Display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sfruttare il controllo di qualità del ripiegamento della via di traslocazione gemella-arginina per ingegnerizzare il legame del frammento di anticorpo e il ripiegamento intracellulare in un unico passaggio che avrà applicazioni nell'ingegneria degli anticorpi per funzionare a livello intracellulare. Questo metodo può aiutare a superare le sfide chiave nel campo dell'ingegneria degli anticorpi, come il superamento della difficoltà di ingegnerizzare gli anticorpi per ripiegarsi e funzionare correttamente nell'ambiente citoplasmatico riducente. Solo gli anticorpi che si ripiegano bene nel citoplasma vengono visualizzati e analizzati per il legame.

Fornendo un vantaggio rispetto al lievito e al phage display che si basano su vie secretorie per il display. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia delle malattie neurodegenerative, del cancro e delle infezioni virali perché queste malattie coinvolgono la patogenesi intracellulare che potrebbe essere presa di mira dagli anticorpi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché capire come generare e lavorare con gli sferoplasti è impegnativo.

Dopo aver fuso la libreria scFv con la sequenza di segnale ssTorA e averla fatta crescere a 37 gradi Celsius con agitazione per tre ore, consentire l'espressione della libreria scFv a 20 gradi Celsius e 225 giri/min durante la notte per 15-22 ore. Dopo l'incubazione, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 600 nanometri. Quindi centrifugare il volume calcolato di coltura indotta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a 12.000 volte g e temperatura ambiente per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e utilizzare 100 microlitri di tampone di frazionamento ghiacciato o fB per risospendere i pellet. Quindi centrifugare i campioni a 12.000 volte g e a temperatura ambiente per un minuto. Dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare 350 microlitri di fB ghiacciato integrato con 3,5 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di lisozima per risospendere i pellet.

Successivamente, mentre si agitano lentamente le provette, aggiungere goccia a goccia 700 microlitri di EDTA da 1 millimolare, quindi incubare le provette su un rotatore di provette a temperatura ambiente per 20 minuti per miscelare i campioni. Rimuovere i tubi dal rotatore. Aggiungere 50 microlitri di MgCl2 a punta fredda a cinque molari in ciascuna provetta e incubarli su ghiaccio per 10 minuti.

Quindi centrifugare i campioni a 11.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Ora, con una micropipetta e una punta da un millilitro, prelevare lentamente una parte del pellet. Quindi, tenendo la provetta, inclinandola con l'apertura direttamente sopra una nuova provetta da 1,5 millilitri, sollevare lentamente la punta della pipetta dal surnatante e far scorrere il pellet nella nuova provetta.

Dopo aver rimosso il surnatante in eccesso, utilizzare un millilitro di PBS ghiacciato per risospendere gli sferoplasti. Gli sferoplasti devono essere completamente risospesi prima del panning perché gli scFvs non leganti presenti negli aggregati porteranno a falsi positivi dal panning. Dopo aver biotinilato l'antigene bersaglio secondo il protocollo di testo, risospendere le microsfere magnetiche rivestite di streptavidina nella loro fiala originale.

Quindi trasferire da sette a 10 volte da 10 a 9 perline in un tubo da 1,5 millilitri. Posizionare la provetta di perline sulla rastrelliera magnetica per due minuti per raccogliere le perle sul lato della provetta e pipettare per rimuovere con cura il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e utilizzare il PBS per risospendere le perline senza generare bolle.

Quindi rimetti il tubo nel magnete e rimuovi il tampone prima di lavare le perline altre due volte con PBS. Aggiungere un millilitro di lisato contenente l'antigene biotinilato alle perle e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti ruotando delicatamente. Dopo l'incubazione, utilizzare PBS con l'1% di BSA per lavare le perle cinque volte.

Quindi utilizzare PBS con l'1% di BSA per risospendere le perline. Per lo screening della libreria scFv, iniziare aggiungendo quattro volte 10 al 9° sferoplasto e otto volte 10 all'8° perlina in una provetta sterile da 15 millilitri. Aggiungi un x PBS con l'1% di BSA per portare il volume totale a quattro millilitri.

Quindi aliquotare la soluzione in quattro provette da 1,5 millilitri da un millilitro ciascuna e incubare le reazioni a quattro gradi Celsius ruotando delicatamente per cinque ore. Per preparare gli sferoplasti legati a perline per la PCR, posizionare le provette di reazione di panning sul magnete per tre minuti. Rimuovere il surnatante e lavare le perline con un x PBS con l'1% di BSA quattro volte come prima.

Quindi utilizzare 25 microlitri di ddH20 per tubo per risospendere le perle. Come descritto nel protocollo di testo, eseguire la PCR dell'intero plasmide per amplificare i geni per scFvs legati a perline e quindi reciclarizzare il plasmide dal prodotto PCR. Trasforma l'intera reazione in celle equalizzate MC4100 secondo il protocollo di testo.

Per identificare i cloni utilizzando ELISA, scongelare una provetta della sottolibreria panned e la piastra su piastre di agar LB. Aggiungere 200 microlitri di LB con 20 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a fondo rotondo da 96 pozzetti. Con la punta di una pipetta, prelevare una singola colonia dalla piastra di agar.

Quindi posizionare la punta nel primo pozzetto della piastra a 96 pozzetti e mescolare delicatamente per inoculare. Continuare a inoculare una colonia in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius per 20-24 ore su un agitatore per micropiastre.

Dopo aver preparato una soluzione di rivestimento dell'antigene target secondo il protocollo di testo, aggiungere 50 microlitri di soluzione a ciascun pozzetto di una piastra ELISA in polistirene trasparente ad alto legame a 96 pozzetti. Incubare le piastre a quattro gradi Celsius durante la notte. Quindi, replicare le colonie dalle piastre di coltura a 96 pozzetti su piastre di agar secondo il protocollo di testo.

Quindi, svuotare la soluzione di rivestimento dalle piastre ELISA e aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante preparata secondo il protocollo di testo a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per almeno due ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Aggiungere 20 microlitri di un detergente concentrato per lisi cellulare a ciascun pozzetto della piastra di coltura a fondo rotondo e incubare la piastra di coltura su un agitatore per micropiastre a temperatura ambiente per 15-20 minuti.

Svuotare la soluzione bloccante dalle piastre ELISA e lavare i pozzetti quattro volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio preparato secondo il protocollo di testo. Dopo aver rimosso il lavaggio finale, trasferire 50 microlitri da ciascun pozzetto della piastra di lisi cellulare al pozzetto corrispondente della piastra ELISA. Incubare le piastre a temperatura ambiente per una o due ore.

Procedere allo svuotamento dei campioni dalla piastra ELISA e lavare i pozzetti quattro volte. Successivamente, preparare la soluzione anticorpale per rilevare scFvs secondo il protocollo di testo. Aggiungere 50 microlitri di anticorpo a ciascun pozzetto e incubare per una o due ore a temperatura ambiente.

Lavare le piastre ELISA quattro volte con il tampone di lavaggio prima di aggiungere 200 microlitri per pozzetto di substrato HRP preparato secondo il protocollo del produttore. Incubare le piastre al buio a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Per spegnere la reazione, aggiungere 50 microlitri di H2SO4 a tre molari in ciascun pozzetto e pipettare delicatamente per miscelare la soluzione.

Infine, misurare l'assorbanza utilizzando una lettura su piastra a 492 nanometri. In questo esperimento, gli anticorpi scFv scFv13 e scFv13. R4 sono stati fusi con la sequenza nativa di ssTorA o con una ssTorA modificata che non è riconosciuta dalla via di traslocazione gemella-arginina, chiamata anche via Tat.

R4 si piega bene ed è espresso sulla membrana interna quando viene infuso a ssTorA nativo. ScFv13 non si piega bene e non viene visualizzato sulla membrana interna, indipendentemente dal peptide segnale Tat con cui è fuso. Questi risultati dimostrano che solo le proteine che contengono il peptide segnale Tat e sono correttamente ripiegate nel citoplasma vengono visualizzate sulla membrana interna, consentendo alla via Tat di funzionare come schermo per il ripiegamento intracellulare.

In questo esperimento, una libreria PCR soggetta a errori basata su scFv13, che ha un basso livello di affinità di legame per la beta-galattosidasi, è stata stroncata contro beta-gal. ScFv 1-4 è stato isolato e ha mostrato una maggiore affinità di legame con beta-gal rispetto a scFv13, nonché un livello più elevato di solubilità citoplasmatica. Utilizzando scFv 1-4 come concorrente rispetto alla libreria scFv 1-4 di seconda generazione, scFv 2-1 e 2-3 sono stati isolati e hanno dimostrato affinità di legame ancora più elevate per il beta-gal rispetto a scFv13 1-4, evidenziando l'ingegnerizzazione simultanea della solubilità e del legame dell'antigene.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'ELISA con lisato purificato, al fine di verificare la specificità dell'antigene e determinare l'affinità di legame dei cloni isolati. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come eseguire lo screening di un anticorpo per operare per il legame con un antigene di interesse utilizzando il percorso Tat per visualizzare quella libreria e il panning delle microsfere magnetiche per arricchire e isolare i leganti dell'antigene. Non dimenticare che lavorare con l'acido solforico può essere estremamente pericoloso ed è necessario indossare un adeguato dispositivo di protezione individuale.