Sporulazione efficiente di Saccharomyces cerevisiae In un pozzetti formato 96

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sporulare il lievito in gemmazione in modo efficiente in un formato a 96 pozzetti. Sebbene siano stati effettuati molti screening su larga scala sul lievito in gemmazione, gli studi ad alto rendimento che esaminano la meiosi e la sporulazione sono stati limitati. La tecnica descritta in questo video ha il vantaggio di sporulare il lievito in modo efficiente ed economico in un formato a 96 pozzetti compatibile con lo screening ad alto rendimento.

Ho avuto l'idea di questo metodo perché volevo utilizzare una libreria di plasmidi piastrellata da due micron per lo screening di soppressori ad alta copia di un mutante che non poteva formare spore rifrattili. Inizialmente, le mie efficienze di sporulazione erano scarse nel formato a 96 pozzetti. Ho scoperto che ciò era dovuto a un'aerazione inadeguata.

Inizia questa procedura scongelando il ceppo di lievito SK1 su una piastra di estratto di lievito, peptone, glicerolo o YPG. Utilizzare uno stick sterile per raschiare una piccola quantità di cellule dalla fiala del congelatore contenente il brodo di glicerolo e stenderlo su una piastra YPG. Far crescere il lievito per 12-16 ore a 30 gradi Celsius.

Quindi, strisciare il lievito dalla piastra YPG su una piastra di peptone destrosio, o YPD, estratto di lievito per singoli colone. Far crescere il lievito sulla piastra YPD per 24-48 ore a 30 gradi Celsius. Dopo 24-48 ore di crescita su terreni solidi YPD, iniziare una coltura YPD da 25 millilitri utilizzando una singola colonia dalla piastra YPD.

Coltiva questa coltura durante la notte in un incubatore vibrante a 30 gradi Celsius a 220 RPM fino a quando le cellule raggiungono un OD600 compreso tra 4,0 e 7,0. Il giorno successivo, utilizzare una quantità appropriata di cellule della coltura YPD per iniziare una coltura da 125 millilitri in peptone acetato di estratto di lievito, o YPA, con un OD600 di 0,1. Coltiva la coltura in un incubatore vibrante a 30 gradi Celsius a 220 giri/min fino a quando l'OD600 è compreso tra 1,3 e 1,5.

Trasferire la coltura in provette da centrifuga e centrifugare a 1800X G in una centrifuga da tavolo per cinque minuti per pellettare le cellule. Lavare le cellule una volta con 0,5 volumi di acqua deionizzata sterile autoclavata. Girare di nuovo e scartare l'acqua.

Risospendere le cellule in un volume 1X di terreno di sporulazione. Per preparare cellule di diversi genotipi, le cellule provenienti da ceppi congelati scongelati in una piastra multipozzetto da 96 vengono prima trasferite su terreni solidi YPG. Fiammeggiare un frogger a 96 punte e poi raffreddarlo momentaneamente su un piatto di terreno solido prima di toccarlo con le colonie di lievito.

Far crescere il lievito durante la notte a 30 gradi Celsius. Il giorno seguente, trasferire le cellule dai terreni solidi YPG ai terreni solidi YPD o selettivi, a seconda del genotipo del ceppo. YPD viene utilizzato in questa dimostrazione.

Far crescere il lievito a 30 gradi Celsius fino a formare colonie per ogni ceppo. Aliquotare 1,2 millilitri di terreno liquido YPD in ciascun pozzetto di una piastra profonda 96 pozzetti. Trasferire le celle dal terreno solido al mezzo liquido.

Coprire la piastra con un coperchio di plastica da una piastra di Petri rettangolare e tenere il coperchio in posizione utilizzando un pezzo di nastro adesivo per limitare al minimo la circolazione dell'aria. Far crescere le cellule durante la notte in uno shaker a 30 gradi Celsius a 220 giri/min. Il giorno successivo, centrifugare a 1800X G per cinque minuti.

Versare il terreno e aggiungere 500 microlitri di YPA a ciascun pozzetto. E risospendere le celle pellettate. Coprire il piatto con un coperchio di plastica tenuto in posizione da del nastro adesivo.

Far crescere le cellule per 15 ore in un incubatore con agitazione a 30 gradi Celsius a 220 giri/min. Per fornire un'aerazione adeguata per una sporulazione efficiente, aggiungere in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti una perla di vetro solido sterile da tre millimetri o una barra di agitazione magnetica sterile da cinque millimetri per due millimetri. Se tutte le cellule sono dello stesso genotipo, aliquat 500 microlitri di cellule più terreno in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.

Coprire il piatto con un coperchio di plastica tenuto in posizione da del nastro adesivo. Se le cellule sono di genotipi diversi, centrifugare le cellule che si trovano in YPA a 1800X G per cinque minuti e versare il terreno. Aggiungere 500 microlitri di terreno di sporulazione in ogni pozzetto.

E risospendere le cellule pellettate nel mezzo di sporulazione. Coprire il piatto con un coperchio di plastica tenuto in posizione da del nastro adesivo. Se si utilizzano perle di vetro, posizionare i campioni in un incubatore di agitazione a 30 gradi Celsius e agitare a 220 giri/min per la sporulazione.

Se si utilizzano ancorette magnetiche, posizionare i campioni su una piastra di agitazione all'interno di un'incubatrice a 30 gradi Celsius per la sporulazione. L'esatta velocità di agitazione delle barre magnetiche non è molto importante, purché tutte le barre si muovano energicamente e la coltura sia aerata. 36 ore dopo, recuperare i campioni per monitorare la progressione attraverso la sporulazione.

Prelevare sei microlitri di cellule da ciascuna coltura sporulante e aggiungerle a 24 microlitri di terreno di sporulazione in una piastra coprioggetti a 96 pozzetti. Lasciare riposare le cellule per cinque minuti prima di esaminarle con un microscopio invertito. Una sporulazione rappresentativa di due ceppi diversi è mostrata in queste immagini di cellule visualizzate utilizzando un obiettivo 63X su un microscopio invertito.

Le tetrade rifrattili, indicate dalle punte delle frecce, possono essere viste nella cultura wild-type. Ma non nella coltura contenente le cellule di eliminazione smk1 carenti di sporulazione. Sono stati effettuati confronti tra le efficienze di sporulazione delle cellule sporulate in piastre multipozzetto e le cellule sporulate utilizzando volumi maggiori in fiasche.

L'uso di piastre multipozzetto non ha raggiunto l'elevata efficienza che si osserva abitualmente quando si utilizza il protocollo più tipico di sporulazione in matracci. La sporulazione in piastre multipozzetto con un'adeguata aerazione può raggiungere efficienze di sporulazione sufficienti superiori al 50% con i migliori risultati ottenuti utilizzando una barra di agitazione da cinque millimetri. Tuttavia, dato l'alto costo delle piccole ancorette, le efficienze ottenute utilizzando le perle di vetro sono paragonabili.

Sebbene sia le ancorette da cinque che da sette millimetri si adattino al pozzetto di una piastra da 96 multipozzetti, l'utilizzo di un'ancoretta da sette millimetri ha comportato una scarsa efficienza di sporulazione. La barra di agitazione di sette millimetri in un pozzo tende a interagire con una barra di agitazione in un pozzo adiacente. Evitare che le barrette si mescolino correttamente e fornire un'adeguata aerazione alla coltura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sporulare in modo efficiente le cellule di lievito in coltura liquida nel formato a 96 pozzetti. Una volta padroneggiato, questo processo può essere completato in sei giorni, se fatto correttamente. Questa procedura può essere utilizzata per lo screening di diversi ceppi mutanti, plasmidi o inibitori di piccole molecole per il loro effetto sulla meiosi e sulla sporulazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata per studiare la regolazione del ciclo cellulare meiotico e come la citochinesi e la meiosi sono accoppiate nella sporulazione in Saccharomyces cerevisiae.