Name: Sporulazione efficiente di Saccharomyces cerevisiae In un pozzetti formato 96 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Scopri la sporulazione efficiente di Saccharomyces cerevisiae in formato 96 pozzetti per screening ad alto rendimento. Questo metodo ottimizza l'aerazione per migliorare l'efficienza della sporulazione rispetto ai protocolli tradizionali.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione Joseph P. Healey presso la University of Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 dal NIH (LSH). SMP è sostenuto in parte da una Sanofi-Genzyme Fellowship presso l&#39;Università del Massachusetts di Boston.

1. Preparazione per Sporulazione Nota:. I media descritti in questo protocollo sono realizzati con ricette e metodi standard di 13,17 La tabella 1 riporta la formulazione per 1 L di vari supporti utilizzati in questo protocollo. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bacto Peptone </td><td style="width: 50px;"> Estratto di lievito </td><td style="width: 50px;"> Bacto Agar </td><td style="width: 60px;"> Destrosio </td><td style="width: 70px;"> Acetato di potassio </td><td style="width: 60px;"> glicerina </td><td style="width: 60px;"> DDH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> piastre YPG </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> piastre YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPD liquido </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> YPA liquido </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> mezzi sporulazione </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Formulazioni media importi vengono forniti 1 l di media. Specifiche su supportiingredienti possono essere trovati nella Tabella Materials. <ol><li> Se tutte le celle sporulanti sarà lo stesso genotipo, seguire questa procedura: <ol><li> Scongelare ceppo di lievito da utilizzare su un (YPGlycerol) Piastra YPG. Grow lieviti per 12-16 ore a 30 ° C. È importante sottolineare che le cellule SK1 sono anche pronti a sporulare, in modo da ceppi SK1 non dovrebbero essere lasciati troppo a lungo su piatti YPG, o possono sporulare sul piatto. Nota: Un ceppo appena scongelati coltivate su YPG è preferito, come l&#39;utilizzo di glicerolo come fonte di carbonio richiede fosforilazione ossidativa, e sceglie quindi per cellule che hanno DNA mitocondriale funzionale. cellule SK1 hanno una tendenza a perdere DNA mitocondriale funzionale e diventare petites. DNA mitocondriale funzionale è necessario per sporulazione. </li><li> Streak lievito dalla piastra YPG su un (YPDextrose) piastra YPD per singole colonie. Crescere lievito sulla piastra YPD 24-28 ore a 30 ° C. </li><li> Dopo circa 36-48 ore di crescita su YPD supporto solido, avviare una cultura di 25 ml YPD utilizzando una singola coloniadalla piastra YPD. Crescere questa cultura fino a quando le cellule sono circa 600 OD = 4,0-7,0. Eseguire questo passaggio a 30 ° C per una notte in un incubatore agitazione, agitazione a 220 giri al minuto. </li><li> Dalla cultura YPD, utilizzare una quantità appropriata di cellule per iniziare a 1.000 ml di YPA (YPAcetate) cultura che è OD 600 = 0,1 per ogni esigenza 96 pozzetti nella sezione 2. crescere il lievito in una agitazione incubatore a 30 ° C (agitazione a 220 rpm) fino a quando la coltura OD 600 è compreso tra 1,3 a 1,5. Nota: Seminare 100 ml di cultura YPA per ogni piatto pozzetti 96 a proiettato nella sezione 2. Per esempio, se lo screening quattro 96 piastre a pozzetti multipli, saranno necessari 400 ml di cultura YPA. A partire con il 10% in più di volume nella cultura YPA è necessario per proteggere contro la perdita di volume per evaporazione. Tipicamente, ci vorranno tra 12-16 ore per le cellule per raggiungere il diametro esterno adeguato 600; la quantità di tempo può variare a seconda del genotipo del ceppo di lievito. YPA è il supporto presporulation. Pregrowthin acetato aiuta inducono l&#39;espressione di geni (ad esempio IME1) necessario per sporulazione efficiente e sincrona 6. </li><li> Spin a 1.800 xg in una centrifuga da tavolo per 5 minuti per far sedimentare le cellule coltivate in YPA. Lavare le cellule 1x con 0,5 volume di acqua deionizzata sterile in autoclave. Spin di nuovo, e scartare lavare. Risospendere le cellule in 1x supporto del volume sporulazione. Continuare alla Sezione 2. </li></ol></li><li> Se si utilizza cellule per sporulazione che sono di diversi genotipi, (vale a dire, trasformate con diversi plasmidi o contenenti diverse mutazioni, in genere ottenuti e memorizzati come scorte congelate), le cellule matrice dei diversi genotipi in un formato pozzetti 96. Quindi, seguire questa procedura: <ol><li> Utilizzare uno sterile Frogger 96 poli per trasferire le cellule provenienti dalle scorte congelate scongelati a 96 pozzetti piastra (s) sul YPG terreni solidi. Crescere durante la notte di lievito a 30 ° C. </li><li> Utilizzando uno sterile frogger 96 poli, trasferire le cellule dal YPG terreni solidi su supporti solidi YPD o selettivomezzi solidi (cioè, terreno minimo sintetico privo aminoacidi, se le celle contengono plasmidi che richiedono la selezione). Grow lievito a 30 ° C fino colonie si formano per ogni ceppo, in genere almeno 1 giorno in YPD e 2 giorni se terreni selettivi è necessario. </li><li> Aliquotare 1,2 ml di terreno liquido YPD o supporti liquidi selettivi in ​​ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 96 profonde 2 ml. Trasferire le cellule da supporti solidi in liquidi utilizzando una Frogger, coprire con un coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro adesivo, e crescere durante la notte in 30 ° C shaker, agitando a 220 giri al minuto. Nota: Per ridurre al minimo la contaminazione, piastre di copertura utilizzando i coperchi di plastica da una piastra di Petri rettangolare. Tenere coperchi in posto con un pezzo di nastro, in modo che la circolazione dell&#39;aria è minimamente limitata. </li><li> piastre centrifugare a 1.800 xg per 5 minuti, utilizzando un secchio centrifuga oscillante con gli adattatori per accogliere 96 pozzetti. Eliminare i media dalle cellule; aggiungere 500 microlitri YPA a ciascun pozzetto e sospendere nuovamente le cellule pellet nel YPA. Copertinacon coperchio in plastica trattenuta da nastro. </li><li> Crescere le cellule per 15 ore a 30 ° C in un incubatore agitazione, agitazione a 220 rpm. Continuare alla Sezione 2. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule sporulanti in un multiwell formato 96 <ol><li> Aggiungere uno dei due 3 millimetri perle di vetro solido sterile o un sterili 5 mm x 2 mm ancoretta magnetica in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 con 1,3 ml di pozzi. (Vedere Rappresentante Risultati al di sotto per una discussione sull&#39;opportunità di usare una perlina o un ancoretta.) </li><li> Se tutte le celle da schermati sono dello stesso genotipo, vai a 2.2.1. Se le cellule per essere schermati sono di diversi genotipi, andare a 2.2.2. <ol><li> Prendere le cellule dal punto 1.1.5 e un&#39;aliquota 500 ml di cellule più supporti in ciascun pozzetto della piastra di pozzetti 96. Coprire con il coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro. Procedere alla 2.3. </li><li> cellule Spin che sono YPA da 1.2.4 a 1800 xg per 5 minuti, utilizzando un secchio centrifuga oscillante con adattatori per ospitare piastre da 96 pozzetti. versare dif supporti dalle cellule. Aggiungere 500 ml di mezzi sporulazione in ciascun pozzetto e sospendere nuovamente le cellule pellet nei media sporulazione. Coprire con il coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro. Procedere alla 2.3. </li></ol></li><li> Se si utilizza un perle di vetro, luogo campioni in un incubatore agitazione a 30 ° C e agitare a 220 rpm per sporulazione. Se si utilizza un ancoretta magnetica, I campioni su un piatto mescolare all&#39;interno di un incubatore a 30 ° per la sporulazione. Nota: La velocità esatta mescolate per i bar mescolare magnetiche non è molto importante, a patto che tutte le barre si muovono con energia e la cultura è aerato. </li><li> Per monitorare la progressione attraverso la sporulazione, prelevare campioni dalla cultura sporulanti per la visualizzazione, Aggiungere 6 ml di cellule dalle culture sporulanti a 24 ml di media sporulazione in una piastra da 96 pozzetti coprioggetto (diluizione 1: 5). Lasciare le cellule accontentarsi di 5 minuti prima di esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito. Nota: In cellule SK1 wild-type, compatti spore mature formeranno da 36 ore dopo il trasferimento su un supporto sporulazione. La progressione attraverso sporulazione può essere monitorato tramite microscopia utilizzando marcatori fluorescenti, come ad esempio un marcatore nucleare (cioè, Htb2-mCherry 18) per esaminare la divisione meiotica o un marcatore di membrana prospore (vale a dire, G20 19) per esaminare spore morfogenesi. In alternativa, la formazione di spore rifrangenti può essere visto utilizzando Nomarski microscopia DIC partire da circa 12 ore dopo il trasferimento sul supporto sporulazione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Qui vi presentiamo un protocollo per sporulanti SK1 lievito in un formato di pozzetti 96. L&#39;aerazione è la chiave per la sporulazione efficiente, che richiede l&#39;utilizzo della propria ancoretta o una perla di vetro in ogni pozzetto. Quando le cellule sono sporulata in una piastra multipozzetto 96 in un incubatore agitazione senza né una perlina o ancoretta, le cellule non sporulino in modo efficiente. Solo un piccolo aumento dell&#39;efficienza sporulazione è visto quando le cellule sono sporigeni senza né un co...

Sporulazione nel lievito erba è stata studiata per fornire approfondimenti molti aspetti della biologia, compreso il controllo della segregazione cromosomica durante la meiosi 1, meccanismi di ricombinazione genetica 2, il controllo dello sviluppo da cellule segnalazione 3, controllo nutrizionale di sviluppo 4, il trascrizionale regolazione dello sviluppo 5, e l&#39;esame di formazione di spore 6. Formazione di spore include un nuovo evento divisione cellulare coinvolge la formazione di nuovi compartimenti di membrana all&#39;interno della cellula madre seguita dalla deposizione di un muro di spore di protezione 6. Questi studi che esaminano le cellule sporulanti spesso approfittano della rapida sporulanti ceppo di lievito SK1, che può subire il processo di sporulazione in circa 24 ore in modo relativamente efficiente 7,8. Anche se l&#39;ottimizzazione delle condizioni di sporulazione per gemmazione di lievito sono state descritte 9-13, questi esperimentis esaminato sporulazione su mezzi solidi o in colture liquide scala più ampia in cui è effettuata la sporulazione utilizzando tubi di coltura o flaconi. Qui si descrive un metodo per sporulanti lievito in un formato piatto pozzetti 96. Troviamo che per questo metodo, aerazione è fondamentale per sporulazione sincrona ed efficiente, e hanno ideato tecniche per assicurare sporulazione sufficiente un formato multipozzetto piccolo volume. Sporulanti in un formato 96 pozzetti piatto permette alle cellule di essere sottoposti a screening utilizzando tecniche high-throughput e reagenti ottimizzati per un formato piatto multipozzetto, tale screening per soppressori di alta copia utilizzando una libreria di piastrelle 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1,3 ml Piastre DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>Utilizzato per la sporulazione</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml Piastre DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Utilizzato per la crescita della presporulazione, passo 1.2.3</td></tr><tr><td>Perla di vetro da 3 mm</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Utilizzato per la sporulazione</td></tr><tr><td>Barra di agitazione da 5 mm x 2 mm, confezione da 12</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Utilizzato per la sporulazione</td></tr><tr><td>96 pozzo frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td> necessario per <td></td></tr><tr><td>la fotocopiatrice per librerie</td> passaggio 1.2 <td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>necessario per il passaggio 1.2; da utilizzare con la</td></tr><tr><td>piastra di Petri rettangolare</td> frogger <td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>necessario per il passaggio 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>necessario per i terreni</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td>necessario per i terreni</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>necessario per i terreni</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>necessario per i terreni</td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>necessario per i terreni</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>necessario per i terreni</td></tr><tr><td>Piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti nera</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>necessaria per il passaggio 2.4</td></tr></tbody></table>

sporulazione efficiente di<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; in un pozzetti formato 96

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Durante i periodi di stress nutrizionale, Saccharomyces cerevisiae subisce una gametogenesi, nota come sporulazione. Le cellule di lievito diploidi che sono affamate di azoto e carbonio avvieranno il processo di sporulazione. Il processo di sporulazione include la meiosi seguita dalla formazione di spore, in cui i nuclei aploidi vengono impacchettati in spore resistenti all'ambiente. Abbiamo sviluppato metodi per l'efficiente sporulazione del lievito in gemmazione in 96 piastre multipozzetto, per aumentare la produttività delle cellule di lievito di screening per i fenotipi di sporulazione. Questi metodi sono compatibili con lo screening con plasmidi contenenti lieviti che richiedono una selezione nutrizionale, quando vengono utilizzati terreni minimi appropriati, o con lo screening di lieviti con alterazioni genomiche, quando viene utilizzato un ricco regime di presporulazione. Riteniamo che per questo metodo, l'aerazione durante la sporulazione sia fondamentale per la formazione delle spore e abbiamo ideato tecniche per garantire un'aerazione sufficiente compatibile con il formato di piastre multipozzetto 96. Sebbene questi metodi non raggiungano il tipico livello di sporulazione del ~80% che può essere raggiunto in esperimenti basati su fiasche di grande volume, questi metodi raggiungeranno in modo affidabile circa il 50-60% di livello di sporulazione in piastre multipozzetto di piccolo volume.

<html> Per valutare questo protocollo, efficienze sporulazione ottenuti da sporulanti cellule in piastre a pozzetti multipli (come descritto sopra) sono stati confrontati con cellule sporigeni utilizzando volumi maggiori in beute (Tabella 2). L&#39;uso di piastre a pozzetti multipli non ha raggiunto l&#39;alta efficienza visto quando sporulanti in fiaschi, in cui l&#39;efficienza ~ 80% può essere visto di routine. Sporulanti in piastre a pozzetti multipli con una corretta...

Qui, la sporulazione di Saccharomyces cerevisiae viene effettuata in un formato a 96 pozzetti.

Sporulazione efficiente di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; In un pozzetti formato 96

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è sporulare in modo efficiente il lievito a gemmazione in un formato a 96 pozzetti. Sebbene molti schermi su larga scala siano stati eseguiti sul lievito a gemmazione, studi ad alto rendimento volti all'analisi della meiosi e della sporulazione sono stati limitati. La tecnica descritta in questo video presenta il vantaggio di permettere la sporulazione del lievito in modo efficiente, economico e in un formato a 96 pozzetti compatibile con schermate ad alto rendimento.L'idea iniziale per questo metodo mi è venuta perché desideravo utilizzare una libreria di plasmidi in frammenti da due micron per eseguire uno screening di soppressori ad alta copia di un mutante incapace di formare spore refrattili. Inizialmente, le mie efficienze di sporulazione erano scarse nel formato a 96 pozzetti. Ho scoperto che ciò era dovuto a un'areazione inadeguata.Iniziare questa procedura scongelando il ceppo di lievito SK1 su una piastra di estratto di lievito peptone glicerolo o piastra YPG. Utilizzare un bastoncino sterile per prelevare una piccola quantità di cellule dal vial congelato contenente la sospensione glicerolata e spargerla su una piastra YPG. Far c

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Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Il metodo Green Monster consente l'assemblaggio rapido di delezioni multiple contrassegnati con un reporter gene codificante proteina fluorescente verde. Questo metodo si basa sulla guida ceppi di lievito attraverso cicli ripetuti di assortimento sessuale di delezioni e basato sulla fluorescenza arricchimento di cellule che trasportano più eliminazioni.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Qui presentiamo un protocollo per stimare il metabolismo respiratorio e fermentativo inserendo la crescita esponenziale di Saccharomyces cerevisiae per l'equazione di crescita esponenziale. Calcolo dei parametri cinetici permette per lo screening delle influenze di sostanze/composti sulla fermentazione o respirazione mitocondriale.

Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Presentiamo un protocollo per la preparazione lamellare di campioni biologici surgelati a tuffo mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato per studi strutturali ad alta risoluzione di macromolecole in situ con tomografia crioeletnico. Il protocollo presentato fornisce linee guida per la preparazione di lamelle di alta qualità ad alta riproducibilità per la caratterizzazione strutturale di macromolecole all'interno del Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Il test ACT1-CUP1, un saggio di crescita del rame, fornisce una rapida lettura dello splicing dell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA) e dell'impatto che i fattori di splicing mutante hanno sulla funzione spliceosomale. Questo studio fornisce un protocollo ed evidenzia la personalizzazione possibile per affrontare la questione di splicing di interesse.

I saggi ACT1-CUP1 determinano le sensibilità specifiche del substrato dei mutanti spliceosomi nel lievito in erba

Scopri la sporulazione efficiente di Saccharomyces cerevisiae in formato 96 pozzetti per screening ad alto rendimento. Questo metodo ottimizza l'aerazione per migliorare l'efficienza della sporulazione rispetto ai protocolli tradizionali.

Sporulazione efficiente di

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