Name: Display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Impara a selezionare frammenti di anticorpi per affinità e solubilità utilizzando il pathway di translocazione twin-arginine in Escherichia coli. Questo metodo innovativo supera le sfide dell'ingegneria degli anticorpi intracellulari.

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Ringraziamo Tomer Zohar per il lavoro svolto sui saggi di screening e caratterizzazione scFv. Una parte di questo lavoro è stata supportata dal premio numero F32CA150622 dal National Cancer Institute (all'AJK). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Cancer Institute o del National Institutes of Health.

<ol><li>Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+immunization+with+cytosolic+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.</a> Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).</li>
<li>Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+antibodies+as+a+new+class+of+therapeutic+molecules+for+gene-therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy.</a> Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).</li>
<li>Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+antibody+fragments+neutralizing+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+provide+an+experimental+basis+for+the+structural+classification+of+the+DNA+polymerase+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family.</a> J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).</li>
<li>Mhashilkar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+Tat-mediated+LTR+transactivation+and+HIV-1+infection+by+anti-Tat+single+chain+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.</a> Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).</li>
<li>Strube, R. W., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anti-cyclin+E+single-chain+Fv+antibodies+and+intrabodies+in+breast+cancer+cells%3A+enhanced+intracellular+stability+of+novel+sFv-F-c+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies.</a> J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).</li>
<li>Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+selection+of+antibodies+without+antigen+purification%3A+adaptation+of+the+protein+fragment+complementation+assay+to+select+antigen-antibody+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs.</a> J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).</li>
<li>Wörn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).</li>
<li>Knappik, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+turns+of+a+recombinant+antibody+improve+its+in+vivo+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.</a> Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).</li>
<li>Martineau, P., Jones, P., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+antibody+fragment+at+high+levels+in+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm.</a> J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).</li>
<li>Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+statistics+reliably+predict+stabilizing+mutations+in+a+protein+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain.</a> J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).</li>
<li>Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+with+bacterial+display%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering with bacterial display.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).</li>
<li>Lener, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverting+a+protein+from+its+cellular+location+by+intracellular+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies.</a> Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).</li>
<li>Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+scFv+intrabody+against+the+nonamyloid+component+of+%CE%B1-synuclein+reduces+intracellular+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity.</a> J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).</li>
<li>Gai, S. A., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+for+protein+engineering+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display for protein engineering and characterization.</a> Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).</li>
<li>Kieke, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+functional+T+cell+receptor+mutants+from+a+yeast+surface-display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).</li>
<li>Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+sequences+directing+cotranslational+translocation+expand+the+range+of+proteins+amenable+to+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display.</a> Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).</li>
<li>Pugsley, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+general+secretory+pathway+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.</a> Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).</li>
<li>Rapoza, M. P., Webster, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filamentous+bacteriophage+assembly+proteins+require+the+bacterial+SecA+protein+for+correct+localization+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane.</a> J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).</li>
<li>Karlsson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antibody+fitness+and+function+using+membrane-anchored+display+of+correctly+folded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins.</a> J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).</li>
<li>DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+quality+control+in+the+export+of+proteins+by+the+bacterial+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).</li>
<li>Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+for+protein+solubility+enabled+by+the+folding+quality+control+feature+of+the+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway.</a> Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).</li>
<li>Maynard, J., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Antibody engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--the+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).</li>
<li>Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+using+streptavidin+magnetic+bead-sorted+in+vivo+biotinylated+survivin+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production.</a> J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).</li>
<li>Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+inhibition+of+nucleosome+mobility+and+transcription+by+cisplatin-DNA+interstrand+crosslinks+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells.</a> Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).</li>
<li>Bogsch, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+component+of+a+novel+bacterial+protein+export+system+with+homologues+in+plastids+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).</li>
<li>Julian, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+affinity+and+stability+of+grafted+amyloid-motif+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies.</a> Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+rise+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies rise again.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).</li>
<li>Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ingegneria anticorpi per l&#39;attività citoplasmatica è un compito difficile a causa l&#39;ambiente riducente del citoplasma, che impedisce la formazione di legami disolfuro stabilizzante 6,7. Questo fa sì che la maggior parte degli anticorpi di essere cytoplasmically inattiva meno che non siano progettati per la stabilità e la solubilità nel citoplasma, oltre ad essere progettato per affinità di legame. I metodi esistenti di phage display, visualizzazione di superficie batterica, e metodi di visualizzazione superficiali lievito utilizzare tutti la via secretoria 14-16 per la visualizzazione di anticorpi ingegnerizzati, ma questi metodi non hanno mezzi per progettare piegatura intracellulare. Anticorpi ingegnerizzati utilizzando visualizzazione interna membrana hanno migliorato la stabilità citoplasmatica e la solubilità in quanto il controllo di qualità di piegatura del percorso Tat impedisce traslocazione di anticorpi che sono mal ripiegate e instabili nel citoplasma. Questo metodo semplifica il processo iterativo di anticorpi intracellulari engineering per affinità unnd solubilità, come i due sono costruiti in un unico passaggio. Anche se questo metodo è stato progettato per ingegneria anticorpi con solubilità in ambiente intracellulare riduzione, può essere applicato anche ad anticorpi ingegneria di funzionare in condizioni non riducenti, poiché le proteine ​​progettati utilizzando questo metodo mantenere il loro ripiegamento nell&#39;ambiente ossidante periplasma. Sebbene questa tecnica semplifica il processo di ingegneria anticorpi con alta affinità e alta solubilità citoplasmatica, diverse limitazioni sono importanti da considerare quando si utilizza questo protocollo. Quando si analizzano i segnali ELISA schermo secondario da identificare promettenti scFv varianti, la soglia per discernere tra le varianti potenzialmente interessanti e quelli che non possono esibire adeguata antigene vincolante non è probabile che sia evidente solo dopo parecchi cloni sono stati ulteriormente caratterizzati. E &#39;importante cercare migliorata legame sopra l&#39;anticorpo genitore; però,un segnale anormalmente elevato potrebbe essere indicativo di avidità 29 o effetti di aggregazione 30, una sfida che non riguardano solo l&#39;approccio di screening del display interno-membrana. Una limitazione chiave da ricordare quando si utilizza questo protocollo è l&#39;incapacità di recuperare sferoplasti dopo panning, in quanto sono non vitali (dati non pubblicati). Ciò richiede le fasi di amplificazione del DNA e trasformazione di recuperare i plasmidi codificanti anticorpi. Parecchi punti critici del protocollo consentono dell&#39;ingegneria simultanea di piegatura e legame di anticorpi. Per lo screening per avere successo, la libreria di scFv viene proiettato deve essere espressa come una fusione al segnale peptide ssTorA. Senza questa sequenza, gli anticorpi non saranno indirizzati al percorso Tat e quindi non saranno traslocati al periplasma 19. Inoltre, è imperativo che un epitopo C-terminale è fuso agli anticorpi per consentire il rilevamento degli anticorpi visualizzati nel bidonesaggi ding. Chiaramente, la E. coli ceppo utilizzato per esprimere i scFv deve avere anche la necessaria macchinari percorso Tat, ma questo è vero per la E. comunemente utilizzati ceppi coli. Modifiche questo protocollo è possibile migliorare il suo potenziale di isolare anticorpi con le caratteristiche desiderate. Un passo panning sottrattiva può essere completata prima di panning contro l&#39;antigene bersaglio per esaurire la biblioteca scFv dei costituenti non desiderato. I sferoplasti biblioteca possono essere incubate con perline magnetiche rivestite con BCCP da solo o rivestita con una proteina non desiderato, ei sferoplasti che si legano a quelle sfere possono essere eliminati prima dello screening i restanti sferoplasti non legati per il legame con il target desiderato. Come indicato nelle Risultati rappresentativi, un metodo per migliorare l&#39;affinità di un isolato scFv è quello di includere un concorrente solubili nella reazione panning di competere con gli scFv visualizzati sulle sferoplasti. Perché il comp solubileetitor è una proteina purificata, nessun DNA viene amplificato da esso, in modo che solo le sequenze di scFv esposti sulle sferoplasti saranno recuperati nella reazione PCR. Inoltre, questo metodo potrebbe essere estesa ad altri tipi di ingegneria anticorpi o alla non-anticorpi proteine ​​leganti. E. coli Display interno-membrana è una potente piattaforma per gli anticorpi di ingegneria con alta affinità e alti livelli di solubilità intracellulare. Questo metodo è particolarmente adatto per engineering efficiente di anticorpi progettati per funzionare in ambiente intracellulare. Questi anticorpi intracellulari sono già in fase di studio come potenziali terapie in una serie di settori, tra cui le malattie neurodegenerative, cancro e infezioni virali 31. Questa tecnica permetterà un uso più diffuso di anticorpi intracellulari come strumenti per la ricerca e la medicina in questi campi e qualsiasi altro campo in cui lo studio di una proteina bersaglio in situ è desiderato.

Anticorpi in grado di piegare e funzionante nell&#39;ambiente intracellulare sono strumenti promettenti sia per la ricerca e applicazioni terapeutiche. Essi hanno la capacità di modulare l&#39;attività della proteina legandosi a una proteina bersaglio all&#39;interno delle cellule per evitare interazioni proteina-proteina, interrompere le interazioni degli acidi nucleici proteine, o impedire l&#39;accesso substrato enzimi 1-5. Sebbene gli anticorpi hanno molto potenziale per applicazioni intracellulari, li ingegneria per il corretto ripiegamento e solubilità in ambiente intracellulare pur mantenendo la capacità di legarsi ad un antigene bersaglio è impegnativo. L&#39;ambiente citoplasmatico riducendo previene la formazione di legami disolfuro normalmente richiesti per la piegatura stabile di anticorpi integrali e frammenti anticorpali, incluse catena singola frammento variabile (scFv) anticorpi 6,7. Un certo numero di approcci evoluzione diretta sono stati impiegati per progettare anticorpi con haffinità IGH per bersaglio antigeni 8-10. Questi approcci usano comunemente phage display, visualizzazione della superficie del lievito, o la visualizzazione della superficie batterica per schermare grandi librerie di anticorpi 11-13. Questi metodi sono potenti ed efficaci per identificare gli anticorpi che si legano a bersagli, ma dipendono dalla via secretoria per trasportare proteine che verranno visualizzati 14-16. La via secretoria trasloca proteine ​​ripiegate dal citoplasma riducendo nel lume reticolo endoplasmatico nel lievito o in periplasma nei batteri. Le proteine si ripiegano quindi in condizioni ossidanti e vengono visualizzati sulla superficie delle cellule o confezionati in particelle dei fagi per lo screening per l&#39;affinità di legame 17,18. Come risultato, gli anticorpi isolati utilizzando queste tecniche non necessariamente piegare bene nel citoplasma, e la solubilità intracellulare spesso devono essere progettati separatamente, se verranno utilizzati gli anticorpi in applicazioni intracellulari. Migliorarel&#39;efficienza di anticorpi ingegneria che sono ben piegati nel citoplasma, abbiamo precedentemente riportato il successo di MAD-TRAP (display membrana ancorata riconoscimento Tat di proteine che associano), un metodo per lo screening di una libreria di anticorpi scFv usando Escherichia coli inner- Display a membrana 19. Batterica visualizzazione interna membrana si basa sul percorso twin-arginina traslocazione (Tat) per il trasporto di anticorpi esposta, a differenza di altri metodi di visualizzazione comune che utilizzano la via secretoria. Il percorso Tat contiene un meccanismo di controllo della qualità che consente solo solubili, proteine ripiegate in modo corretto per essere trasportate dal E. citoplasma coli, attraverso la membrana interna, e nel periplasma 20,21. Substrati overexpressed Tat (es., Proteine mirati al percorso Tat con una fusione N-terminale al segnale Tat peptide ssTorA) che sono ben piegati nel citoplasma formano una lunga durata traslocazione intermedio con l&#39;N-terminale in citoplasma e il C-terminale in periplasma 19. Questo consente la visualizzazione di substrati Tat correttamente ripiegate, inclusi frammenti di anticorpi, sulla faccia periplasmic della E. coli membrana interna. Dopo aver rimosso la membrana esterna mediante digestione enzimatica per generare sferoplasti, anticorpi sono esposti allo spazio extracellulare (Figura 1). Questo permette di substrati Tat visualizzati sulla membrana interna per essere sottoposti a screening per il legame ad un target specifico. È importante sottolineare che, sfruttando il percorso Tat per la visualizzazione della superficie cellulare assicura che solo gli anticorpi nella libreria che sono ben piegati nel citoplasma saranno interrogati per la rilegatura, permettendo di ingegneria simultanea di affinità e piegatura intracellulare vincolante. In questo protocollo, si descrive come visualizzare una libreria scFv in E. coli membrana interna, pan biblioteca contro un antigene bersaglio, ed eseguire uno schermo secondario per identificare i costituenti più promettenti della biblioteca. Mentre ci concentriamo<html> il protocollo sul scFv, il metodo potrebbe essere applicato a ingegneria proteina la cui applicazione richiede pieghevole vincolante e intracellulare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Figura 1. Display interno-membrana Tat. In E. coli, anticorpi scFv che sono espressi come una fusione alla sequenza segnale ssTorA e correttamente ripiegate nel citoplasma vengono trasportati attraverso la membrana interna. Una traslocazione forme intermedie, dove i scFv sono ancorati nella membrana interna con l&#39;N-terminale nel citoplasma e il C-terminale in periplasma. Il E. membrana esterna coli è enzimaticamente digerito per formare sferoplasti, esponendo così gli anticorpi ancorati allo spazio extracellulare e renderli disponibili per il rilevamento utilizzando un anticorpo che si lega al tag epitopo C-terminale fuso sul anticorpi visualizzato.carico / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<table><tbody><tr><td></td> Una <td>libreria scFv adatta dovrebbe essere ottenuta da una fonte commerciale o accademica.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC4100 E. coli</td><td>cellule Centro di Stock Genetico Coli</td><td>6152</td><td>Le cellule devono essere chimicamente competenti o elettrocompetenti, a seconda del metodo di trasformazione selezionato.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco terreno di coltura disidratato LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, bibasico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, monobasico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (detergente per lisi cellulare)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3.000&nbsp; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>L'antigene target</td><td>varia</td><td>N/A</td><td>L'antigene target purificato può essere acquistato o prodotto/purificato.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 magnete</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore di provette</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>PCR IDT</td><td>N/A</td><td>Le sequenze di primer sono quelle descritte nel protocollo.</td></tr><tr><td>10x tampone di reazione DNA ligasi T4</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucelotide chinasi (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Assicurati che il tampone ligasi T4 utilizzato nella reazione di fosforilazione del primer contenga 1 mM di ATP.</td></tr><tr><td>5x Pacchetto tampone Phusion HF</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td> Miscela di <td></td></tr><tr><td>soluzione di deossinucleotide (dNTP), 10 mM ciascuno dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>In alternativa possono essere utilizzate altre polimerasi ad alta fedeltà, ma la temperatura di ricottura in Tabella 3 deve essere regolata.</td></tr><tr><td>C1000 Termociclatore touch con doppio modulo di reazione rapida 48/48</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Colorazione sicura del gel DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV gel e sistema di purificazione PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdialisi filtro a membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a fondo tondo in polistirene a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar Costar Costone per piastre per saggi generiche in polistirene</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre per microtitolazione</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 pozzetti EIA/RIA Easy Wash polistirene trasparente a fondo piatto ad alto legame micropiastra</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter policarbonato 96 pozzetti strumento di replicazione</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Latte secco scremato istantaneo</td><td>Qualità Biologico</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbato 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Reagente PopCulture (detergente concentrato per lisi cellulare)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2-Perossidasi (HRP) prodotto nel</td><td>topo Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico (H2SO4), 10&nbsp; Soluzione N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap foglio di alluminio</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre BioTek Epoch</td><td>Fisher</td><td>Scientific 11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Gli anticorpi ingegnerizzati per la funzione intracellulare non devono solo avere affinità per il loro antigene bersaglio, ma devono anche essere solubili e correttamente ripiegati nel citoplasma. I metodi comunemente usati per la visualizzazione e lo screening di librerie di anticorpi ricombinanti non incorporano il controllo di qualità del ripiegamento proteico intracellulare e, quindi, la capacità di legare l'antigene e il ripiegamento citoplasmatico e la solubilità degli anticorpi ingegnerizzati utilizzando questi metodi spesso devono essere progettati separatamente. Qui, descriviamo un protocollo per lo screening di una libreria ricombinante di anticorpi a frammento variabile a catena singola (scFv) per il legame con l'antigene e il corretto ripiegamento citoplasmatico contemporaneamente. Il metodo sfrutta il meccanismo intrinseco di controllo della qualità del ripiegamento intracellulare della via di traslocazione gemella-arginina (Tat) di Escherichia coli per visualizzare una libreria scFv sulla membrana interna di E. coli. La via Tat assicura che solo le proteine solubili e ben ripiegate vengano trasportate fuori dal citoplasma e visualizzate sulla membrana interna, eliminando così le scFv scarsamente ripiegate prima dell'interrogazione per il legame con l'antigene. Dopo la rimozione della membrana esterna, gli scFvs visualizzati sulla membrana interna vengono confrontati con un antigene bersaglio immobilizzato su sfere magnetiche per isolare gli scFv che si legano all'antigene bersaglio. Uno screening secondario basato su un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) viene utilizzato per identificare gli scFvs più promettenti per un'ulteriore caratterizzazione. Il legame dell'antigene e la solubilità citoplasmatica possono essere migliorati con successivi cicli di mutagenesi e screening per ingegnerizzare anticorpi con elevata affinità e alta solubilità citoplasmatica per applicazioni intracellulari.

Il ripiegamento delle proteine meccanismo di controllo della qualità intracellulare del percorso Tat in E. coli limita trasporto attraverso la membrana cellulare interna di proteine che sono ben piegati in ambiente citoplasmatico riducente. Con iperespressione una fusione di un scFv alla sequenza segnale di ssTorA (sequenza segnale dalla proteina TORA, che è naturalmente trasportato attraverso la via Tat 20), traslocazione è bloccato, con conseguente esposizione del scFv sulla membrana interna 19. Dopo interruzione enzimatica della membrana esterna, gli anticorpi visualizzati vengono resi disponibili per lo screening per l&#39;attività antigene-legante. La possibilità di usufruire del percorso Tat per la visualizzazione scFv è stato dimostrato da Karlsson et al. 19 (Figura 6). Gli anticorpi scFv scFv13 e scFv13.R4 sono stati fusi per la sequenza di ssTorA nativo o un ssTorA modificato che manca la coppia residuo di arginina-arginina riconosciuto dail percorso Tat. scFv13.R4 è stato progettato da Martineau et al. da scFv13 in quattro manche di evoluzione diretta ed è noto per piegare bene nel citoplasma 9. Questo scFv è stato visualizzato sulla membrana interna, ma solo quando espressa come una fusione alla sequenza segnale nativa ssTorA (Figura 6). Al contrario, scFv13 non è ben piegato cytoplasmically 9, quindi non viene visualizzata bene sulla membrana interna, indipendentemente dalla sequenza segnale al quale è fuso. Inoltre, se le scFv sono stati espressi nelle cellule che mancava la proteina TATC, una componente vitale della macchina Tat 20,28, il display non è stato osservato, che mostra l&#39;importante legame tra il display interno-membrana e il percorso Tat. Questi risultati dimostrano che solo proteine ​​che contengono il segnale peptide Tat e che siano correttamente ripiegate nel citoplasma vengono visualizzati sulla membrana interna, permettendo il trasporto attraverso la via Tat di funzionare come schermo per fol intracellulareding. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Figura 6. Rilevamento di scFv visualizzato sulla membrana interna. Citometria a flusso analisi è stata effettuata per rilevare la visualizzazione di mal ripiegata scFv13 e ben piegata scFv13.R4 sulla membrana interna. scFv sono state fuse al nativo ssTorA o ssTorA (KK), dove la coppia Arg-Arg nella sequenza ssTorA stato modificato per Lys-Lys. I tag FLAG epitopi C-terminale sul scFv sono stati rilevati con un isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugata anticorpo anti-FLAG. Le cellule senza la proteina TATC (ΔtatC) e ssTorA-scFv13 senza il cartellino del FLAG sono stati testati come controlli. M indica il valore mediano di fluorescenza. Ristampato da riferimento 19 con il permesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Display Inner-membrana può isolare con successo anticorpi scFv con alti livelli di affinità per una proteina bersaglio e alti livelli di solubilità citoplasmatica. Inoltre, i successivi cicli di evoluzione diretta con schermo interno-membrana migliorano le caratteristiche di anticorpi 19. Per dimostrare questo, una libreria PCR incline all&#39;errore basato su scFv13, che ha un basso livello di affinità di legame per β-galattosidasi, fu stroncato contro l&#39;antigene bersaglio β-galattosidasi utilizzando il display e panning metodo descritto nel protocollo. scFv 1-4 è stato isolato dopo un round di mutagenesi e panning, ed espone più alta affinità di legame per i beta-galattosidasi di scFv13 (Figura 7A) e un più alto livello di solubilità citoplasmatica (Figura 7B). Una nuova libreria, sulla base di scFv 1-4, è stato realizzato utilizzando soggetto a errori PCR, e panoramica di questa libreria di seconda generazione controβ-galattosidasi è stato fatto usando una modifica del protocollo descritto. Il panning contro β-galattosidasi per il secondo turno di evoluzione è stata fatta in presenza di purificato, solubile scFv 14 come un concorrente per migliorare la probabilità di isolare cloni con maggiore affinità rispetto scFv 1-4. Dopo questo secondo round di mutagenesi e panning, scFv 2-1 e 2-3 scFv sono stati isolati mediante lo screening secondario ELISA-based. Questi scFv non solo hanno mostrato una maggiore affinità di legame per β-galattosidasi di scFv13, ma anche esposti meglio vincolante che il clone primo turno scFv 1-4. scFv 2-1 esposto β-galattosidasi legame paragonabile a quella di scFv13.R4 (Figura 7A). scFv 2-3 mostra anche un ulteriore aumento di solubilità citoplasmatica rispetto al scFv 14, evidenziando l&#39;ingegneria simultanea di solubilità e antigene-legante. Poiché affinità e espressione solubile dei scFv sono schermati per simultaneamente, è possibile che un scFv selezionato è modrano solubilità ma alta versa vincolante o vice. Ad esempio, scFv 2-1 trovi espressione solubile inferiore scFv 2-3, ma presenta una maggiore affinità di legame al ß-galattosidasi. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Figura 7. target vincolante e l&#39;espressione citoplasmatica di scFv varianti isolata usando Display interno-membrana. (A) scFv sono state espresse nel citoplasma di E. coli (ad es., senza la sequenza di segnali ssTorA) con un hexahistidine tag (6 × -Il suo) e purificate utilizzando acido spin-colonne di nichel-nitrilotriacetico. Il legame dei scFv purificati di beta-galattosidasi è stata misurata con un test ELISA. scFv purificati sono stati caricati su piastre ELISA β-galattosidasi-rivestito ed i scFv legati sono stati rilevati con un anticorpo anti-6 × -Il suo. I dati sono una media di sei repliche, e la barra di errore indica l&#39;errore standard della media.(B) Le frazioni solubili e insolubili dei lisati cellulari di cellule che esprimono i scFv cytoplasmically sono stati analizzati da una macchia occidentale sondati con un anticorpo anti-6 × -Il suo. concentrazione proteica totale è stato utilizzato per normalizzare il caricamento dei campioni. Ristampato (A) e adattato (B) dal riferimento 19 con il permesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Forniamo un metodo per lo screening simultaneo di una libreria di frammenti di anticorpi per l'affinità di legame e la solubilità citoplasmatica utilizzando la via di traslocazione gemella-arginina di Escherichia coli, che ha un meccanismo di controllo della qualità intrinseco per il ripiegamento intracellulare delle proteine, per visualizzare i frammenti di anticorpi sulla membrana interna.

Display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sfruttare il controllo qualitativo del ripiegamento del percorso di traslocazione twin-arginina per ingegnerizzare il legame di frammenti anticorpali e il loro ripiegamento intracellulare in un unico passaggio, il che avrà applicazioni nell'ingegnerizzazione di anticorpi affinché funzionino all'interno della cellula. Questo metodo può aiutare a superare sfide fondamentali nel campo dell'ingegnerizzazione anticorpale, come la difficoltà di progettare anticorpi in grado di ripiegarsi e funzionare correttamente in un ambiente citoplasmatico riducente. Solo gli anticorpi che si ripiegano correttamente nel citoplasma vengono esposti e sottoposti a saggio per il legame. Offre un vantaggio rispetto alla visualizzazione in lievito e in batteriofago, che si basano su percorsi secretori per la visualizzazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie per malattie neurodegenerative, cancro e infezioni virali, poiché queste patologie coinvolgono un'insorgenza intracellulare che potrebbe essere mirata da anticorpi. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché risulta difficile comprendere come generare e lavorare con gli sferoplasti.Dopo aver fuso la libreria scFv alla sequenza segnale ssTorA e averla coltivata a 37 gradi Celsius con agitazione per tre ore, lasciare esprimere la libreria scFv a 20 gradi Celsius e 225 rpm per tutta la notte, per 15-22 ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 600 nanometri. Successivamente, centrifugare il volume calcolato di coltura indotta in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri a 12.000 ×g e a temperatura ambiente per cinque minuti.Rimuovere il soprannatante e utilizzare 100 microlitri di buffer di frazionamento ghiacciato o fB per risospendere i pellet. Quindi centrifugare i campioni a 12.000 × g e temperatura ambiente per un minuto. Dopo aver rimosso il soprannatante, utilizzare 350 microlitri di fB ghiacciato integrato con 3,5 microlitri di lisozima a 10 milligrammi per millilitro per risospendere i pellet.Successivamente, mentre si vortica lentamente i tubi, aggiungere goccia a goccia 700 microlitri di EDTA 1 millimolare, quindi incubare i tubi su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 20 minuti per miscelare i campioni. Rimuovere i tubi dall'agitatore. Aggiungere 50 microlitri di MgCl2 0,5 molare freddo di ghiaccio a ciascun tubo e incubare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti.Quindi centrifugare i campioni a 11.000 ×g e a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Ora, con una micropipetta e una punta da un millilitro, aspirare lentamente una porzione del pellet. Successivamente, tenendo il tubo inclinato con l'apertura direttamente sopra un nuovo tubo da 1,5 millilitri, estrarre lentamente la punta della pipetta dal soprannatante e far scivolare il pellet nel nuovo tubo.Dopo aver rimosso il soprannatante in eccesso, utilizzare un millilitro di PBS freddo per risospendere gli sferoplasti. Gli sferoplasti devono essere completamente risospesi prima della fase di panning, poiché gli scFv non leganti presenti negli aggregati potrebbero generare falsi positivi durante il panning. Dopo aver biotinilato l'antigene bersaglio seguendo il protocollo descritto nel testo, risospendere le microsferette magnetiche ricoperte di streptavidina nel loro flacone originale.Quindi trasferire da sette a dieci volte 10 alla nona palline in un tubo da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo con le palline sul supporto magnetico per due minuti per far aderire le palline al lato del tubo e rimuovere con attenzione il sovranatante mediante pipetta. Rimuovere il tubo dal magnete e utilizzare il PBS per risospendere le palline senza generare bolle.Quindi rimettere il tubo sul magnete e rimuovere il buffer prima di lavare le perle altre due volte con PBS. Aggiungere un millilitro di lisato contenente l'antigene biotinilato alle perle e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione delicata. Al termine dell'incubazione, lavare le perle cinque volte con PBS contenente 1% BSA.Quindi utilizzare PBS con 1% BSA per risospendere le perle. Per eseguire lo screening della libreria di scFv, aggiungere all'inizio quattro volte 10 alla nona sferoplasti e otto volte 10 alla ottava perle in un tubo sterile da 15 millilitri. Aggiungere 1x PBS con 1% BSA per portare il volume totale a quattro millilitri.Quindi aliquotare la soluzione in quattro provette da 1,5 millilitro, con un millilitro ciascuna, e incubare le reazioni a quattro gradi Celsius ruotando delicatamente per cinque ore. Per preparare i sferoplasti legati alle perle per la PCR, posizionare le provette della reazione di panning sul magnete per tre minuti. Rimuovere il sopranatante e lavare le perle quattro volte con PBS 1x contenente BSA all'1%, come in precedenza.Quindi utilizzare 25 microlitri di ddH2O per provetta per risospendere le microsfere. Come descritto nel protocollo testuale, eseguire la PCR sull'intero plasmide per amplificare i geni per gli scFv legati alle microsfere e successivamente ricircolarizzare il plasmide a partire dal prodotto della PCR. Trasformare l'intera reazione in cellule equalizzate MC4100 secondo il protocollo testuale.Per identificare i cloni mediante ELISA, scongelare un tubo della sottolibreria sottoposta a panning e seminare su piastre di agar LB. Aggiungere 200 microlitri di LB con 20 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rotonda a 96 pozzetti. Con la punta di una pipetta, prelevare una singola colonia dalla piastra di agar.Quindi posizionare la punta nella prima pozzetta della piastra a 96 pozzetti e mescolare delicatamente per inoculare. Continuare a inoculare una colonia in ciascuna pozzetta. Incubare a 37 gradi Celsius per 20-24 ore su un agitatore per micropiastre.Dopo aver preparato una soluzione di rivestimento dell'antigene bersaglio secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 50 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra ELISA da 96 pozzetti in polistireno trasparente ad alto legame. Incubare le piastre a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, replicare le colonie dalle piastre colturali da 96 pozzetti su piastre agar secondo il protocollo descritto nel testo.Quindi, svuotare la soluzione di rivestimento dalle piastre ELISA e aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante preparata secondo il protocollo indicato nel testo in ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per almeno due ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Aggiungere 20 microlitri di un detergente concentrato per la lisi cellulare in ogni pozzetto della piastra di coltura a fondo rotondo e incubare la piastra su un agitatore per micropiastre a temperatura ambiente per 15-20 minuti.Svuotare la soluzione di blocco dalle piastre ELISA e lavare le pozzette quattro volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio preparato secondo il protocollo descritto nel testo. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, trasferire 50 microlitri da ciascuna pozzetta della piastra di lisi cellulare alla pozzetta corrispondente della piastra ELISA. Incubare le piastre a temperatura ambiente per uno o due ore.Procedere con lo svuotare i campioni dalla piastra per ELISA e lavare le pozzette quattro volte. Successivamente, preparare la soluzione di anticorpo per rilevare gli scFv secondo il protocollo descritto nel testo. Aggiungere 50 microlitri di anticorpo in ciascuna pozzetta e incubare per una o due ore a temperatura ambiente.Lavare le piastre ELISA quattro volte con tampone di lavaggio prima di aggiungere 200 microlitri per pozzetto di substrato HRP preparato secondo il protocollo del produttore. Incubare le piastre al buio a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Per arrestare la reazione, aggiungere 50 microlitri di H2SO4 3 M a ogni pozzetto e pipettare delicatamente per mescolare la soluzione.Infine, misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre a 492 nanometri. In questo esperimento, gli anticorpi scFv scFv13 e scFv13.R4 sono stati fusi o alla sequenza ssTorA nativa o a una versione modificata di ssTorA non riconosciuta dalla via di traslocazione twin-arginina, nota anche come via Tat. ScFv.R4 si ripiega correttamente ed è espresso sulla membrana interna quando viene fuso al ssTorA nativo. ScFv13 non si ripiega correttamente e non viene visualizzato sulla membrana interna, indipendentemente dal peptide segnale Tat a cui è fuso. Questi risultati dimostrano che solo le proteine che contengono il peptide segnale Tat e che si ripiegano correttamente nel citoplasma vengono visualizzate sulla membrana interna, consentendo al percorso Tat di funzionare come sistema di selezione per il ripiegamento intracellulare.In questo esperimento, una libreria PCR soggetta a errori basata su scFv13, che presenta un basso livello di affinità di legame per la beta-galattosidasi, è stata sottoposta a panning contro la beta-gal. È stato isolato scFv 1-4, che mostra un'affinità di legame maggiore per la beta-gal rispetto a scFv13, nonché un livello più elevato di solubilità citoplasmatica. Utilizzando scFv 1-4 come competitore contro una libreria di seconda generazione di scFv 1-4, sono stati isolati scFv 2-1 e 2-3, i quali hanno dimostrato un'affinità di legame per la beta-gal ancora maggiore rispetto a scFv13 e scFv 1-4, evidenziando l'ingegnerizzazione simultanea di solubilità e legame all'antigene.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come ELISA, utilizzando lisati purificati, al fine di verificare la specificità dell'antigene e determinare l'affinità di legame delle linee cellulari isolate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come effettuare lo screening di un anticorpo per verificarne il legame a un antigene di interesse, utilizzando il percorso Tat per esprimere la libreria e il panning con microsferette magnetiche per arricchire e isolare i leganti dell'antigene. Non dimenticare che lavorare con acido solforico può essere estremamente pericoloso e indossare un adeguato equipaggiamento di protezione individuale è necessario.

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