Il Drosophila Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare come sezionare i dischi immaginali e i cervelli dell'occhio-antennale della drosophila, che trasportano cloni geneticamente definiti marcati in fluorescenza e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti dell'espressione genica e l'invasività cellulare. Le procedure descritte possono aiutare a fornire nuove informazioni sul ruolo dei geni e sullo sviluppo epiteliale, sull'omeostasi o sulla malattia e a sezionare i meccanismi alla base della loro competizione, proliferazione compensatoria o società interclonale. Il vantaggio principale dello studio è che forniamo un'intera serie di protocolli su misura per un'analisi quantitativa e qualitativa approfondita dei mosaici genetici della drosophila.

Generalmente gli individui che lavorano per la prima volta con il modello di drosofila lottano perché non riescono a riconoscere il disco immaginale occhio-antenna dall'altro disco immaginale. Per facilitare il riconoscimento del disco immaginale occhio-antennale che porta cloni marcati in modo fluorescente all'interno del corpo larvale, si raccomanda di eseguire le dissezioni iniziali al microscopio a fluorescenza. L'analisi a mosaico con un marcatore cellulare repressibile o MARCM consente la generazione di patch clonali geneticamente definite in un contesto altrimenti fenotipicamente wild-type.

Una FLP guidata da un promotore eyeless catalizza la ricombinazione tra due elementi FRT che fiancheggiano una cassetta di arresto contrassegnata da un gene giallo. Dopo la replicazione del DNA, la FLP catalizza lo scambio dei cromatidi non fratelli tra i cromosomi omologhi che generano cromatidi fratelli. Uno portava l'allele wild-type e il repressore Gal80 e l'altro il mutante.

Nella mitosi questi si segregano per produrre due cellule figlie, una delle quali è un mutante omozigote e l'altra di tipo selvatico. La perdita del repressore Gal80 consente l'espressione della GFP nel mutante, mentre le cellule wild-type rimangono GFP negative. Per iniziare l'esperimento, raccogli le larve di mosaico spruzzando PBS nella bottiglia antimosche per coprire la superficie del cibo.

Quindi ammorbidire lo strato superiore con una spatola e versare l'impasto alimentare contenente le larve in una capsula di Petri. Raccogli delicatamente le larve e trasferiscile in un piatto per embrioni riempito di PBS. Raccogliere almeno 20 larve per l'immunocolorazione e 80 larve per la quantificazione dell'invasività tumorale.

Lavare le larve con PBS per rimuovere tutto il cibo residuo. Utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente con ingrandimento 8:16x, identifica e scarta tutte le larve di leopardo, che sono quelle che mostrano macchie casuali positive alla GFP in tutto il corpo. Posizionare il piatto contenente le larve rimanenti in PBS sul ghiaccio fino alla dissezione.

Per sezionare il disco immaginale occhio-antennale sotto lo stereomicroscopio, utilizzare un paio di pinze e afferrare delicatamente la larva a circa 2/3 della lunghezza del corpo posteriormente alla testa. Con il secondo paio di pinze, afferra i ganci larvali per la bocca e tirali via dal corpo. Usando una pinza, districare i ganci della bocca dalla cuticola sovrapposta e dal tessuto estraneo come le ghiandole salivari e il corpo grasso.

In alternativa, per preparare il complesso cervello-disco occhio-antenna, mantenendo intatto il cordone nervoso ventrale, utilizzare una pinza per tagliare una larva al centro del corpo. Scartare la metà posteriore. Tenere la metà anteriore del corpo larvale con le punte di un paio di pinze, quindi capovolgere la larva spingendo i ganci della bocca verso l'interno con la punta del secondo paio e facendo rotolare la cuticola su di essa con il primo paio di pinze.

Rimuovere con cura tutto il tessuto estraneo, compreso l'intestino, il corpo adiposo e le ghiandole salivari. Tirare delicatamente i ganci per la bocca lontano dalla cuticola. Rilascia il complesso cervello-disco occhio-antenna attaccato ai ganci della bocca recidendo le proiezioni assonali che si estendono dal cordone nervoso ventrale ai muscoli e all'epidermide.

Per trasferire il tessuto, rivestire prima un puntale per micropipetta P20 pipettando più volte le carcasse corporee rimanenti su e giù, quindi utilizzare lo stesso puntale per trasferire il tessuto sezionato. Per trasferire complessi cervellonici occhio-disco antennale più grandi, pre-tagliare la punta P20 per allargare l'apertura. Fissare i campioni in 400 micro-litri di fissativo PFA al 4% per 25 minuti a temperatura ambiente durante la nutazione.

Quindi rimuovere il fissativo e lavare i campioni con PBST tre volte per 10 minuti con nutazione. Sostituire quindi il PBST con 500 micro-litri di soluzione colorante DAPI e nutato per 15 minuti al buio. Lavare il fazzoletto una volta per 10 minuti con PBST.

Per completare la dissezione, utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire nuovamente il tessuto in un piatto di vetro riempito di PBS. Utilizzando due paia di pinze, separare il cervello da utilizzare per la quantificazione dell'invasività dai dischi occhio-antennali tagliando i gambi ottici. Libera i dischi occhio-antennali tagliandoli dai ganci della bocca.

Posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino abduttivo e con una pinza distribuire il liquido in uno strato sottile. Per quantificare l'invasività, posizionare almeno 80 cervelli fissi e intatti per ogni genotipo su un singolo vetrino. Raddrizzare e posizionare il fazzoletto come desiderato.

Toccare delicatamente un bordo di un vetrino coprioggetti con il mezzo e abbassarlo lentamente con l'aiuto di una pinza per evitare di creare bolle. Utilizzare una salvietta da laboratorio per assorbire il mezzo di montaggio in eccesso ai bordi. Il tessuto può ora essere esaminato utilizzando l'imaging confocale.

Chiedi a una parte neutrale di rendere anonime le diapositive in modo che il punteggio sia imparziale. E far valutare i vetrini in modo indipendente da almeno due ricercatori. Rivelare i genotipi solo dopo che il punteggio è completo.

Valutare il grado di malignità con uno stereomicroscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri GFP. Utilizzando un marcatore di etichette cervelli che sono già stati visualizzati per evitare il doppio conteggio. Le immagini confocali fluorescenti mostrano cervelli sezionati da larve portatrici di tumori clonali maligni RAS V12 marcati con GFP con mutante scarabocchio maligno colorati con DAPI.

I pannelli rappresentano i quattro diversi gradi di invasività tumorale. La quantificazione imparziale ha rivelato che l'inibizione della segnalazione JNK e RAS V12 ha scarabocchiato un clone ha soppresso l'invasività del tumore. Nei dischi occhio-antennali di controllo, il reporter TRE-DsRED sensibile a JNK etichetta solo una stretta striscia di cellule che va dall'antenna alla parte dell'occhio.

Al contrario, l'attività di TRE-DsRED è risultata marcatamente aumentata nei tumori clonali maligni GFP-positivi. Entro l'ottavo giorno le cellule tumorali sono cresciute eccessivamente sui dischi oculari-antennali e si sono diffuse al cordone nervoso ventrale. Le cellule tumorali invasive hanno anche mostrato una maggiore attivazione di JNK rispetto al tessuto circostante.

Mentre il blocco di JNK ha chiaramente ridotto l'attività di TRE-DsRED nei cloni tumorali, l'aumento dell'intensità del laser ha rivelato un miglioramento nelle cellule epiteliali vicine ai cloni. Inoltre, un reporter DsRED con emoectina delta ha dimostrato che, a differenza di alcuni cluster di emociti trovati nelle rientranze dell'occhio di controllo, gli emociti dell'epitelio occhio-antennale si accumulano nel tessuto occhio-antennale e cerebrale composto da tumori maligni. Dopo l'inibizione di JNK, il numero di cellule immunitarie associate è diminuito drasticamente.

L'aumentata invasività tumorale, l'attività di JNK e l'infiltrazione degli emociti sono state accompagnate da una significativa sovraregolazione dell'mNRA di MMP1 come determinato da QRTPCR utilizzando RNA totale isolato da dischi occhio-antennali a mosaico sezionati. Una volta padroneggiati, oltre 60 coppie di dischi oculari e i cervelli possono essere sezionati in 30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di generare un numero sufficiente di larve dei genotipi desiderati.

Sii veloce ma preciso durante la dissezione per mantenere i campioni destinati all'isolamento dell'RNA privi di RNS. Dopo la procedura di dissezione, il western blot può essere utilizzato come alternativa all'immunocolorazione per valutare i cambiamenti nell'espressione proteica tra diversi genotipi. La creazione di mosaici genetici e la loro analisi con le procedure descritte consente la ricerca su mutazioni altrimenti letali e sui meccanismi di corporazione oncogenica e Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come sezionare i tessuti a mosaico del disco oculare-antennale e del cervello da larve di terzo stadio e come elaborarli per l'immunocolorazione, la visualizzazione dell'attività transgenica e di porta, Estrazione dell'RNA e quantificazione dell'invasività.

Si ricorda che il PFA, il fenolo-cloroformio e il DAPI sono altamente tossici e che precauzioni come indossare guanti e indumenti protettivi devono essere sempre prese quando si lavora con questi agenti.