Name: Lisolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Impara a isolare, differenziare e quantificare le cellule B secernenti anticorpi dal sangue umano utilizzando il saggio ELISpot. Questo metodo permette di analizzare la risposta immunitaria umorale a livello di singola cellula.

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Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca del Ministero della Scienza e della Tecnologia dello Yuan Esecutivo di Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). Desidero ringraziare l'eccellente servizio fornito dal nucleo di analisi e smistamento citometrico a flusso del primo laboratorio di base del College of Medicine dell'Università Nazionale di Taiwan.

sangue periferico umano deve essere ottenuto da donatori sani sotto il consenso informato, e l&#39;uso di campioni di sangue deve essere conforme alle linee guida approvate stabiliti dalle singole schede di revisione istituzionale. In questo studio, il protocollo da utilizzare sangue umano in una dimostrazione dei risultati di citometria a flusso (Figura 1) e saggi ELISPOT (Figura 3) è stato approvato dal Consiglio riesame interno della National Taiwan University Hospital (numero di protocollo 201307019RINB). 1. isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B <ol><li> Draw ~ 10 ml di sangue dalla vena mediana cubitale (nella fossa anterior cubitale al gomito) in una provetta da 15 ml contenente K 2 EDTA (da 1,5 a 2,0 mg / ml di sangue) e immediatamente invertire la provetta diverse volte per impedire coagulo formazione. </li><li> Aggiungere 35 ml di autoclave (121 ° C, 15 min) di globuli rossi (RBC) tampone di lisi (150 mm NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, e 1 mM EDTA; pH 7.4) per il tubo contenente il campione di sangue fresco (≥ 3: 1 vol / vol) e incubare a temperatura ambiente (RT) per non più di 5 min. NOTA: L&#39;aspetto della trasmissione della luce attraverso il tubo indica il completamento di RBC lisi. </li><li> Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Assicurarsi che il pellet è di colore bianco. </li><li> Risospendere il pellet con 10 ml di autoclavato PBS (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, e 1,47 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) e centrifugare come al punto 1.3. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pellet con 10 ml di terreno RPMI 1640 (integratori: 10% di siero fetale di vitello, 100 U / mL di penicillina / streptomicina, 0,25 mg / ml di amfotericina B, e 2 mM L-glutammina), e poi piastra del le cellule in una capsula di Petri di 10 cm (10 ml di sangue per ogni piatto). Posizionare il piatto in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 per 30 min. </li><li> Agitare delicatamente il piatto cultura un paio di volte e posizionare ilterreno di coltura (cellule in sospensione) in tubi conici di plastica da 15 ml. Eliminare le cellule aderenti (per lo più macrofagi) sulle piastre di coltura. </li><li> Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet con 1 ml di RPMI 1640 medium. Contare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. NOTA: La vitalità dei leucociti isolati è normalmente superiore al 90% per esclusione trypan blu. </li><li> Centrifugare come al punto 1.7 e risospendere le cellule in ~ 200 ml di tampone PBS freddo (0,5% di siero albumina bovina (BSA) e 2 mM EDTA) alla concentrazione di 5 - 10 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di biotinilato Ab cocktail anti-umano specifico per le cellule del sangue (per la selezione negativa di cellule B) per 10 6 cellule e incubare su ghiaccio per 30 min 21. NOTA: L&#39;Ab cocktail anti-umano dovrebbe includere almeno Abs specifico per CD2 (o CD3), CD14, CD16 e. </li><li> Aggiungere un volume in eccesso di 10 voltedi PBS sterile per le cellule, centrifugare a 600 xg per 5 min, e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere la stessa quantità di microperle streptavidina coniugato (5 ml per 10 6 cellule) al pellet e mescolare accuratamente. </li><li> Incubare in ghiaccio per 30 min in una provetta conica da 15 ml in plastica. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone PBS nella provetta. </li><li> Posizionare il tubo in un supporto magnetico e incubare a temperatura ambiente per 8 min. Le microsfere marrone gradualmente allegare alla parete del tubo accanto al magnete 22. </li><li> Con il tubo rimanente nel supporto magnetico, trasferire accuratamente il surnatante in una nuova provetta sterile da 15 mL 22. </li><li> Ripetere i passaggi 1,14-1,16, e combinare le due surnatanti che contengono le cellule B incontaminati. Eliminare le microsfere. </li><li> Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in terreno RPMI 1640 per esperimenti a valle. NOTA: in genere, 1 - 5 x 10 5 B cellule ingegnoah purezza superiore al 95% da 10 mL di sangue periferico può essere isolata 23. </li></ol> 2. Le cellule purificazione e separazione della Memoria e della Naïve B da cellule B isolate <ol><li> Utilizzare le cellule purificate dal punto 1 e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatica. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone PBS freddo dopo centrifugazione a 600 xg ed RT per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 - 2 mg di biotinilato mAb CD27 per 10 6 cellule e incubare su ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di tampone PBS nella provetta e centrifugare a 600 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 50 ml di tampone PBS. </li><li> Aggiungere la stessa quantità di microsfere magnetiche streptavidina (1 - 2 mg / 10 6 celle) alle cellule in una provetta di plastica conico da 15 ml. </li><li> Delicatamente mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere 2 - 3 mL di tampone PBS al tubo. </li><li> Posiziona iltubo in un supporto magnetico e incubare a temperatura ambiente per 8 minuti per consentire le microsfere marrone da allegare al lato più vicino al magnete. </li><li> Con il tubo nel supporto magnetico, trasferire accuratamente il surnatante in una nuova provetta sterile. Questa frazione contiene il CD27 arricchito - le cellule B naïve. </li><li> Aggiungere 5 mL alla provetta contenente le microsfere e risospendere delicatamente le microsfere (cioè, la frazione arricchita di cellule CD27 + B memoria) 24-25. </li><li> Centrifugare a 600 xg a temperatura ambiente per 5 min. Risospendere il pellet con RPMI 1640 medium per gli esperimenti a valle. NOTA: Tipicamente, ~ 30 - 60% della cellule B può essere purificato come celle di memoria CD27 + dalle PBMC di un donatore sano 7, 25-26. </li></ol> 3. separazione delle cellule per la raccolta di cellule naive B, cellule B di memoria, e PBS / PC <ol><li> Utilizzando le cellule purificate dal punto 1, determinare il numero di cellule utilizzando un hemocytometer o un contatore di cellule automatica. </li><li> Risospendere le cellule in tampone PBS freddo alla concentrazione di 10 7 per ml in provette di polistirene da 5 mL. </li><li> Aggiungere 1 - 2 mg di IgG umana per 10 6 cellule e incubare su ghiaccio per 10 min per il blocco Fc. </li><li> Aggiungere 1 mg ciascuno di anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323), e anti-CD38-PE (clone: HIT2) per 10 6 cellule; mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min 4, 27. </li><li> Negli ultimi 5 minuti al punto 3.4, aggiungere 5 ml di 7-aminoactinomycin commerciale D (7-AAD). </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS al tubo, vortex e centrifugare a 600 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in classificare tampone (PBS sterile con 2% BSA e 2 mM EDTA) ad una concentrazione di 1 - 5 x 10 7 cellule per ml in un tubo da 15 ml. </li><li> Filtrare le cellule attraverso un colino cella di rete di nylon (40 micron dimensione dei pori) per eliminare grumi di cellule. </li><li> Separare le cellule con un flusso citometria sortaER dotato di tre laser: viola (405 nm), blu (488 nm), e rosso (640 nm). NOTA: il solo laser blu è sufficiente per 3 colori citometria a flusso 27-28. </li><li> Ordina le cellule in tre tubi da 15 ml (contenenti 5 ml di terreno RPMI) per la raccolta simultanea di cellule B naive (CD19 + CD27 -), celle di memoria B (CD19 + CD27 +), e PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28. NOTA: Ordinati cellule B naive e della memoria possono essere coltivate come descritto al punto 4. </li></ol> 4. La differenziazione in vitro di cellule CD19 isolati umana + B, CD19 + CD27 + cellule B di memoria, e CD19 + CD27 - cellule naive B <ol><li> Utilizzando le cellule purificate nei passaggi 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinare il numero di cellule con un emocitometro o un contatore di cellule automatica. </li><li> Risospendere le cellule con RPMI 1640 mediumad una concentrazione di 1 - 10 x 10 5 per mL e Aliquotare nei pozzetti di una piastra 12 pozzetti. </li><li> Aggiungere CpG (ODN 2006) a 5 mg / 10 6 cellule / ml 18, 29. </li><li> Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 per 5 giorni. </li><li> Raccogliere le cellule di ogni bene, metterli separatamente in provette da 15 ml, aggiungere 5 ml di PBS in ogni provetta, e centrifugare a 600 xg e RT per 5 min. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatica. Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 - 10 x 10 5 per ml con RPMI 1640 medium. </li></ol> 5. ELISpot Assay <ol><li> Aggiungere 30 ml di 35% di etanolo in acqua distillata a ciascun pozzetto di piastre ELISPOT per 30 s. NOTA: quando pipettando, evitare di toccare la membrana nei pozzetti in ogni momento. </li><li> Capovolgere le piastre ELISPOT per rimuovere l&#39;etanolo. </li><li> Mettere 150 ml di DDH autoclave 2 O in ciascun pozzetto e incubareli a temperatura ambiente per 5 minuti per lavare via l&#39;etanolo residuo; seguire con un lavaggio di PBS sterile a temperatura ambiente per 3 min. NOTA: I passaggi da 5.1 a 5.3 possono essere opzionali, a seconda della fabbricazione delle piastre. </li><li> Mettere 50 ml di 5 mg / mL policlonale (ab &#39;) F 2 frammento di antiumano Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in ciascun pozzetto delle piastre ELISPOT e incubare a 4 ° C per una notte (preferito) o 37 ° C per 2 h 11. NOTA: Sigillare i bordi delle piastre con parafilm fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Capovolgere le piastre per rimuovere Abs non legato, aggiungere 200 ml di soluzione salina in ogni pozzetto e incubare per due volte a temperatura ambiente per 3 minuti ogni volta. </li><li> Aggiungere 200 ml di PBS con 5% BSA (o RPMI 1640 medium) a ciascun pozzetto per il blocco, e incubare a temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Capovolgere le piastre per rimuovere il tampone di bloccaggio. Lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di PBS, come al punto 5.5. </li><li> Aggiungere 100 ml di RPMI 1640 medium ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C. </li><li> Quando si è pronti a seminare le cellule, capovolgere le piastre per rimuovere il supporto RPMI 1640. </li><li> Seme 100 microlitri (5 x 10 4), 50 ml (2,5 x 10 4), e 25 ml (1,25 x 10 4) delle celle (dai passi 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 e 4.6) nei pozzetti di una piatto ELISpot. Con terreno RPMI 1640, portare il volume a 150 ml / pozzetto. NOTA: Un minimo di uno o due diluizioni seriali di 2 volte per la placcatura le cellule è raccomandato. </li><li> Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 per 8 - 14 h 18. Evitare di spostare le piastre durante l&#39;incubazione. </li><li> Capovolgere le piastre per rimuovere le cellule e RPMI 1640 medium. </li><li> Aggiungere 200 microlitri / pozzetto di PBS-T (PBS con 0,05% Tween 20) e incubate a temperatura ambiente per 5 volte, ogni volta per 3 min. Capovolgere la piastra per rimuovere il tampone di lavaggio tra ciascuna delle 5 lavaggi. </li><li> Aggiungere o fosfatasi alcalina IgG di capra anti-umano (AP), Abs Fcy-specifico (per il rilevamento IgG, 1: 5000 in PBS-T) O di capra anti-IgM umane-AP, Fcμ specifico frammento Abs (per il rilevamento IgM, 1: 5000 in PBS-T) nei pozzetti ed incubare a temperatura ambiente per 2 ore al buio. </li><li> Lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di PBS, come al punto 5.5. </li><li> Aggiungere 50 ml bromochloroindolyl soluzione di substrato / pozzetto di fosfato-nitro blu tetrazolio (BCIP / NBT). macchie viola-colorati appaiono normalmente in 5 - 15 min. </li><li> Aggiungere 100 microlitri / pozzetto di DDH 2 O per evitare l&#39;eccessivo sviluppo di macchie. </li><li> Lavare i piatti con acqua corrente dopo lo sviluppo completo di tutti i punti. </li><li> Rimuovere la underdrain delle piastre e consentire loro di aria secca nella scura. </li><li> Contare le macchie utilizzando un lettore di piastre automatizzato con una unità di immagine di acquisizione / analisi (ad esempio, uno scanner automatico o manualmente tramite un microscopio da dissezione). NOTA: Le piastre possono essere conservati a RT al buio e analizzati in seguito. </li></ol>

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L'autore dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

Isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B Normalmente, globuli rossi possono essere efficacemente rotti e liquidati con tampone di lisi (passo 1,2). È importante non incubare PBMC con il tampone di lisi RBC più di 5 minuti, come vitalità cellulare può essere influenzata dal cloruro di ammonio. In alternativa, globuli rossi e piastrine possono essere contemporaneamente rimossi dalla seguente protocollo. Mescolare sangue intero fresco c...

cellule B svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di immunità umorale. Inizialmente si sviluppano nel midollo osseo ed entrano nel flusso sanguigno come cellule naive B, che possono migrare nei tessuti linfoidi, come la milza, i linfonodi, tonsille e, per un ulteriore sviluppo. Su Ag incontro, alcune cellule B naïve migrano in follicoli linfoidi, dove il centro germinale cellule B possono differenziarsi in cellule di memoria B e plasmablasts (PBS) / plasmacellule (PC). Mentre la maggior parte dei PC PBS / uscita nel flusso sanguigno, alcuni infine risiedono nel midollo osseo di sottoporsi a differenziazione terminale nei PC di lunga durata 1. Cellule B in circolazione sono eterogenei, e allo stato stazionario, PBS / PC sono rari nel sangue periferico 2. Come risultato della disponibilità di marcatori di superficie specifici lineage, citometria a flusso è diventato un metodo popolare per l&#39;identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi B-cellule nel sangue periferico. Un&#39;applicazione estesa di cytometr flussoy è l&#39;aggiunta di una funzione cell sorter, che permette la separazione e l&#39;isolamento di singoli sottogruppi di cellule B con elevata purezza. Sulla base della espressione dei recettori di superficie specifici a diversi stadi di sviluppo, che circolano cellule B umane sono generalmente classificati in tre sottopopolazioni principali: le cellule B naive (CD19 + CD27 - CD38 -), le cellule B di memoria (CD19 + CD27 + CD38 -), e PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figura 1). le cellule B naïve per natura non hanno incontrato Ags. Tuttavia, possono essere differenziate in cellule IgM + CD27 + B di memoria. Anche se le cellule B naïve sono omogenei nell&#39;esprimere recettore per l&#39;antigene delle cellule B (BCR) molecole -associated (ad esempio, CD19, CD20 e CD22) siano eterogenei nella loro immunoglobuline repertorio 5. La maggior parte delle cellule CD27 + B di memoria può essere differenziato in CD27+ / hi CD38 + PBS / PC 6. Inoltre, le cellule B di memoria e PBS / PC sono policlonali ed esibiscono evolutiva e funzionale l&#39;eterogeneità 4-7. PBS / PC in circolazione sono normalmente di breve durata e non esprimono CD138, ma quelli fatti di stabilirsi nel midollo osseo saranno terminali differenziare e diventare di lunga durata. Terminalmente differenziate PC esprimono CD138 e giù-regolano le molecole CD27 sulla loro superficie 8. Dal momento che sia PB e PC sono in grado di secernere Abs, in molte occasioni sono collettivamente indicati come ASC. Al contrario, né le cellule B naïve né cellule B di memoria in grado di produrre quantità apprezzabili di Abs 9-10. Tuttavia, quando isolato, entrambe le cellule B naive e memoria possono essere differenziati in ASC in 3 - 10 giorni, quando sono immessi nelle condizioni di coltura appropriate 6, 11-15. Infatti, ASC derivati da in vitro la differenziazione delle azioni simili espressioni superficiali di CD27 e CD38 con i diretti isolato frsangue periferico om 6. Inoltre, le ASC differenziate in vitro esprimono un basso livello di CD20 superficie, simile quella di PBS / PC 6 in circolazione. Anche se le ASC cultura di derivazione sono tutti di breve durata, possono secernono Abs, che indica che essi sono funzionalmente competenti e in grado di contribuire alla immunità umorale. Sia ELISA e ELISpot sono di gran lunga i metodi più comunemente applicato con cui ottenere informazioni funzionali sulla risposta immunitaria umorale. ELISA è un test piastra base 96 pozzetti, ed è utilizzato frequentemente per misurare i titoli di siero Abs Ag-specifica ed altri analiti (ad esempio, citochine). E &#39;conveniente e scalabile. ELISA è progettato per utilizzare un saggio enzimatico in fase solida per rilevare la presenza di Abs o altre sostanze, quali siero, in un campione liquido 16. Le letture da ELISA siero sono stati ampiamente utilizzati per rappresentare la risposta immunitaria del corpo. Uno strumento necessario per l&#39;acquisizione di riadouts da ELISA test è un lettore spettrofotometrico. Il lettore può determinare la densità ottica (OD) dei prodotti finali tipicamente risultanti dalla reazione di perossidasi di rafano (HRP) coniugata Abs rilevamento e loro substrati specifici 17. Per quanto riguarda la segnalazione della risposta immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA denotano collettivo, ma non individuale, prestazioni di ASC nel corpo. Inoltre, ELISA non tiene conto della partecipazione dalle cellule B di memoria, che non secernono Abs. Come ELISA, ELISpot è un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione e il monitoraggio della risposta immunitaria nei campioni di sangue periferico 17-18. ELISpot è una tecnica relativa a un sandwich ELISA. In esso, le cellule vengono inseriti nella difluoruro di polivinilidene (PVDF) pozzi membrana-backed di 96 pozzetti per una cultura a breve termine. Il saggio ELISPOT è analogo all&#39;esecuzione di western blotting su una micropiastra e developing le macchie sulla membrana PVDF in ogni pozzetto. è richiesto un sistema di lettore ELISpot automatico o uno stereomicroscopio per il conteggio manuale. Il vantaggio principale di ELISpot nel rilevare una risposta immunitaria è la sua eccezionale sensibilità nella quantificazione di ASC e cellule secernenti citochine. Riporta le loro attività funzionali in immunità umorale e cellulare, rispettivamente. Nella misurazione della funzione immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA e il numero di ASC enumerate da ELISpot sono spesso correlati, ma le letture dati da questi due saggi hanno alcune differenze nelle implicazioni funzionali 19-20. Il vantaggio principale di ELISpot è la sua sensibilità del metodo. Il livello di siero titoli Ab come riportato da ELISA è presentato semi-quantitativamente come letture OD, che indica il livello Ab relativa, o più quantitativamente, come letture di concentrazione quando una quantità nota dei propri isotipi di Abs è incluso per riferimento. Al contrario, i risultati di ELISpot sono Presented come il numero assoluto di ASC in un pool di cellule di interesse (ad esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico non frazionate (PBMC) e le cellule B purificate da PBMC). ELISpot può rilevare una singola ASC, ma ELISA richiede quantità Ab da ASC raggiungere concentrazioni dosaggio-dipendente ottimizzate prima della misura. Quindi, ELISpot è ovviamente superiore a ELISA nella sensibilità di quantificazione. Inoltre, ELISpot è adatto anche per quantificare le ASC differenziate in vitro da cellule B di memoria attivate. le cellule B di memoria non secernono Abs ma possono differenziarsi in ASC al momento di attivazione; non hanno quindi alcun contributo di Abs siero rilevati da ELISA. Così, ELISpot è il metodo di scelta nella misurazione della risposta immunitaria delle cellule B della memoria circolanti dopo l&#39;attivazione in coltura. Esso consente il monitoraggio del mantenimento dell&#39;immunità umorale a lungo termine.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>provetta da 10 mL</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td> soluzione di <td></td></tr><tr><td>blu di tripano allo 0,5%</td> senza endotossine <td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Set per l'arricchimento dei linfociti B umani IMag</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilato CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Microsfere magnetiche di streptavidina</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>provette Falcon da 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare a rete in nylon blu, 40 &; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>clone HIB19</td></tr><tr><td>Anti-umano CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Anti-umano CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>clone HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Clone anti-umano CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Clone anti-umano CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>HI30</td></tr><tr><td>Anti-umano CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-topo/ratto/umano CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>clone LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-umano CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>clone L128</td></tr><tr><td>Anti-umano CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-umano CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-umano CD20-FITC</td><td>BD Biosciences 555622</td><td></td><td>clone 2H7</td></tr><tr><td>biotinilato anti-umano CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>biotinilato anti-umano CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomicina D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>tipo B CpG</td></tr><tr><td>Umano ricombinante IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Umano ricombinante IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A di S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen piastre filtranti, 0,45 &; m dimensione dei</td><td>pori Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>piastra filtrante sterile e trasparente a 96 pozzetti con membrana PVDF idrofobica</td></tr><tr><td>Soluzione BCIP/NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT singolo, substrato di fosfatasi alcalina</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, frammento</td><td>Fc Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 frammento di capra anti-umano Ig (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-umano IgG-fosfatasi alcalina, F&gamma; frammento specifico</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-umano IgM-fosfatasi alcalina, Fc&micro; frammento specifico</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-umano IgG-perossidasi, Fc&gamma; frammento specifico</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-umano IgM-perossidasi, Fc&micro; frammento specifico</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT Kit substrato AEC</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. Analizzatore ImmunoSpot</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di human anticorpo-secernenti cellule b da sanguigno: elispot come una lettura funzionale del umorale immunità

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Il segno distintivo dell&#39;immunità umorale è generare ASC funzionali, che sintetizzano e secernono Abs specifici per un antigene (Ag), come un agente patogeno, e sono utilizzati per difesa dell&#39;ospite. Per la determinazione quantitativa dello stato funzionale della risposta immunitaria umorale di un individuo, sia Abs siero e ASC circolanti sono comunemente misurati come letture funzionali. Negli esseri umani, sangue periferico è il campione più conveniente e facilmente accessibile che può essere utilizzato per la determinazione della risposta immunitaria umorale indotta da cellule ospiti B. sottoinsiemi delle cellule B distinte, tra cui ASC, possono essere isolate direttamente dal sangue periferico mediante selezione con microsfere Ab-coniugati specifici lineage o tramite cella di smistamento con citometria a flusso. Inoltre, purificato le cellule B naive e memoria possono essere attivati ​​e differenziate in ASC nella cultura. Le attività funzionali di ASC per contribuire alla Ab secrezione può essere quantificata ELISpot, che è un metodo che converge enzimasaggio linked immunoabsorbance (ELISA) e le tecnologie di Western blotting per consentire l&#39;enumerazione dei singoli ASC a livello di singola cellula. In pratica, il saggio ELISPOT è stato usato sempre per valutare l&#39;efficacia del vaccino a causa della facilità di trattamento di un gran numero di campioni di sangue. I metodi di isolare cellule B umane da sangue periferico, la differenziazione delle cellule B in ASC in vitro, e l&#39;impiego di ELISpot per la quantificazione del totale IgM e IgG-ASC verranno descritte qui.

PBMC sono state esaurite di globuli rossi e cellule aderenti (passi 1,2-1,7). Una aliquota (2 x 10 6) di cellule sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica per illustrare le popolazioni di cellule naive B, cellule B di memoria, e PBS / PC nel sangue periferico (Figura 1). In PBMC di questo donatore, circa il 10% dei linfociti erano cellule CD19 + B. Nel vano B-cell, la percentuale di CD19 + CD27 - cellule B naive era di...

Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

L'obiettivo generale di questa metodologia ELISpot è consentire la quantificazione di cellule B umane secernenti anticorpi presenti nel sangue. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo biomedico riguardo all'immunologia delle cellule B e alla ricerca sui vaccini. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette il rilevamento e la misurazione delle cellule B secernenti anticorpi a livello singola cellula.La procedura sarà dimostrata da Tsung-Chih Tseng, uno studente laureato del mio laboratorio. Immediatamente dopo aver prelevato un campione di sangue di 10 ml dalla vena cubitale media in un tubo da 15 ml contenente EDTA con potassio, capovolgere il tubo più volte per prevenire la formazione di coaguli. Successivamente, aggiungere 35 ml di tampone lisico per globuli rossi autoclavato alle cellule e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Quando la luce è visibile attraverso il tubo, centrifugare il sangue e confermare la presenza di un pellet bianco. Rimuovere il buffer di lisi residuo con 10 ml di PBS sterilizzato in autoclave e risospendere il pellet in 10 ml di mezzo RPMI 1640. Piastrare le cellule in una piastra da coltura da 10 cm e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica.Quindi agitare delicatamente la piastra di coltura alcune volte e trasferire le cellule in sospensione in un tubo conico di plastica da 15 ml. Dopo due lavaggi mediante centrifugazione, risospendere il pellet a una concentrazione da cinque a 10 volte dieci alla sesta cellule per ml in 200 microlitri di tampone PBS freddo e aggiungere 5 microlitri di un cocktail di anticorpi antiumani biotinilati specifici per cellule ematiche per ogni dieci alla sesta cellule. Dopo un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio, lavare le cellule con un volume in eccesso di 10 volte di PBS sterile e risospendere il pellet in cinque microlitri di microperle coniugate con streptavidina per ogni dieci alla sesta cellule, per un'ulteriore incubazione di 30 minuti sul ghiaccio.Al termine dell'incubazione, aggiungere due ml di tampone PBS alle cellule e posizionare il tubo su un supporto magnetico per otto minuti a temperatura ambiente. Quando le microperle si sono attaccate alla parete del tubo, trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo tubo conico e aggiungere altre 2 ml di tampone PBS alle cellule. Dopo la raccolta del secondo soprannatante, raccogliere le cellule combinate mediante centrifugazione e trasferire le cellule in un tubo di polistirene da cinque ml con tampone PBS fresco a una concentrazione di un decimo delle sette cellule per ml.Dopo aver eseguito il blocco non specifico, aggiungere un microgrammo di ciascun anticorpo di selezione per ogni decimo delle sei cellule nel tubo, mescolando delicatamente, e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Durante gli ultimi cinque minuti dell'incubazione, aggiungere cinque microlitri di 7-AAD alle cellule. Successivamente, aggiungere due millilitri di PBS fresco alle cellule e vortexare prima della centrifugazione.Risospendere il pellet in un volume fresco di buffer di sorting pari a uno a cinque decimi della concentrazione di sette cellule per millilitro e filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un nuovo tubo in polistirene da 5 millilitri. Successivamente, separare le cellule mediante citometria a flusso in tre tubi da 15 ml contenenti 5 ml di mezzo RPI fresco per raccogliere le cellule B naive, le cellule B della memoria e i plasmablasti/cellule plasmatiche. Una volta raccolte tutte le cellule, seminare i sottoinsiemi in pozzetti separati di una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti a una concentrazione di uno a dieci decimi della quinta potenza di cellule per millilitro in mezzo RPMI fresco.Successivamente, attivare i linfociti B con cinque microgrammi di CPG ODN 2006 per 1 × 10⁶ cellule per millilitro per pozzetto nell'incubatore per colture cellulari per cinque giorni. Al termine dell'attivazione, aggiungere 30 microlitri di etanolo al 35% in acqua distillata in ogni pozzetto delle piastre ELISpot per 30 secondi. Quindi sostituire l'etanolo in ogni pozzetto con 150 microlitri di acqua doppio-distillata autoclavata e incubare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti per rimuovere l'etanolo residuo.Eseguire un lavaggio con PBS seguito dall'aggiunta di 50 microlitri del frammento FAB2 policlonale anti-Ig umana in ogni pozzetto. Lavare le piastre due volte con PBS come appena dimostrato. Bloccare il legame non specifico in ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS fresco contenente BSA per due ore a temperatura ambiente.Dopo un'ulteriore serie di lavaggi con PBS, incubare le pozzette in 100 microlitri di mezzo RPMI 1640 fresco a 37 gradi Celsius. Quindi sostituire il mezzo in ciascuna pozzetta ELISpot con il numero appropriato di linfociti B attivati. Portare il volume finale di ogni pozzetta a 150 microlitri aggiungendo mezzo RPMI fresco, quindi reinserire la piastra ELISpot nell'incubatrice per colture cellulari per un periodo di otto a 14 ore.Al termine del periodo di incubazione, eliminare il mezzo e lavare le pozzette con 200 microlitri di PBS contenente tween20 per cinque lavaggi della durata di tre minuti ciascuno. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere gli anticorpi di rilevamento appropriati nelle rispettive pozzette e incubare le piastre per due ore al buio. Dopo un’ulteriore serie di lavaggi con PBS, aggiungere 50 microlitri di substrato BCIPMBT in ogni pozzetta per un periodo compreso tra cinque e quindici minuti a temperatura ambiente.Quando compaiono macchie viola, interrompere la reazione aggiungendo 100 microlitri di acqua doppio-distillata per pozzetto e risciacquare la piastra con acqua corrente. Successivamente, lasciare asciugare all'aria il filtro ELISpot al riparo dalla luce. In questo campione di PBMC del donatore, dopo la lisi dei globuli rossi e l'eliminazione delle cellule aderenti, circa il 10 percento dei linfociti era costituito da cellule B positive per CD19.Nel compartimento dei linfociti B, circa il 50 percento delle cellule erano linfociti B naive CD27 negativi e il 50 percento erano linfociti B della memoria esprimenti CD27. Il trattamento con CPG di linfociti B umani purificati e CD19+CD27+ per cinque giorni, come appena dimostrato, porta tipicamente alla generazione di 50-200 cellule secernenti anticorpi IgM e da 10 a 50 cellule secernenti IgG a partire da 1×10⁴ linfociti B attivati. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica ELISpot può essere completata in tre ore se eseguita correttamente.Prima di iniziare questa procedura, è importante ricordare di codificare il posto con opportuni reagenti di cattura per rilevare le cellule secernenti anticorpi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della vaccinologia per esplorare l'efficacia dei vaccini in studi su larga scala e nei follow-up longitudinali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare le cellule B umane dal sangue.Separare le cellule B naive e quelle della memoria per la loro differenziazione ed eseguire un saggio ELISpot per qualificare le cellule secernenti anticorpi. Non dimenticare che lavorare con sangue umano può essere pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunologia e Infezioni

L'identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l'uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

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Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

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Lisolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità (Video) | JoVE Journal

L'isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

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