Name: Il Drosophila Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Scopri come dissecare dischi immaginali occhio-antennali e cervelli di Drosophila con cloni fluorescenti per visualizzare e quantificare l'espressione genica e l'invasività tumorale. Questo metodo fornisce protocolli completi per l'analisi quantitativa dei mosaici genetici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Brückner e Istvan Ando per le scorte di mosche e gli anticorpi. Ringraziamo Marek Jindra e Colin Donohoe per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal premio Sofja Kovalevskaja a M.U. dalla Fondazione Alexander von Humboldt e dal progetto DFG UH243/1-1 a M.U. dalla Fondazione tedesca per la ricerca.

NOTA: Questo lavoro utilizza la eyFLP1; atto&gt; y +&gt; GAL4, UAS-GFP; FRT82B, vasca-Gal80 MARCM 82B verde tester linea 11. Attraversando il tester vergini MARCM 82B verdi per i maschi di ceppi, come w; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotipo produrrà progenie in cui si verifica la ricombinazione mitotica tra il diritto bracci del 3 ° cromosomi omologhi. In questo modo, i cloni mutanti omozigoti per il gene c trova distale al sito FRT82B sarà generato all&#39;interno della EAD e neuroepitelio cervello. Questi cloni esprimeranno GFP, transgene una e dsRNA per il gene B (Figura 1A). Diverse linee tester eyFLP-marcm per ricombinazione sulla X, 2L, 2R, 3L e 3R sono stati istituiti e sono disponibili all&#39;interno della comunità mosca. 1. Manipolazione Fly, Croci, e messa in scena <ol><li> Espandere il MARCM tester magazzino appropriato a temperatura ambiente popolando bo multiplattles allo stesso tempo. Capovolgere le adulti in bottiglie fresche ogni 2-3 giorni in modo che un numero sufficiente vergini possono essere raccolti per incroci successivi. NOTA: Quando si raccolgono le vergini, evitare l&#39;esposizione prolungata a CO 2 in quanto questo compromette la fecondità femminile. </li><li> A seconda della scala dell&#39;esperimento, istituito croci mosca in fiale che utilizzano almeno 10 vergini tester marcm e 4 maschi (ad esempio, per l&#39;imaging di giornalisti fluorescenti e di immunoistochimica) o in bottiglie con almeno 30 vergini e 10 maschi (ad esempio, per l&#39;isolamento di RNA e la quantificazione di invasività). </li><li> Sollevare progenie a 25 ° C sotto una lunga giornata / 8 ore ciclo luce-buio 16 ore. Capovolgere i genitori in nuovi flaconi / bottiglie ogni 24 ore per facilitare la messa in scena riproducibile di larve e per evitare il sovraffollamento. NOTA: A partire dal giorno 6 dopo uovo posa (AEL), alla fine del terzo controllo instar alimentazione arresto larve, inizia a vagare e immettere pupariation. Al contrario, l&#39;inizio della transizione larvale-pupa può essere delayed o inesistente nelle larve con EAD cuscinetto tumori clonali iperplastici o maligni. </li></ol> 2. Raccolta terza larve instar <ol><li> Per immunostaining, raccogliere circa 20 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare pinze per raccogliere delicatamente le larve dal flacone o bottiglia e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS (PBS). <ol><li> Per l&#39;isolamento di RNA e la quantificazione di invasività, raccogliere almeno 80 fine del III larve instar (vagando sul muro e quelli di dimensioni paragonabili corpo dal cibo). Utilizzare uno spruzzatore a schizzare PBS in una bottiglia contenente larve mosca fino a coprire la superficie. </li><li> Ammorbidire gli strati superiori di cibo con una spatola e versare il mash cibo contenente le larve in una capsula di Petri. Utilizzando pinze, prendere delicatamente larve e trasferirli in un piatto di vetro embrione pieno di PBS. </li></ol></li><li> Lavare le larve con PBS untIl tutto il cibo residuo viene rimosso. Ispezionare le larve con lo stereomicroscopio a fluorescenza con 8 a 16X di ingrandimento per scartare tutti &quot;leopardo larve&quot; che portano punti GFP-positive casuali in tutto il corpo larvale (Figura 2A, 2B e vedere Discussione Girone). NOTA: Per l&#39;isolamento di RNA includere una fase di lavaggio penultima nel 70% EtOH per 1 min. </li><li> Porre la capsula contenente larve selezionato in PBS in ghiaccio fino dissezione. Processo larve entro 30 minuti per evitare effetti negativi di freddo e di fame. </li></ol> 3. dissezione delle larve <ol><li> Per sezionare il EAD sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di pinze per premere delicatamente la parte centrale della larva contro il fondo piatto di vetro. Con la seconda pinza, afferrare i ganci bocca larvali e tirare via dal corpo (Figura 2C). NOTA: La forza di trazione è spesso sufficiente a rompere gli steli ottica che collega l&#39;EAD pair ai lobi cerebrali. Se il cervello o le sue parti restano attaccati alla EAD e la loro presenza non è desiderata per ulteriori applicazioni, tagliare i gambi ottica con l&#39;aiuto di due coppie di pinze. Per i tumori invasivi (ad esempio, ras V12 Scrib 1) la connessione tra EAD e i lobi del cervello diventa sempre più oscurate con il tempo da overgrowing e la migrazione di cellule clonali. <ol><li> Per preparare il complesso EAD / cervello con un intatto cordone nervoso ventrale (VNC) (Figura 2D), utilizzare pinze per tagliare una larva al centro del corpo. Eliminare la metà posteriore. </li><li> Tenere la metà anteriore del corpo larvale tra le punte di una pinza, capovolgere la larva dentro-fuori spingendo i ganci bocca con la punta della seconda pinza e facendo rotolare la cuticola sopra con la prima coppia pinze. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze rimuovere con cura tutti i tessuti estranei (ad esempio, le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e intestino), lasciando la coppia EAD oil complesso EAD / cervello collegato ai ganci bocca. Districare i ganci bocca dalla cuticola sovrastante. Liberare il VNC tagliando le proiezioni assoni che si estendono ai muscoli del corpo e dell&#39;epidermide (figure 1B, 2C, 2D). NOTA: I ganci bocca consentono la manipolazione sicura del tessuto con una pinza e facilitano affondamento più efficiente e facile riconoscimento del tessuto durante il lavaggio. Sezionato EAD cambiamento morfologia relativamente veloce, conservato non fissato in PBS. Limitare il tempo di dissezione per 20-30 min. </li><li> Per trasferire il tessuto, cappotto un P20 micropipetta punta pipettando corpo restante carcasse più volte su e giù. Per trasferire i complessi EAD / cervello più grande, tagliare la punta micropipetta P20 con le forbici. NOTA: La procedura di rivestimento è fondamentale per evitare che si attacchi e la perdita di tessuto sezionato durante il trasferimento. L&#39;uso di una micropipetta P20 minimizza il trasferimento di PBS in soluzione fissativa, diluizione limite indesiderato. <ol><li> Per immunostaining, trasferirela sezionato EAD in una provetta da 0,5 ml riempito con 400 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) fissativo. Utilizzare 1,5 ml di tubo con 1 ml di PFA per EAD grandi / complessi cerebrali pensati per il punteggio di invasività. ATTENZIONE: PFA è altamente tossico. Indossare guanti e indumenti protettivi. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. </li><li> Per l&#39;isolamento di RNA trasferire l&#39;EAD sezionato in un nuovo piatto di vetro riempita con PBS freddo. Utilizzare pinze per pulire EAD dalle ghiandole linfatiche ad anello e, per ridurre al minimo le contaminazioni del campione. </li><li> Staccare la EAD dai ganci bocca tagliando il collegamento tra i dischi antenna e bocca ganci con pinze (Figura 2E). Per evitare la degradazione dell&#39;RNA e manufatti di espressione genica, limitare il tempo dissezione a 30 min. Passare al punto 7. NOTA: Un ricercatore esperto può sezionare circa 60 larve in 30 min escluso il tempo necessario per la raccolta delle larve e lavaggio. Totale rendimenti RNA dipendono dalle dimensioni EAD che variano tra i genotipi e Sviluppo deiL fasi. La dissezione di 80-100 coppie controllo EAD dalla fine del III larve instar dovrebbe produrre 5-8 mg di RNA totale. </li></ol></li></ol> 4. Fissaggio, Immunocolorazione, e di montaggio <ol><li> Fix campioni in PFA fissativo per 25 min mentre oscillante a temperatura ambiente. Il tempo di fissaggio può essere estesa fino a 60 min senza alterare la morfologia dei tessuti e la antigenicità delle proteine. </li><li> Rimuovere i campioni fissativo e lavare con PBST (PBS con 0,1% Triton X-100) tre volte per 10 minuti utilizzando un nutator. Utilizzare un volume sufficiente di PBST per ogni fase di lavaggio (400 ml tubo / 0,5 ml). NOTA: fisso EAD complessi / cervello pensati per il punteggio di invasività non richiedono immunocolorazione. segnale GFP rimane ben visibile dopo la fissazione. Passare al punto 4.4 per la dissezione finale. <ol><li> Per immunostaining, blocco tessuto in 200 ml di una soluzione bloccante (PBST con 0,3% BSA) per 20 minuti con agitazione a temperatura ambiente. <ol><li> Incubare con primanticorpi ary diluiti in 100 ml di una soluzione di saturazione notte a 4 ° C mentre delicatamente agitando. Fare riferimento alla scheda tecnica primaria anticorpo o letteratura pubblicata per la diluizione degli anticorpi consigliata. NOTA: potrebbe aver bisogno di essere ottimizzato La diluizione anticorpo primario. </li><li> Dopo cinque 10 min lavaggi in PBST, tessuti macchia con gli anticorpi secondari fluorescenti diluito in soluzione bloccante mentre delicatamente agitazione per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare i campioni per tre volte 10 min in PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Sostituire PBST con 500 ml di soluzione DAPI-colorazione. Per etichettare F-actina, aggiungere falloidina coniugato ad un colorante fluorescente per soluzione DAPI-colorazione. Dopo 15 min nutazione al buio, lavare tessuti volta per 10 min con PBST. NOTA: etichettatura F-actina può essere effettuata indipendentemente dalla colorazione DAPI. </li><li> Per la fase di dissezione finale, il trasferimento del tessuto di nuovo in un piatto di vetro PBS-riempita con un pi 1 mlPette. Utilizzando le due coppie di pinze clip fuori i ganci bocca. <ol><li> Separare i cervelli che verranno utilizzati per la quantificazione della invasività dal EAD tagliando il gambo ottica come EAD invaso potrebbe ostacolare l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Mettere una goccia di mezzo di montaggio (15 microlitri per da 22 copri oggetto x 22 mm) su un vetrino oggettivo. Con l&#39;aiuto di pinze punte, distribuire il medium in uno strato sottile. Trasferimento EAD, cervello o complessi EAD / cervello nel mezzo di montaggio con una micropipetta P20. </li><li> Utilizzare i suggerimenti forcipe o una bacchetta di tungsteno per la distribuzione dei tessuti e raddrizzare il VNC sulla diapositiva. </li><li> Per evitare la formazione di bolle durante il montaggio, prima verso un bordo di un vetrino al mezzo di montaggio e poi lentamente inferiore sul montante con l&#39;aiuto di pinze. Usare piccoli pezzi di carta da filtro o tessuto wipe per assorbire mezzo di montaggio in eccesso intorno ai bordi coprioggetto. NOTA: DABCO / Poli (vinil alcool) 4-88 montaggio indurisce mediea 4 ° C in un&#39;ora. Le diapositive possono essere conservati per mesi a 4 ° C. </li></ol> 5. confocale Imaging <ol><li> Acquisire sezioni confocale singoli e pile utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con 20X, 40X obiettivi del petrolio e 60X. </li><li> Evitare la saturazione dei pixel. Utilizzare stessi parametri di acquisizione delle immagini, tra cui la risoluzione dell&#39;immagine, potenza in ingresso del laser, il guadagno, offset, cornice media, una dimensione di passo di una serie Z e mantenere queste impostazioni per tutti i genotipi per consentire il confronto di intensità dei pixel tra i diversi genotipi 21,22. NOTA: Per la visualizzazione del complesso / cervello EAD, generare il massimo proiezioni e cucire rispettivi, immagini vicine. Per la preparazione immagine finale, utilizzare posta software di elaborazione delle immagini per il montaggio del pannello e per regolare la luminosità e il contrasto. </li></ol> 6. Quantificazione del tumore invasività <ol><li> Definire un sistema di punteggio che caratterizzano i diversi livelli di invasivenes tumoralis considerando il modello spaziale di invasione e la quantità di cellule GFP-positive diffusione nel cervello e VNC. Preparare schede di valutazione per la documentazione (Figura 3A). </li><li> Mount almeno 80 fissato cervelli intatti per ogni genotipo su una diapositiva con 40 ml di mezzo di montaggio per 24 millimetri x 50 mm coprioggetto. <ol><li> Per consentire di punteggio imparziale, chiedere una parte neutrale a rendere anonima le diapositive, in modo che la procedura di punteggio è imparziale. Valutare diapositive anonimi di due membri del laboratorio indipendente. Divulgare genotipi solo dopo che il conteggio è finito. </li></ol></li><li> Valutare il grado di malignità da un punteggio cieca di cervelli montati sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri GFP. Usare un pennarello per etichettare i cervelli che sono stati già visti al fine di evitare il doppio conteggio (Figura 3B). </li><li> Calcolare la percentuale di cervelli che rientrano in ciascuna delle categorie definite invasive per genotipo. Determinare le s statisticiignificance utilizzando un test chi-quadrato (Figura 3C). </li></ol> 7. Isolamento RNA, trattamento DNasi, e di verifica della qualità NOTA: tutti i reagenti (soluzioni, plasticware) utilizzato nelle seguenti fasi dovrebbe essere libero di attività RNasi. Indossare sempre guanti e utilizzare una cappa chimica per il lavoro con solventi organici. <ol><li> Trasferire il EAD pulita con un rivestimento punta P20 micropipetta in 1,5 ml tubo. </li><li> Let sink tessuto al fondo del tubo, rimuovere con attenzione PBS e sostituirlo con 100 microlitri di reagente di lisi RNA (sufficiente per fino a 140 EAD). </li><li> Lyse tessuto nel vortex. A questo punto, i campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C o direttamente trattati con un protocollo di isolamento di RNA standard. NOTA: I campioni di genotipi simili da vari cicli di dissezione possono essere raggruppati in una volta RNA reagente di lisi. </li><li> Riempire il volume del campione di 0,9 ml con il reagente RNA lisi. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare campioni vigoroamente per 15-20 sec. </li><li> Dopo 2 a 3 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire incolore superiore fase acquosa contenente l&#39;RNA in una nuova provetta senza disturbare l&#39;interfase. Stare lontano dal interfase in quanto contiene proteine ​​e DNA genomico. NOTA: Il volume recuperato dovrebbe essere circa il 60% del volume di reagente RNA lisi utilizzato per omogeneizzazione. </li><li> Precipitare l&#39;RNA aggiungendo 0,5 ml di alcool isopropilico. Vortex e incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA, una volta con 600 ml di etanolo al 75%. Dopo un breve vortice e centrifugazione (10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C) scartare tutte etanolo e lasciare che il pellet di RNA asciugare per 5-10 min posizionare il tubo aperto su un tessuto panno pulito. NOTA: Il pellet di RNA potrebbe essere visibile come un piccolo opaco / bianco stmaturi sul fondo del tubo o invisibile. Le gocce di etanolo rimanenti possono essere accuratamente rimosso con la punta P10 micropipetta. </li><li> Sciogliere RNA in 50 ml di acqua DEPC trattati con il vortex o passando soluzione un paio di volte attraverso un puntale. </li><li> Per ridurre al minimo la contaminazione con il DNA genomico, il trattamento di RNA totale con DNasi con l&#39;aggiunta di 50 ml di una miscela contenente 1 ml di DNasi (2 U / mL) e 10 ml di 10x tampone DNasi in acqua DEPC-trattata. Vortex e spin down. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua o di un blocco di riscaldamento per 30 a 40 min. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 100 ml di acqua DEPC trattati in ogni campione. </li><li> Per inattivare l&#39;attività enzimatica e RNA pulita dal DNasi, aggiungere 200 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1), soluzione vortex per 1 min e centrifugare i campioni a 10.000 xg per 7 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore contenente RNA in una nuova provetta. Aggiungere un volume uguale (200 ml)di cloroformio, mescolare e ripetere la fase di centrifugazione dall&#39;alto. </li><li> Raccogliere accuratamente la fase superiore e precipitare RNA aggiungendo 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, pH 5,2 preparata in DEPC H 2 O e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare bene nel vortex. NOTA: L&#39;aggiunta di 0,5 ml di glicogeno (20 mg / mL) per un mix di precipitazione aiuta a visualizzare il pellet di RNA. Per ridurre al minimo la perdita di RNA, usare, tubi siliconate bassi vincolante 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Precipitare l&#39;RNA a -20 ° C per almeno 1 ora. NOTA: L&#39;incubazione può essere effettuata durante la notte. I campioni possono essere collocati a -80 ° C, come pure. </li><li> Pellet RNA mediante centrifugazione a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C. Lavare e asciugare pellet seguendo la descrizione in 7.9. </li><li> Sciogliere RNA in 10-15 ml di acqua DEPC trattati. RNA Conservare a -80 ° C. </li><li> Determinare la quantità e la purezza di RNA misurando OD a 230 nm, 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. Calcola RNA concentration applicando la convenzione che 1 OD a 260 nm è pari a 40 mg / ml di RNA. NOTA: Il rapporto A 260/280 di RNA &quot;puro&quot; equivale 2.0 mentre un rapporto A 260/230 dovrebbe essere nell&#39;intervallo 2.0-2.2. Campioni di RNA con un rapporto A 260/280 tra 1,7 e 2,0 sono adatti per applicazioni a valle come la sintesi del DNA. Per la preparazione di librerie mRNA-seq la qualità e la quantità di RNA dovrebbero essere controllati mediante un sistema di elettroforesi automatizzato. Il rapporto 28S / 18S deve essere superiore a 1,8. </li></ol>

<ol><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%3A+a+bold+past%2C+a+bright+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+How+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPagliarini%2C+RA+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22">Science (New York, NY)</a>. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).</li>
<li>Turkel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BTB-zinc+finger+transcription+factor+abrupt+acts+as+an+epithelial+oncogene+in+Drosophila+melanogaster+through+maintaining+a+progenitor-like+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state.</a> PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+Diverts+a+Host+TNF+Tumor+Suppressor+Activity+into+Tumor+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Drosophila%2C+RhoGEF2+cooperates+with+activated+Ras+in+tumorigenesis+through+a+pathway+involving+Rho1-Rok-Myosin-II+and+JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling.</a> Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).</li>
<li>Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sds22%2FPP1+links+epithelial+integrity+and+tumor+suppression+via+regulation+of+myosin+II+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling.</a> Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Drosophila+Tumors+Interrupt+Insulin+Signaling+to+Induce+Cachexia-like+Wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting.</a> Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127 (4), 851-860 (2000).</li>
<li>Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+of+the+eyeless+gene+of+Drosophila+to+the+Small+eye+gene+in+mice+and+Aniridia+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans.</a> Science. 265 (5173), 785-789 (1994).</li>
<li>Külshammer, E., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cross-linker+Filamin%2FCheerio+mediates+tumor+malignancy+downstream+of+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).</li>
<li>Külshammer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+among+Drosophila+transcription+factors+Ets21c%2C+Fos+and+Ftz-F1+drives+JNK-mediated+tumor+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).</li>
<li>Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+immune+response+of+blood+cells+to+tumors+and+tissue+damage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).</li>
<li>Chatterjee, N., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+%CE%A6C31+based+reporter+system+for+measuring+AP-1+and+Nrf2+signaling+in+Drosophila+and+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture.</a> PloS One. 7 (4), e34063(2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Andersen, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TNF+receptor+Grindelwald+couples+loss+of+cell+polarity+and+neoplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth.</a> Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).</li>
<li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).</li>
<li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).</li>
<li>Mirth, C. K., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+body+and+organ+size+in+Drosophila%3A+recent+advances+and+outstanding+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems.</a> Front Endocrinol. 3 (49), (2012).</li>
<li>French, V., Feast, M., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+size+and+cell+size+in+Drosophila%3A+the+developmental+response+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature.</a> J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).</li>
<li>Ashburner, M., Bonner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+gene+activity+in+drosophila+by+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of gene activity in drosophila by heat shock.</a> Cell. 17 (2), 241-254 (1979).</li>
<li>Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effects+of+rearing+temperature+and+oxygen+on+the+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Biochem+Zool%22%5BJournal%5D)">Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster.</a> Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li>
<li>Rynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Transcription+Factor+3+Regulates+Immune+and+Metabolic+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis.</a> Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).</li>
<li>Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Le tecniche per generare mosaici genetici in Drosophila sono tra gli strumenti più sofisticati per l&#39;analisi e la manipolazione di funzione del gene 33. Il sistema eyFLP-MARCM ha dimostrato potente e robusto quanto consente l&#39;induzione di marcate visivamente, cloni geneticamente definiti in modo spazialmente ristretta, cioè, in tessuti dove enhancer eyeless è attivo 9,18. Ciò è particolarmente importante quando più lesioni genetiche sono combinati nelle stesse cel...

Il cancro rappresenta uno dei gruppi più geneticamente eterogeneo di malattie, la cui incidenza e la mortalità è drammaticamente in aumento, in particolare tra gli anziani in tutto il mondo. Il cancro ha origine clonale da una cellula tumorale-inizio che sfugge meccanismi oncosoppressori intrinseca e divide fuori controllo. Il progressivo accumulo di lesioni genetiche che promuovono in cooperazione la crescita, la proliferazione e la motilità, mentre inibisce la morte e la differenziazione trasforma la crescita eccessiva benigna iniziale in un tumore altamente maligno, metastatico e mortale. È diventato evidente che, oltre ad alterazioni genetiche, progressione tumorale richiede cambiamenti nello stroma circostante e diafonia tra i tipi di tumore e multiple di cellule (ad esempio, fibroblasti, cellule immunitarie e endoteliali) nel suo microambiente. La comprensione dei principi molecolari alla base la trasformazione maligna comprese le interazioni tumore-stroma è di grande importanza per lo sviluppo di prevenzionezione e screening precoce strategie, così come i trattamenti nuovi ed efficaci per combattere la metastasi del cancro e la resistenza ai farmaci. La mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema interessante per la ricerca sul cancro 1-4 grazie al suo tempo di generazione veloce, notevole risparmio di segnalazione nodi tra le mosche e gli esseri umani, limitati ridondanza genetica e la ricchezza di strumenti genetici avanzati che facilitano la manipolazione di quasi ogni gene in maniera limitata temporaneamente e spazialmente. Tumori geneticamente definite di varia malignità possono essere riproducibile progettati in Drosophila introducendo GAIN- e la perdita-di-funzione mutazioni in un sottogruppo di progenitori in un tessuto di tipo altrimenti selvaggio con la tecnica MARCM 5. Lo strumento MARCM combina FLP / FRT (FLP ricombinasi / FLP Target Recognition) mediata ricombinazione mitotica 6 con FLP-out 7 e GAL4 / UAS (Upstream sequenza di attivazione) del gene bersaglio 8sistemi di espressione 9. Con questo metodo l&#39;espressione di qualsiasi transgene UAS-based, tra cui oncogene o cDNA proteina fluorescente o ripetizioni di DNA invertite per silenziamento genico dsRNA-indotta, sarà limitato a un clone di cellule che hanno perso uno specifico locus genetico e un repressore GAL4 a causa di ricombinazione (Figura 1A). Patch clonali contrassegnati con verde fluorescente (GFP) o proteine fluorescenti rossi (ad esempio, RFP, DsRed, mCherry) può essere facilmente rintracciato durante lo sviluppo, isolato e analizzato. È importante sottolineare che il loro comportamento può essere direttamente confrontata con l&#39;adiacente tessuti wild type. Così, domande pertinenti alla cella effetti autonome e non autonome di lesioni genetiche possono essere studiati convenientemente. Simile a mammiferi, solo cloni in cui lesioni multiple oncogeni sono combinati diventano maligne in Drosophila e ricapitolano caratteristiche chiave del cancro mammiferi. Essi overproliferate, eludere l&#39;apoptosi, inducono l&#39;infiammazione, diventare immortale e Invasive, in ultima analisi, uccidendo l&#39;ospite 10-17. Qui, descriviamo un protocollo di generare tumori clonali geneticamente definite nel tessuto oculare / antenne e il cervello di Drosophila larve con la tecnica MARCM. Il metodo si basa su un tester magazzino MARCM che esprime la FLP ricombinasi lievito sotto il controllo del enhancer senza occhi (eyFLP) 18,19. In questo modo, cloni GFP-etichettata sono generati in funzione sia epitelio colonnare peripodial e della EAD e neuroepitelio del cervello durante le fasi embrionali e larvali (Figura 1A, B e di riferimento 20). I cloni possono essere facilmente seguiti fino all&#39;età adulta, come la EAD si sviluppa nella capsula occhio adulti, antenna e la testa mentre il neuroepitelio dà luogo a neuroblasti che producono differenziate neuroni del lobo ottiche. Per facilitare estesa caratterizzazione molecolare, funzionale e fenotipica del tessuto mosaico, si descrivano un protocollo per la dissezione del EAD e il cervello dalla terza larve instar e delineare come elaborarli per tre diverse applicazioni: (i) la rilevazione di reporter fluorescenti transgenici e immunostaining, (ii) la quantificazione di invasività tumorale e (iii) analisi dei espressione genica cambia utilizzando una quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) o di un high-throughput sequencing mRNA (mRNA-seq) (Figura 1C). Il protocollo immunostaining può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi proteina di interesse con un anticorpo specifico. Transgenici reporter trascrizionali fluorescenti forniscono informazioni spazio-temporale comodo e preciso sull&#39;attività di un particolare percorso di segnalazione. reporter specifici Cell-lignaggio, invece, riflettono i cambiamenti qualitativi e quantitativi in ​​popolazioni di cellule all&#39;interno del tessuto del mosaico e tra tumori genotipi distinti. La quantificazione del comportamento invasivo facilita il confronto delle malignità del tumore tra il genotipoS. Infine, il protocollo che descrive la raccolta e l&#39;elaborazione di EAD mosaico per l&#39;isolamento di RNA è adatto sia per applicazioni a valle piccola e grande scala, come trascrizione inversa seguita da rispettivamente qRT-PCR e di tutto il genoma mRNA-Seq,. I dati qualitativi e quantitativi ottenuti da questi test forniscono nuove intuizioni sul comportamento sociale dei tumori clonali. Inoltre, producono una solida base per studi funzionali sul ruolo dei singoli geni, le reti genetiche e microambiente tumorale in diverse fasi e gli aspetti della tumorigenesi.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&uuml; rzm&uuml; hle Brecht, Eggenstein, Germania</td><td>00262-0500</td><td>Ricetta del cibo per mosche: Preparare 20 L di cibo per mosche con 160 g di agar, 360 g di lievito, 200 g di farina di soia, 1,6 kg di farina di mais gialla, 1,2 L di estratto di malto, 300 ml di sciroppo di mais leggero, 130 ml di acido propionico e 200 ml di nipagina al 15%. Il cibo per mosche deve essere cotto per 1 ora a 85 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sciroppo di mais</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germania</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Acido propionico</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Farina di mais</td><td>ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germania</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di malto</td><td>CSM Deutschland GmbH, Brema, Germania</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Farina di soia</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Germania</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Lievito</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germania</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Metil-4-benzoato / Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>H5501</td><td>Preparare una soluzione madre al 15% con il 70% di EtOH</td></tr><tr><td>Drosophila cibo per mosche fiale</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Germania</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per fiale</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germania</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila fly food bottles</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per bottiglie</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>81381</td><td>Ricetta del mezzo di montaggio: sciogliere 6 g di poli(alcol vinilico) 4-88 in 39&nbsp; ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) e 12,5 ml di glicerolo. Mescolare per una notte a 50 &deg; C e centrifuga 20&nbsp; min a 5.000 giri/min. Aggiungere DABCO al surnatante per ottenere una concentrazione finale del 2,5%. Memorizza le aliquote a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano/ DABCO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 in Millipore H2O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldeide/ PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>158127</td><td>4% PFA ricetta fissativa: Dissolvere 4&nbsp; g PFA in 80 ml di Millipore H2O su una piastra di agitazione magnetica riscaldata a 55&nbsp; &deg;C. Aggiungere 1 M di NaOH goccia a goccia fino a quando tutte le particelle di PFA sono disciolte. Aggiungere 10 ml di PBS 10x e regolare il pH a 7,4 con 1 M HCl. Mescolare in 100 &micro; l Triton X-100 e riempire con Millipore H2O fino a 100 ml. Conservare le aliquote a -20 °C. Evitare scongelamenti ripetuti. (ATTENZIONE: il PFA è altamente tossico. Preparare il fissativo PFA in una cappa aspirante. Indossare un autorespiratore, guanti e indumenti. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose.)</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>A3059</td><td>Ricetta della soluzione bloccante: Sciogliere lo 0,3% di BSA in PBST</td></tr><tr><td>Falloidina marcata in fluorescenza</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germania, Sonde molecolari</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Soluzione madre di falloidina: Sciogliere la polvere (300 U) in 1,5 ml di metanolo. Conservare a -20 °C. Per la colorazione, utilizzare in diluizione 1:250 (A12379, A22283) e 1:100 (A22284) in PBST.</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindolo Dicloridrato/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania</td><td>6335</td><td>Soluzione colorante DAPI: Preparare una soluzione madre di 5 mg/ml in Millipore H2O e conservare le aliquote a 4 °C. Utilizzato in diluizione 1:1.000 in PBST.</td></tr><tr><td>Mouse anti-H2 antibody</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Utilizzato in diluizione 1:500 in soluzione bloccante</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK</td><td>715-175-151</td><td>Utilizzato in diluizione 1:500 in soluzione bloccante</td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germania</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per embrioni in vetro (30&nbsp; mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Aghi di tungsteno Strumenti per</td><td>la scienza fine, Heidelberg, Germania</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per perno nichelato</td><td>Strumenti per la scienza fine, Heidelberg, Germania</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24 x 50 mm (0,13-0,16&nbsp; mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Salviette di precisione</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio da dissezione</td><td>Olympus, Amburgo, Germania</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Giappone)</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente</td><td>Olympus, Amburgo, Germania</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Giappone) con telecamera</td> <td>CCD DP72Dotato del set di filtri passa-banda blu stretti per l'eccitazione di GFP di altri fluorocromi eccitabili blu (filtro di eccitazione BP460-480 nm, filtro barriera BA495-540 nm) e filtro di eccitazione verde stretto e filtro barriera passa-lungo per RFP e altri fluorocromi eccitabili verdi (filtro di eccitazione BP530-550, filtro barriera BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus, Amburgo, Germania</td><td>FV1000</td><td>Dotato di microscopio IX81 invertito. Obiettivi: 20&volte; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&volte; UPlanFL (NA 1.30) e 60&volte; UPlanApo (NA 1.35). Laser: Laser UV Diodo LD405 (50&nbsp; mW), laser ad argon, multilinea 457/(476)/ 488/515 (40&nbsp; mW), diodo laser giallo/verde LD560 (15&nbsp; mW) e il diodo laser rosso 635 (20&nbsp; mW). Software: Fluoview 2.1c Software</td></tr><tr><td>Incubatore raffreddato Drosophila</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germania</td><td>&nbsp; Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia a spruzzo</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo digitale ELMI</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Reagente per lisi isol-RNA</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>2302700</td><td>Il protocollo è compatibile con altri reagenti a base di TRIzol, ad es, TRIreagent di Sigma (Cat. Nr.T9424), reagente TRIzol di Thermofisher (Cat. Nr. 15596).</td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietil/ DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germania</td><td>D5758</td><td>Diluire DEPC 1:1.000 in Millipore H2O, agitare durante la notte e sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNasi (2 U/&micro; l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germania</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>VWR, Darmstadt, Germania</td><td>27652.232</td><td>Preparare una soluzione di acetato di sodio 3 M con DEPC-H2O e regolare il pH a 5,2</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td></td><td></td>109634</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>100983</td><td>Preparare una diluizione di EtOH al 75% con DEPC-H2O.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/VIS NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge (refrigerato)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Germania</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Stazione di elettroforesi automatizzata Experion</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Germania</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa SuperScript III</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germania</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio</td><td></td><td>Prepare 100 &; M stock soluzioni in DEPC-H2O e stoccaggio a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>dNTP Miscela</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Francia</td><td>4030</td><td>Negozio aliquote da 25 &micro; l a -20&deg; C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Germania</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Germania</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR a guscio rigido a 96 pozzetti, parete sottile</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Germania</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola Microseal 'B'</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&uuml; nchen, Germania</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>rp49 Primer diretto</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgio</td><td></td><td>5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'</td></tr><tr><td>rp49 Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio</td><td></td><td>5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Primer diretto</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio</td><td></td><td>5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'</td></tr><tr><td>mmp1 Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Lovanio, Belgio</td><td></td><td>5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'</td></tr></tbody></table>

il<em&gt; drosophila</em&gt; immaginale disc tumore modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di tumor invasività utilizzando genetica mosaici

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster è emerso come un potente sistema sperimentale per studi funzionali e meccanicistici dello sviluppo e della progressione del tumore nel contesto di un intero organismo. Tecniche sofisticate per generare mosaici genetici facilitano l'induzione di cloni geneticamente definiti, marcati visivamente, circondati da tessuto normale. I cloni possono essere analizzati attraverso diversi approcci molecolari, cellulari e omici. Questo studio descrive come generare tumori clonali marcati in fluorescenza di malignità variabile nei dischi immaginali occhio/antennali (EAD) delle larve di Drosophila utilizzando la tecnica MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker). Descrive le procedure su come recuperare l'EAD a mosaico e il cervello dalle larve e come elaborarli per l'imaging simultaneo di reporter transgenici fluorescenti e la colorazione degli anticorpi. Per facilitare la caratterizzazione molecolare del tessuto mosaico, descriviamo un protocollo per l'isolamento dell'RNA totale dall'EAD. La procedura di dissezione è adatta per recuperare EAD e cervello da qualsiasi stadio larvale. Il protocollo di fissazione e colorazione per i dischi immaginali funziona con una serie di reporter transgenici e anticorpi che riconoscono le proteine di Drosophila. Il protocollo per l'isolamento dell'RNA può essere applicato a vari organi larvali, larve intere e mosche adulte. L'RNA totale può essere utilizzato per la profilazione dei cambiamenti di espressione genica utilizzando approcci candidati o a livello di genoma. Infine, descriviamo un metodo per quantificare l'invasività dei tumori clonali. Sebbene questo metodo abbia un uso limitato, il suo concetto di base è ampiamente applicabile ad altri studi quantitativi in cui è necessario evitare bias cognitivi.

Per dimostrare le potenzialità della tecnica eyFLP-MARCM per generare patch GFP-marcato su genotipi definiti in Drosophila EAD, sono stati indotti tre tipi di cloni: (1) il controllo che esprimono GFP solo, (2) tumori maligni che esprimono una forma oncogenica del piccolo G-proteina Ras (Ras V12) in un contesto di perdita omozigote di uno scarabocchio gene soppressore del tumore (Scrib 1) e (3) overgrowing ma non invasivo ras V12<...

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l&#39;invasività del tumore.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare come dissezionare i dischi immaginali oculari-antennali e i cervelli di drosophila, contenenti cloni marcati con fluorescenza geneticamente definiti, e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti nell'espressione genica e l'invasività cellulare. Le procedure descritte possono contribuire a fornire nuove informazioni sul ruolo dei geni nello sviluppo epiteliale, nell'omeostasi o nelle malattie, e a chiarire i meccanismi alla base della loro competizione, della proliferazione compensativa o della cooperazione interclonale. Il principale vantaggio di questo studio è che forniamo un insieme completo di protocolli appositamente progettati per l'analisi qualitativa e quantitativa approfondita dei mosaicici genetici di drosophila.Generalmente, le persone che iniziano a lavorare con il modello di drosophila incontrano difficoltà perché non riescono a riconoscere il disco immaginale occhio-antennale dagli altri dischi immaginali. Per facilitare il riconoscimento del disco immaginale occhio-antennale che porta cloni marcati con fluorescenza all'interno del corpo della larva, si raccomanda di eseguire le dissezioni iniziali al microscopio fluorescente. L'analisi mosaic con un marcatore cellulare reprimibile, o MARCM, permette la generazione di chiazze clonali geneticamente definite in un contesto altrimenti di tipo selvatico dal punto di vista fenotipico.Una FLP guidata da un promotore eyeless catalizza il ricombinamento tra due elementi FRT che delimitano una cassetta di stop marcata con un gene giallo. Dopo la replicazione del DNA, la FLP catalizza lo scambio dei cromatidi non fratelli tra i cromosomi omologhi, generando cromatidi fratelli: uno portatore dell'allele di tipo selvatico e del repressore Gal80, e l'altro del mutante.Nella mitosi queste si separano per produrre due cellule figlie, una delle quali è un mutante omozigote e l'altra di tipo selvaggio. La perdita del repressore Gal80 permette l'espressione di GFP nel mutante, mentre le cellule di tipo selvaggio rimangono negative per GFP. Per iniziare l'esperimento, raccogliere le larve mosaiche spruzzando PBS nella bottiglia delle mosche fino a coprire la superficie del terreno di coltura.Quindi ammorbidire lo strato superiore con una spatola e versare la sospensione alimentare contenente le larve in una piastra di Petri. Prelevare delicatamente le larve e trasferirle in una capsula per embriologia riempita con PBS. Raccogliere almeno 20 larve per l'immunomarcatura e 80 larve per la quantificazione dell'invasività tumorale.Lavare le larve con PBS per rimuovere tutti i residui di cibo. Utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza con un ingrandimento di 8:16x, identificare e scartare tutte le larve leopard, ovvero quelle che mostrano punti positivi per GFP in modo casuale su tutto il corpo. Collocare la piastra contenente le larve rimanenti in PBS su ghiaccio fino alla dissezione.Per dissezionare il disco immaginale occhio-antennale sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare un paio di pinzette e afferrare delicatamente la larva a circa 2/3 della lunghezza del corpo a partire dalla testa. Con il secondo paio di pinzette afferrare gli uncini boccali della larva e tirarli lontano dal corpo. Utilizzando le pinzette, separare gli uncini boccali dal tegumento sovrastante e dai tessuti accessori come le ghiandole salivari e il corpo adiposo.In alternativa, per preparare il complesso del disco occhio-antennale e cervello mantenendo intatto il cordone nervoso ventrale, utilizzare la pinzetta per tagliare una larva al centro del corpo. Scartare la metà posteriore. Tenere la metà anteriore del corpo larvale con le punte di una coppia di pinzette, quindi rivoltare la larva all'inverso spingendo i ganci boccali verso l'interno con la punta della seconda coppia e arrotolando l'epidermide sopra di essi con la prima coppia di pinzette.Rimuovere con attenzione tutti i tessuti estranei, inclusi l'intestino, il corpo adiposo e le ghiandole salivari. Estrarre delicatamente i ganci boccali dal cuticolo. Rilasciare il complesso disco occhio-antennale-cervello attaccato ai ganci boccali recidendo le proiezioni assonali provenienti dal cordone nervoso ventrale verso i muscoli e l'epidermide.Per trasferire il tessuto, rivestire prima una punta per micropipetta P20 aspirando e dispensando su e giù per diverse volte i restanti carcassi del corpo, quindi utilizzare la stessa punta per trasferire il tessuto dissezionato. Per trasferire complessi più grandi di disco oculo-antennale e cervello, pre-tagliare la punta P20 per allargare l'apertura. Fissare i campioni in 400 microlitri di fissativo al 4% di PFA per 25 minuti a temperatura ambiente, agitando delicemente.Quindi rimuovere il fissativo e lavare i campioni con PBST tre volte per 10 minuti con agitazione. Successivamente, sostituire il PBST con 500 microlitri di soluzione colorante DAPI e agitare per 15 minuti al buio. Lavare il tessuto una volta per 10 minuti con PBST.Per completare la dissezione, utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire il tessuto in una piastra di vetro contenente PBS. Utilizzando due paia di pinzette, separare i cervelli da utilizzare per la quantificazione dell'invasività dai dischi oculari-antennali tagliando i peduncoli ottici. Liberare i dischi oculari-antennali staccandoli dai ganci boccali. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino da montaggio e, utilizzando pinzette, distribuire il liquido in uno strato sottile. Per quantificare l'invasività, posizionare almeno 80 cervelli fissati e integri per ogni genotipo su un singolo vetrino. Raddrizzare e posizionare il tessuto nella configurazione desiderata.Toccare delicatamente un bordo di un coprioggetto con il mezzo e abbassarlo lentamente con l'aiuto di pinzette per evitare la formazione di bolle d'aria. Utilizzare un fazzoletto da laboratorio per assorbire il mezzo di montaggio in eccesso ai bordi. Il tessuto può ora essere esaminato mediante imaging confocale.Chiedere a una parte neutrale di anonimizzare i vetrini in modo che il punteggio sia imparziale. Far valutare i vetrini indipendentemente da almeno due ricercatori. Rivelare i genotipi solo dopo aver completato la valutazione.Valutare il grado di malignità mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza dotato di un set di filtri per GFP. Etichettare con un marcatore i cervelli già osservati per evitare conteggi doppi. Le immagini confocali a fluorescenza mostrano cervelli isolati da larve portatrici di tumori clonali maligni GFP-etichettati, mutanti per RAS V12 e scribble, colorati con DAPI.I pannelli rappresentano i quattro diversi gradi di invasività tumorale. La quantificazione imparziale ha rivelato che l'inibizione della segnalazione JNK e dei cloni RAS V12 scribbled uno sopprime l'invasività tumorale. Nei dischi oculari-antennali di controllo, il reporter sensibile a JNK TRE-DsRED etichetta solo una sottile striscia di cellule che si estende dalla parte antennale a quella oculare.A differenza di quanto osservato, l'attività di TRE-DsRED è risultata notevolmente potenziata nei tumori clonali maligni positivi per GFP. Al giorno 8, le cellule tumorali hanno invaso i dischi oculari-antennali e si sono diffuse al cordone nervoso ventrale. Le cellule tumorali invasive hanno inoltre mostrato un aumento dell'attivazione della via JNK rispetto al tessuto circostante.Sebbene il blocco di JNK abbia chiaramente ridotto l'attività di TRE-DsRED nei cloni tumorali, l'aumento dell'intensità del laser ha rivelato un potenziamento nelle cellule epiteliali adiacenti ai cloni. Inoltre, un reporter hemolectin delta DsRED ha mostrato che, a differenza di alcuni rari aggregati di emociti presenti nelle indentazioni dell'epitelio controllo dell'occhio-antenna, gli emociti si accumulavano nei tessuti dell'occhio-antenna e del cervello costituiti da tumori maligni. In seguito all'inibizione di JNK, il numero di cellule immunitarie associate è drasticamente diminuito.L'aumentata invasività tumorale, l'attività della JNK e l'infiltrazione di emociti sono state accompagnate da un significativo aumento dell'espressione di MMP1 mNRA, determinato mediante QRTPCR utilizzando RNA totale isolato da dischi oculari-antennali a mosaico dissezionati. Una volta acquisita padronanza della tecnica, è possibile dissezionare oltre 60 coppie di dischi oculari e cervelli entro 30 minuti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di generare un numero sufficiente di larve con i genotipi desiderati.Siate rapidi ma precisi durante la dissezione per mantenere i campioni destinati all'isolamento dell'RNA liberi da RNS. Dopo la dissezione, il western blot può essere utilizzato come alternativa all'immunomarcatura per valutare le variazioni nell'espressione proteica tra diversi genotipi. La creazione di mosaicici genetici e la loro analisi mediante le procedure descritte permettono lo studio di mutazioni altrimenti letali e dei meccanismi di cooperazione degli oncogeni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare tessuti mosaicici del disco occhio-antennale e cervelli da larve di terzo stadio, nonché di come processarli per immunomarcatura, visualizzazione dell'attività transgenica e promotoriale, estrazione di RNA e quantificazione dell'invasività.Si ricorda che il PFA, il fenolo-cloroformio e il DAPI sono altamente tossici e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti e abbigliamento protettivo, durante la manipolazione di questi agenti.

the-drosophila-imaginal-disc-tumor-model-visualization-quantification

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Mesoscopici fluorescenza tomografia opera oltre i limiti di penetrazione del tessuto-sezionamento microscopia a fluorescenza. La tecnica è basata su multi-proiezione di illuminazione e una descrizione di trasporto fotone. Abbiamo dimostrato in vivo di tutto il corpo visualizzazione 3D della morfogenesi della GFP che esprimono ala dischi immaginale...

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.

L&#39;analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

Abbiamo sviluppato modelli di co-coltura 3D per live-cell imaging in tempo reale delle interazioni tra cellule tumorali del seno e altre cellule nel loro microambiente che hanno un impatto progressione verso un fenotipo invasivo. Questi modelli possono servire come schermi preclinici di farmaci per colpire paracrino indotte proteolitici, percorsi chemochine / citochine e chinasi implicati nella invasività.

Modelli per MAME 4D Live-Imaging cellule di tumore: Interazioni microambiente che Impact progressione maligna

La cooperazione tra l'oncogene attivato, come RAS V12 e le mutazioni nei geni della polarità cellulare come scarabocchiato, causare la crescita del tumore in Drosophila in cui le cellule tumorali mostrano anche comportamenti invasivi. Qui un semplice protocollo per l'induzione e l'osservazione dei tumori benigni e invasivi è presentato.

Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

L'obiettivo di questo studio è dimostrare come la strategia della transgenesi a mosaico possa essere utilizzata nel pesce zebra per valutare in modo rapido ed efficiente i contributi relativi di più oncogeni nell'inizio e nella progressione del tumore in vivo.

Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

L'analisi del clone di mosaico nel disco epiteliale di Drosophila imaginal è un potente sistema di modelli per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. Qui descriviamo un protocollo per indurre tumori nei dischi immaginari di ala Drosophila utilizzando il sistema GAL4-UAS e introdurre un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali.

Induzione e diagnosi dei tumori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

Questo protocollo è progettato per l'imaging e l'analisi delle dinamiche dell'orientamento cellulare e della crescita dei tessuti nell'epitelio addominale della Drosophila mentre la mosca della frutta subisce la metamorfosi. La metodologia qui descritta può essere applicata allo studio di diverse fasi di sviluppo, tessuti e strutture subcellulari nella Drosophila o in altri organismi modello.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Questo protocollo fornisce una guida dettagliata per l'allotrapianto generazionale iniziale e continuo di tumori della Drosophila nell'addome di ospiti adulti per lo studio di vari aspetti della neoplasia. Utilizzando un apparato autoiniettore, i ricercatori possono ottenere una migliore efficienza e resa tumorale rispetto a quelli ottenuti con metodi manuali tradizionali.

Allotrapianto tumorale in Drosophila melanogaster con iniettore auto-nanolitro programmabile

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Scopri come dissecare dischi immaginali occhio-antennali e cervelli di Drosophila con cloni fluorescenti per visualizzare e quantificare l'espressione genica e l'invasività tumorale. Questo metodo fornisce protocolli completi per l'analisi quantitativa dei mosaici genetici.

Il Drosophila Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici (Video) | JoVE Journal

Il

Esplora altri video