L'isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

L'obiettivo generale di questa metodologia ELISpot è quello di consentire la quantificazione delle cellule B che secernono anticorpi umani dal sangue. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico sull'immunologia delle cellule B e sulla ricerca sui vaccini. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente il rilevamento e la misurazione delle cellule B secernenti anticorpi a livello di singola cellula.

A dimostrare la procedura sarà Tsung-Chih Tseng, uno studente laureato del mio laboratorio. Immediatamente dopo aver prelevato un campione di sangue da 10 ml dalla vena cubitale mediana in una provetta da 15 ml contenente EDTA integrato con potassio, capovolgere la provetta più volte per prevenire la formazione di coaguli. Quindi aggiungere 35 ml di tampone di lisi dei globuli rossi autoclavato alle cellule per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.

Quando la luce può essere osservata attraverso il tubo, centrifugare il sangue e confermare la presenza di un pellet bianco. Rimuovere il tampone di lisi residuo con 10 ml di PBS autoclavato e risospendere il pellet in 10 ml di terreno RPMI 1640. Piastra le cellule in un piatto di coltura da 10 cm per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica.

Quindi agitare delicatamente la piastra di coltura alcune volte e trasferire le cellule galleggianti in una provetta conica di plastica da 15 ml. Dopo due lavaggi per centrifugazione, risospendere il pellet a 5-10 volte il decimo della concentrazione di sei cellule per ml in 200 microlitri di tampone PBS freddo e aggiungere 5 microlitri di cocktail di anticorpi anti-umani biotinilati specifici per le cellule del sangue per un decimo delle seste cellule. Dopo un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, lavare le cellule in un volume di PBS sterile in eccesso di 10 volte e risospendere il pellet in cinque microlitri di microsfere coniugate con streptavidina per una volta il decimo delle sei cellule per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio.

Al termine dell'incubazione, aggiungere due ml di tampone PBS alle cellule e posizionare la provetta su un supporto magnetico per otto minuti a temperatura ambiente. Quando le microsfere si sono attaccate alla parete della provetta, trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta conica e aggiungere altri 2 ml di tampone PBS alle cellule. Dopo la seconda raccolta del surnatante, raccogliere le cellule raggruppate mediante centrifugazione e trasferire le cellule in una provetta di polistirene da cinque ml e in un tampone PBS fresco a una decima delle sette cellule per ml di concentrazione.

Dopo aver eseguito il blocco non specifico, aggiungere un microgrammo di ciascun anticorpo di selezione per una volta il decimo delle sei cellule alla provetta mescolando delicatamente per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio. Durante gli ultimi cinque minuti dell'incubazione, aggiungere cinque microlitri di 7-AAD alle cellule. Quindi aggiungere due millilitri di PBS fresco alle cellule e vorticare prima di centrifugare.

Risospendere il pellet in un tampone di selezione fresco a una concentrazione da uno a cinque volte il decimo delle sette celle per millilitro e filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un nuovo tubo di polistirene da cinque millilitri. Quindi smistare le cellule mediante citometria a flusso in tre provette da 15 ml contenenti 5 ml di terreno RPI fresco per raccogliere le cellule B naive, le cellule B di memoria e le plasmacellule plasmablastiche. Quando tutte le cellule sono state raccolte, seminare i sottoinsiemi in pozzetti individuali di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti a una concentrazione da uno a dieci volte il decimo della quinta cellula per millilitro in terreno RPMI fresco.

Successivamente, attivare le cellule B con cinque microgrammi di CPG ODN 2006 per una volta il decimo delle cellule del sesto per millilitro per pozzetto nell'incubatore di coltura cellulare per cinque giorni. Al termine dell'attivazione, aggiungere 30 micro litri di etanolo al 35% e acqua distillata in ogni pozzetto delle piastre ELISpot per 30 secondi. Quindi sostituire l'etanolo in ogni pozzetto con 150 microlitri di acqua distillata in autoclave e incubare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti per rimuovere l'etanolo residuo.

Eseguire un lavaggio PBS seguito dall'aggiunta di 50 microlitri del frammento policlonale FAB2 di IG anti-umano a ciascun pozzetto. Lavare le piastre due volte con PBS come appena dimostrato. Bloccare il legame non specifico in ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS fresco con BSA per due ore a temperatura ambiente.

Dopo un'altra serie di lavaggi PBS, incubare i pozzetti in 100 micro litri di terreno RPMI 1640 fresco a 37 gradi Celsius. Quindi sostituire il terreno in ogni pozzetto ELISpot con il numero appropriato di cellule B attivate. Portare il volume finale di ciascun pozzetto a 150 microlitri con un terreno RPMI fresco, quindi rimettere la piastra ELISpot nell'incubatore per colture cellulari per 8-14 ore.

Al termine del periodo di incubazione, scartare il terreno e lavare i pozzetti con 200 micro litri di PBS plus tween20 per cinque lavaggi di tre minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere gli anticorpi di rilevamento appropriati ai pozzetti corrispondenti e incubare le piastre per due ore al buio. Dopo un'altra serie di lavaggi PBS, aggiungere 50 microlitri di substrato BCIPMBT a ciascun pozzetto per cinque-15 minuti a temperatura ambiente.

Quando compaiono macchie viola, interrompere la reazione con 100 micro litri di acqua distillata doppia per pozzetto e sciacquare la piastra con acqua corrente del rubinetto. Quindi asciugare all'aria la membrana ELISpot protetta dalla luce. In questo campione di PBMC del donatore, dopo lisi dei globuli rossi e deplezione delle cellule aderenti, circa il 10% dei linfociti erano cellule B CD19 positive.

Nel compartimento delle cellule B, circa il 50% delle cellule erano cellule B naive CD27 negative e il 50% erano cellule B di memoria che esprimevano CD27. Il trattamento CPG di cellule B umane purificate e CD19+CD27+ per cinque giorni, come appena dimostrato, si traduce tipicamente nella generazione di 50-200 cellule IgM e da 10 a 50 cellule anticorpali IgG da una volta dieci alla quarta cellula B attivata. Una volta padroneggiata, questa tecnica ELISpot può essere completata in tre ore se eseguita correttamente.

Prima di iniziare questa procedura, è importante ricordarsi di codificare il luogo con reagenti di cattura appropriati per rilevare le cellule secernenti anticorpi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della vaccinologia per esplorare l'efficacia del vaccino in studi su larga scala e follow-up longitudinali. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come purificare le cellule B umane dal sangue.

Separare le cellule B naive e di memoria per la loro differenziazione ed eseguire un saggio ELISpot per qualificare le cellule secernenti anticorpi. Non dimenticare che lavorare con il sangue umano può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i guanti.