&#39;-end in modo esogeno forniti LTR-come il DNA substrato. Studi biochimici utilizzando tali ricombinante purificata hanno rivelato aspetti critici vDNA integrazione 14, 15, 16, 17. Tuttavia, a differenza di infezione naturale, questa reazione biochimica in vitro non supporta l&#39;integrazione concertata di entrambe le estremità del DNA substrato nel DNA bersaglio. Al contrario, i PIC retrovirali isolate da cellule con infezione acuta concertata integrano entrambe le estremità della vDNA endogena nel DNA bersaglio eterologo. Ciò ha portato alla diffusa adozione e le successive raffinatezze di saggi in vitro Integration (IVI) I n usando isolati PIC nativi. Nel primo saggio riportato retrovirale IVI, estratti citoplasmatici di cellule infettate con un murino ricombinanteLeukemia Virus (MLV) ospitare il gene E. coli supF nella sua LTR servito come fonte di attività IN, e il DNA di fago lambda mutante difettoso in crescita litico fu esogenamente forniti come il DNA bersaglio. Successful integrazione del ricombinante MLV DNA copia nel DNA fagico e l&#39;espressione conseguente supF portato al ripristino della capacità di formazione di placca dei fagi ricombinanti. Tuttavia, questa strategia sperimentale è laboriosa e misure di integrazione in maniera indiretta. Per far fronte a tali avvertimenti, un test indiretto end-etichettatura Southern Blot-based, che quantifica l&#39;attività IVI PIC-associata come misura della vDNA endogena integrato in esogeni batteriofago linearizzato phiX174 DNA, è stato sviluppato 6, 7, 18. Anche se questo metodo fornisce una misura diretta di eventi di integrazione, sono necessarie quantità relativamente elevate di preparazione PIC, che rimane tecnicamente difficilesforzo. Per aggirare questo, sono stati sviluppati test basati sulla PCR nested che richiedono solo modeste quantità di PIC 4, 5, 19. In questo rapporto, descriviamo una versione aggiornata di un nested PCR-based metodo in vitro ideato per ricapitolare l&#39;attività di integrazione di HIV-1 PIC-mediata che si verificano durante l&#39;infezione naturale. Questo metodo utilizza gli estratti citoplasmatici delle cellule bersaglio HIV-1-infetti come fonte di attività PIC endogena, che viene misurata con un tempo reale Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Le procedure per isolare PIC e misurare le loro attività di integrazione sono adattati, con modificazioni, dalla protocolli pubblicati dal laboratorio Engelman 20. In questo metodo, l&#39;attività di integrazione PIC-associato viene avviato fornendo un target DNA esogeno lineari 21, ed i prodotti di DNA risultanti dallaquesta reazione integrazione sono purificate e utilizzato come materiale di partenza per la quantificazione successiva basata sulla PCR. Nel primo turno convenzionale PCR, le giunzioni del DNA virale bersaglio sono amplificati utilizzando primer appropriati. Nel secondo turno qPCR, primer LTR-specifici vengono utilizzati per arricchire specificamente la popolazione vDNA dal primo turno di PCR prodotti. Vedere la sezione protocollo per una descrizione dettagliata di questo metodo. Studi in vitro con PIC retrovirali hanno portato a significativi progressi nella nostra comprensione del meccanismo di integrazione del DNA retrovirale e nello sviluppo di inibitori IN. Sulla base della recente maggiore attenzione alla mappatura di HIV-1 siti di integrazione, determinare il ruolo dei fattori virali e dell&#39;ospite in HIV-1 integrazione e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali alla lotta contro la resistenza ai farmaci, prevediamo un crescente interesse e l&#39;uso diffuso di IVI saggi , come quello descritto in questa relazione. Questo, a sua volta, porterà afuturi perfezionamenti nel metodo, diversificando in tal modo la portata delle sue applicazioni.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomycin solution (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HEK293T celle (293T) </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> Clone molecolare provirale HIV-1 pNL4-3 </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Program </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> PolyFect reagente di trasfezione </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNasi 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1 cellule</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,2 - 7,5 (soluzione pronta all'uso)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di potassio (KCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60142 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di magnesio (MgCl2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Sigma-Aldrich<> /p> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> <pRNasi A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 Forma replicativa 1 DNA </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F primer: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen e/o IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA polimerasi </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick kit di estrazione del gel </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata ultrapura </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) tampone (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Acido etilendiammina tetraacetico, soluzione di sale disodico (EDTA), 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K (20 mg/mL soluzione pronta all'uso)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolo (equilibrato con 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0 e 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glycogen (5 mg/mL soluzione)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio (3 M, pH 5,2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>Primo turno LTR primer: 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' Primo turno phiX174 primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen e/o IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>Secondo turno LTR-R primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Secondo turno LTR-U primer: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Secondo turno Taqman probe: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen e/o IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione in vitro integrazione di attività del virus hiv-1 preintegrazione complessi

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

proteine ​​HIV-1 busta impegnano recettori cognate sulla superficie delle cellule bersaglio, che porta a fusione della membrana virale delle cellule seguita dal rilascio del nucleo capside virale (CA) nel citoplasma. Successivamente, il virale trascrittasi inversa (RT), come parte di un complesso omonimo nucleoproteina definito il trascrizione inversa Complex (RTC), converte il virale genoma RNA a singolo filamento in una copia di DNA a doppio filamento (vDNA). Questo porta alla biogenesi di un altro complesso nucleoproteina, chiamato il complesso di pre-integrazione (PIC), composto dal vDNA e proteine ​​del virus associati e fattori dell&#39;ospite. L&#39;integrasi virale PIC-associato (IN) orchestra l&#39;integrazione della vDNA nel DNA cromosomico host in un processo in due fasi temporalmente e spazialmente regolamentato. Innanzitutto, l&#39;IN elabora estremità 3 &#39;della vDNA nel citoplasma e, dall&#39;altro, dopo il PIC traffici al nucleo, essa media integrazione del vDNA trasformata nel DNA cromosomico. I PIC isolatida cellule bersaglio con infezione acuta da HIV-1 sono funzionali in vitro, in quanto sono competenti per integrare il vDNA associato in un DNA bersaglio eterologo esogena aggiunto. Tale PIC-based nei test di integrazione in vitro hanno contribuito in modo significativo a delineare i dettagli meccanicistici di integrazione retrovirale e alla scoperta IN inibitori. In questo rapporto, elaboriamo su un test HIV-1 PIC aggiornato che si avvale di un annidato in tempo reale Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR) strategia basata su per misurare l&#39;attività in vitro integrazione di isolati PIC nativi.

L'isolamento del virus HIV-1 PIC Uno schema del protocollo usato per l'isolamento del virus HIV-1 PIC da cellule SUP-T1 infezione acuta è illustrato in Figura 1. Questo protocollo è derivato dai metodi descritti da Engelman et al. 19, 20. HIV-1 PIC sono complessi nucleoproteici che vengono assemblati nelle cellule infette e so...

Questo rapporto descrive un test in vitro per misurare l'attività di integrazione associata al complesso di preintegrazione (PIC) del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) negli estratti citoplasmatici di cellule infettate acutamente. L'integrazione del DNA dell'HIV-1 associato a PIC nel DNA bersaglio eterologo viene quantificata utilizzando una strategia di reazione a catena della polimerasi nidificata in tempo reale.

Misurazione In Vitro Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività di integrazione in vitro di complessi di pre-integrazione, o PIC, isolati da cellule SupT1 infette da HIV-1. Questo metodo risponderà ad alcune delle domande chiave nella biologia dell'HIV, in particolare in che modo alcuni fattori dell'ospite e fattori virali, ad esempio il capside virale, svolgono un ruolo nell'integrazione del DNA dell'HIV-1, e così facendo ci aiuterà a progettare o identificare nuovi bersagli per la terapia antiretrovirale. Il vantaggio principale di questo metodo è che richiede una quantità relativamente piccola del complesso di pre-integrazione, o PIC, per misurare l'attività di integrazione in vitro.Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi alla diagnosi e alla terapia dell'HIV-1 AIDS, e questo perché le versioni precedenti di questa tecnica sono state fondamentali nella scoperta degli inibitori dell'integrasi dell'HIV-1, che sono uno dei principali farmaci anti-HIV in uso clinico oggi, quindi questo metodo non può essere utilizzato solo per comprendere l'integrazione dell'HIV-1, ma può essere applicato anche per studiare altri retrovirus, come RSV e MLV. A dimostrare questo protocollo sarà il Dr.Muthukumar Balasubramaniam, che è un borsista post-dottorato in laboratorio. Per infettare SupT1 con HIV-1, in un laboratorio BSL-2, mantenere le cellule SupT1 tra una e due volte 10 al sesto di cellule per millilitro nel Roswell Park Memorial Institute o in un terreno RPMI integrato con il 10% di FBS e Pen-Strep.Dopo aver generato titoli elevati di HIV-1 infettivo secondo il protocollo di testo, raggruppare le cellule SupT1 dai flaconi di coltura, mescolare bene mediante pipettaggio e utilizzare la colorazione di esclusione con blu di tripano in un emocitometro per determinare la conta delle cellule vitali. Aliquotare otto volte 106 cellule per infezione virale in provette da centrifuga coniche da 50 millilitri, quindi centrifugare le cellule in un rotore a secchio oscillante a 500 volte g e 25 gradi Celsius per cinque minuti. Senza rimuovere il terreno di coltura cellulare, trasferire le provette contenenti le cellule pellettate al laboratorio BSL-3 per un'ulteriore lavorazione, quindi aspirare accuratamente il terreno dalla provetta senza disturbare il pellet.Successivamente, aggiungere 30 millilitri di inoculo virale trattato con DNasi I alle cellule e mescolare pipettando delicatamente, quindi distribuire uniformemente la miscela tra due piastre di coltura tissutale a sei pozzetti. Per la spinoculazione, posizionare le piastre di coltura in portapiastre e centrifugare in un rotore a secchio oscillante a 480 volte g e 25 gradi Celsius per due ore, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per cinque ore. Per raccogliere e lisare le cellule infette, riunire le cellule corrispondenti a ciascuna infezione in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri.Centrifugare le cellule a 300 volte g e 25 gradi Celsius per 10 minuti, quindi aspirare o pipettare con cura il surnatante. Per rimuovere eventuali particelle virali residue, lavare ogni pellet aggiungendo due millilitri di tampone K meno meno e centrifugare nuovamente il campione, quindi senza disturbare il pellet, rimuovere con cura il surnatante per aspirazione o con una pipetta prima di ripetere il lavaggio ancora una volta. Dopo aver rimosso accuratamente il tampone residuo con una micropipetta, utilizzare il tampone di lisi ghiacciato K plus plus per risospendere delicatamente ogni pellet e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.Per preparare i complessi citoplasmatici di pre-integrazione, o PIC, agitare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi posizionare le provette in un rotore pre-raffreddato a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1.500 volte g e quattro gradi Celsius per quattro minuti. Senza disturbare il pellet, trasferire con cura il surnatante in una provetta da microcentrifuga nuova e centrifugare a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto. Trasferire con cura il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca, quindi aggiungere la RNasi A a una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro e incubare il contenuto a temperatura ambiente senza oscillare per 30 minuti.Aggiungere il saccarosio a una concentrazione finale del 7% e mescolare bene pipettando delicatamente, quindi preparare le aliquote dei PIC in provette per microcentrifuga. Congelare in azoto liquido e mettere in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi per una conservazione a lungo termine. Per preparare il DNA bersaglio utilizzato nell'integrazione in vitro o nel saggio IVI, assemblare le miscele PCR per amplificare una regione di 2,0 kilobasi dal DNA plasmidico phiX174 utilizzando i primer personalizzati phiX174-Forward e phiX174-Reverse ed eseguire la PCR utilizzando il programma secondo il protocollo di testo.Dopo la purificazione con gel e l'aliquotazione del campione, aggiungere 600 nanogrammi di DNA bersaglio a 200 microlitri di PIC. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Arrestare la reazione IVI aggiungendo SDS, EDTA e proteinasi K, quindi mescolare accuratamente il contenuto della reazione e incubare a 56 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, per purificare il DNA totale dalla reazione IVI, aggiungere un volume uguale di fenolo al campione deproteinizzato. Mescolare energicamente a vortice e centrifugare per due minuti. Rimuovere con cautela la fase acquosa superiore e trasferirla in una nuova provetta prima di ripetere l'estrazione del fenolo, quindi aggiungere un volume uguale di cloroformio fenolico uno a uno.Mescolare il campione mediante vortice e centrifugare la provetta per due minuti, quindi trasferire la fase acquosa superiore in una provetta nuova. Dopo l'estrazione con cloroformio secondo il protocollo di testo, precipitare il DNA dalla fase acquosa aggiungendo 0,1 microgrammi per microlitro di glicogeno, 0,3 molari di acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato al 100%. Posizionare il tubo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, centrifugare il campione a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti, quindi rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Per eseguire la PCR per quantificare l'attività del PIC, iniziare con il primo ciclo di PCR convenzionale utilizzando primer mirati all'LTR virale e al DNA phiX174 per amplificare le giunzioni del DNA integrato dell'HIV-1. Assemblare la miscela master meno il DNA stampo come descritto qui, quindi erogare aliquote da 45 microlitri in provette PCR separate e aggiungere cinque microlitri di DNA stampo o acqua priva di nucleasi come controllo.Eseguire la reazione in un termociclatore utilizzando il programma descritto nel protocollo di testo, quindi eseguire un secondo ciclo di PCR quantitativa e analizzare i dati secondo il protocollo di testo. In questo test IVI, i SupT1 sono stati spinoculati con l'HIV-1 trattato con DNAsi I e l'assenza o la presenza dell'inibitore dell'integrasi dell'HIV-1, Raltegravir. Dopo l'incubazione, i PIC sono stati isolati e il DNA purificato è stato analizzato per l'integrazione del DNA virale.Come mostrato qui, i PIC dell'HIV-1 integrano in modo robusto il DNA virale associato nel DNA bersaglio e l'efficienza dell'IVI dei PIC è stata notevolmente ridotta nelle reazioni integrate con Raltegravir, il che implica fortemente l'attività di integrazione misurata in questo test con l'integrasi dell'HIV-1. Le reazioni di controllo non hanno mostrato alcuna attività di integrazione. Inoltre, il controllo che ha escluso la Taq polimerasi nel primo ciclo di PCR non ha amplificato i prodotti di integrazione.In particolare, i dati del solo controllo PIC hanno indicato che la strategia qPCR nidificata misurava specificamente il DNA virale integrato, ma non il DNA virale associato a PIC. Collettivamente, questi dati dimostrano l'attività di integrazione associata al PIC. Una volta padroneggiati, la preparazione del virus e i saggi PCR per quantificare l'attività PIC possono essere completati in una settimana.L'infezione delle cellule SupT1 e l'isolamento dei PIC dalle cellule infette possono essere effettuati in un giorno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i PIC dell'HIV-1 e misurare l'attività di integrazione in vitro. Non dimenticare che lavorare con titoli elevati di HIV-1 infettivo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni appropriate, inclusi indumenti protettivi come grembiuli e camici, doppi guanti e occhiali protettivi.

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