Misurazione In Vitro Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività di integrazione in vitro di complessi di pre-integrazione, o PIC, isolati da cellule SupT1 infette da HIV-1. Questo metodo risponderà ad alcune delle domande chiave nella biologia dell'HIV, in particolare in che modo alcuni fattori dell'ospite e fattori virali, ad esempio il capside virale, svolgono un ruolo nell'integrazione del DNA dell'HIV-1, e così facendo ci aiuterà a progettare o identificare nuovi bersagli per la terapia antiretrovirale. Il vantaggio principale di questo metodo è che richiede una quantità relativamente piccola del complesso di pre-integrazione, o PIC, per misurare l'attività di integrazione in vitro.

Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi alla diagnosi e alla terapia dell'HIV-1 AIDS, e questo perché le versioni precedenti di questa tecnica sono state fondamentali nella scoperta degli inibitori dell'integrasi dell'HIV-1, che sono uno dei principali farmaci anti-HIV in uso clinico oggi, quindi questo metodo non può essere utilizzato solo per comprendere l'integrazione dell'HIV-1, ma può essere applicato anche per studiare altri retrovirus, come RSV e MLV. A dimostrare questo protocollo sarà il Dr.Muthukumar Balasubramaniam, che è un borsista post-dottorato in laboratorio. Per infettare SupT1 con HIV-1, in un laboratorio BSL-2, mantenere le cellule SupT1 tra una e due volte 10 al sesto di cellule per millilitro nel Roswell Park Memorial Institute o in un terreno RPMI integrato con il 10% di FBS e Pen-Strep.

Dopo aver generato titoli elevati di HIV-1 infettivo secondo il protocollo di testo, raggruppare le cellule SupT1 dai flaconi di coltura, mescolare bene mediante pipettaggio e utilizzare la colorazione di esclusione con blu di tripano in un emocitometro per determinare la conta delle cellule vitali. Aliquotare otto volte 106 cellule per infezione virale in provette da centrifuga coniche da 50 millilitri, quindi centrifugare le cellule in un rotore a secchio oscillante a 500 volte g e 25 gradi Celsius per cinque minuti. Senza rimuovere il terreno di coltura cellulare, trasferire le provette contenenti le cellule pellettate al laboratorio BSL-3 per un'ulteriore lavorazione, quindi aspirare accuratamente il terreno dalla provetta senza disturbare il pellet.

Successivamente, aggiungere 30 millilitri di inoculo virale trattato con DNasi I alle cellule e mescolare pipettando delicatamente, quindi distribuire uniformemente la miscela tra due piastre di coltura tissutale a sei pozzetti. Per la spinoculazione, posizionare le piastre di coltura in portapiastre e centrifugare in un rotore a secchio oscillante a 480 volte g e 25 gradi Celsius per due ore, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per cinque ore. Per raccogliere e lisare le cellule infette, riunire le cellule corrispondenti a ciascuna infezione in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri.

Centrifugare le cellule a 300 volte g e 25 gradi Celsius per 10 minuti, quindi aspirare o pipettare con cura il surnatante. Per rimuovere eventuali particelle virali residue, lavare ogni pellet aggiungendo due millilitri di tampone K meno meno e centrifugare nuovamente il campione, quindi senza disturbare il pellet, rimuovere con cura il surnatante per aspirazione o con una pipetta prima di ripetere il lavaggio ancora una volta. Dopo aver rimosso accuratamente il tampone residuo con una micropipetta, utilizzare il tampone di lisi ghiacciato K plus plus per risospendere delicatamente ogni pellet e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.

Per preparare i complessi citoplasmatici di pre-integrazione, o PIC, agitare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi posizionare le provette in un rotore pre-raffreddato a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1.500 volte g e quattro gradi Celsius per quattro minuti. Senza disturbare il pellet, trasferire con cura il surnatante in una provetta da microcentrifuga nuova e centrifugare a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto. Trasferire con cura il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca, quindi aggiungere la RNasi A a una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro e incubare il contenuto a temperatura ambiente senza oscillare per 30 minuti.

Aggiungere il saccarosio a una concentrazione finale del 7% e mescolare bene pipettando delicatamente, quindi preparare le aliquote dei PIC in provette per microcentrifuga. Congelare in azoto liquido e mettere in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi per una conservazione a lungo termine. Per preparare il DNA bersaglio utilizzato nell'integrazione in vitro o nel saggio IVI, assemblare le miscele PCR per amplificare una regione di 2,0 kilobasi dal DNA plasmidico phiX174 utilizzando i primer personalizzati phiX174-Forward e phiX174-Reverse ed eseguire la PCR utilizzando il programma secondo il protocollo di testo.

Dopo la purificazione con gel e l'aliquotazione del campione, aggiungere 600 nanogrammi di DNA bersaglio a 200 microlitri di PIC. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Arrestare la reazione IVI aggiungendo SDS, EDTA e proteinasi K, quindi mescolare accuratamente il contenuto della reazione e incubare a 56 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, per purificare il DNA totale dalla reazione IVI, aggiungere un volume uguale di fenolo al campione deproteinizzato. Mescolare energicamente a vortice e centrifugare per due minuti. Rimuovere con cautela la fase acquosa superiore e trasferirla in una nuova provetta prima di ripetere l'estrazione del fenolo, quindi aggiungere un volume uguale di cloroformio fenolico uno a uno.

Mescolare il campione mediante vortice e centrifugare la provetta per due minuti, quindi trasferire la fase acquosa superiore in una provetta nuova. Dopo l'estrazione con cloroformio secondo il protocollo di testo, precipitare il DNA dalla fase acquosa aggiungendo 0,1 microgrammi per microlitro di glicogeno, 0,3 molari di acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato al 100%. Posizionare il tubo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, centrifugare il campione a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti, quindi rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Per eseguire la PCR per quantificare l'attività del PIC, iniziare con il primo ciclo di PCR convenzionale utilizzando primer mirati all'LTR virale e al DNA phiX174 per amplificare le giunzioni del DNA integrato dell'HIV-1. Assemblare la miscela master meno il DNA stampo come descritto qui, quindi erogare aliquote da 45 microlitri in provette PCR separate e aggiungere cinque microlitri di DNA stampo o acqua priva di nucleasi come controllo.

Eseguire la reazione in un termociclatore utilizzando il programma descritto nel protocollo di testo, quindi eseguire un secondo ciclo di PCR quantitativa e analizzare i dati secondo il protocollo di testo. In questo test IVI, i SupT1 sono stati spinoculati con l'HIV-1 trattato con DNAsi I e l'assenza o la presenza dell'inibitore dell'integrasi dell'HIV-1, Raltegravir. Dopo l'incubazione, i PIC sono stati isolati e il DNA purificato è stato analizzato per l'integrazione del DNA virale.

Come mostrato qui, i PIC dell'HIV-1 integrano in modo robusto il DNA virale associato nel DNA bersaglio e l'efficienza dell'IVI dei PIC è stata notevolmente ridotta nelle reazioni integrate con Raltegravir, il che implica fortemente l'attività di integrazione misurata in questo test con l'integrasi dell'HIV-1. Le reazioni di controllo non hanno mostrato alcuna attività di integrazione. Inoltre, il controllo che ha escluso la Taq polimerasi nel primo ciclo di PCR non ha amplificato i prodotti di integrazione.

In particolare, i dati del solo controllo PIC hanno indicato che la strategia qPCR nidificata misurava specificamente il DNA virale integrato, ma non il DNA virale associato a PIC. Collettivamente, questi dati dimostrano l'attività di integrazione associata al PIC. Una volta padroneggiati, la preparazione del virus e i saggi PCR per quantificare l'attività PIC possono essere completati in una settimana.

L'infezione delle cellule SupT1 e l'isolamento dei PIC dalle cellule infette possono essere effettuati in un giorno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i PIC dell'HIV-1 e misurare l'attività di integrazione in vitro. Non dimenticare che lavorare con titoli elevati di HIV-1 infettivo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni appropriate, inclusi indumenti protettivi come grembiuli e camici, doppi guanti e occhiali protettivi.