Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter
17 settembre 2016
L'orologio circadiano regola circa un terzo del trascrittoma di Arabidopsis, ma la percentuale di geni che alimentano di nuovo nel cronometraggio rimane sconosciuto. Qui visualizziamo un metodo per valutare rapidamente fenotipi circadiani in qualsiasi linea mutante di Arabidopsis utilizzando immagini luminescenti di un reporter circadiano transitoriamente espresso in protoplasti.
L'obiettivo generale di questo saggio è determinare il periodo circadiano in linee di Arabidopsis misurando la luminescenza emessa da protoplasti trasfettati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia circadiana, ad esempio quali geni retroagiscono sul meccanismo di regolazione del tempo stesso. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi rapida del periodo circadiano di qualsiasi mutante di Arabidopsis, senza la necessità di generare linee transgeniche stabili.
Per iniziare questa procedura, etichettare una piastra di Petri e aggiungervi 10 millilitri di soluzione enzimatica filtrata e sterilizzata. Fissare quattro strisce di nastro per autoclave con il lato adesivo rivolto verso l'alto su una superficie pulita del laboratorio e segnare sulle strisce le dimensioni della piastra di Petri. Raccogliere le piante dalla stanza di crescita.
Tagliare le foglie di piante di quattro settimane e premere l'epidermide superiore sul nastro per autoclave, in modo che la superficie epidermica inferiore sia rivolta verso l'alto. Applicare strisce di nastro adesivo magico sulla superficie epidermica inferiore. Utilizzando un tubo conico da 15 millilitri, premere delicatamente le strisce sulle foglie, avendo cura di non schiacciare il tessuto fogliare.
Staccare con attenzione il nastro per rimuovere l'epidermide inferiore ed esporre le cellule del mesofillo. Successivamente, tagliare il nastro autoclavabile in modo che si adatti alla piastra di Petri e utilizzare pinzette per trasferire il nastro nella piastra, facendolo galleggiare sulla soluzione enzimatica con le foglie rivolte verso il basso. Incubare a 60 giri al minuto su un agitatore orbitale per 60 minuti, periodo durante il quale i protoplasti verranno rilasciati nella soluzione.
Dopo 60 minuti, utilizzare pinzette per rimuovere e scartare le strisce di nastro per autoclave. Utilizzando una punta per pipetta a largo foro, trasferire la soluzione contenente i protoplasti in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare i protoplasti a 100 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con attenzione il soprannatante, poiché il pellet è molto fragile.
Aggiungere 10 millilitri di soluzione W5 ai protoplasti e risospendere delicatamente ruotando il tubo. Prelevare un'aliquote di protoplasti per il conteggio. Mantenere i protoplasti sul ghiaccio per 30-60 minuti.
Mentre i protoplasti sono sul ghiaccio, valutare il rendimento contando i protoplasti in un emocitometro. Raccogliere i protoplasti mediante centrifugazione a 100 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione il soprannatante, poiché il pellet è molto lento.
Infine, risospendere i protoplasti nella soluzione MMg fino a una concentrazione di 500.000 protoplasti per millilitro. Iniziare la procedura di trasfezione dei protoplasti aggiungendo dieci microlitri di plasmide reporter in un tubo conico da 15 millilitri, seguiti da 400 microlitri di protoplasti. Aggiungere un volume di polietilene glicole, o soluzione PEG, e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo 12 volte per trasfettare i protoplasti.
Incubare per otto-quindici minuti a temperatura ambiente. I protoplasti devono essere incubati per un tempo sufficiente a garantire una trasfezione efficiente, ma non troppo a lungo per evitare una riduzione della loro vitalità. Successivamente, diluire la miscela di DNA-PEG dei protoplasti con quattro volumi di soluzione W5 e mescolare capovolgendo delicatamente sei volte.
Centrifugare i protoplasti trasfettati a 100 g per due minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante con una pipetta, avendo nuovamente molta cura poiché il pellet è molto fragile. Risospendere i protoplasti in 1.250 microlitri di soluzione per imaging.
I protoplasti dovrebbero risospendersi abbastanza facilmente, indicando che sono integri dopo la trasfezione. Aliquotare 200 microlitri per pozzetto in sei pozzetti replicati di una piastra a 96 pozzetti e riempire eventuali pozzetti vuoti con soluzione W5. Sigillare la piastra con un coperchio adesivo trasparente adatto all'immagine luminiscente.
Per acquisire le immagini dei protoplasti, trasferire la piastra a 96 pozzetti su un qualsiasi sistema di imaging luminiscente adatto all'analisi di piante. Sostituire il coperchio adesivo della piastra da 10 a 15 minuti dopo il trasferimento per evitare condensa e differenze di pressione tra i pozzetti. Iniziare l'acquisizione delle immagini.
Leggere la piastra ogni 45 minuti per cinque giorni a temperatura ambiente. Successivamente, analizzare i risultati di luminescenza utilizzando un qualsiasi software di analisi, ad esempio il Biological Rhythms Analysis Software System. I protoplasti del mesofillo isolati con questo protocollo sono mostrati in questa immagine a un ingrandimento di 200 volte.
I protoplasti di arabidopsis di tipo selvaggio e del mutante cca1/lhy sono stati trasfettati e analizzati in luce costante mediante un lettore di piastre per cinque giorni. Come previsto, il periodo libero dell'espressione genica controllata dal ritmo circadiano è accorciato in questo mutante. Al contrario, il periodo delle oscillazioni circadiane nei protoplasti del mutante ztl è allungato.
Nei protoplasti che sovraesprimono CCA1, non si sono osservate oscillazioni nell'espressione del costrutto reporter poiché la sovraespressione di CCA1 porta all'aritmia. Questo grafico a barre mostra le stime del periodo circadiano basate sui tracciati di luminescenza nei protoplasti di tipo selvatico e nei mutanti del clock. Questi periodi circadiani sono coerenti con i dati pubblicati ottenuti da piante intere mediante approcci transgenici che richiedono molto tempo.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante utilizzare piante sane e manipolare i protoplasti con cura poiché sono fragili. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare, trasfettare e osservare al microscopio i protoplasti di Arabidopsis.
Queste tecniche possono ora essere applicate a qualsiasi linea mutante, oppure essere modificate per ottenere immagini di protoplasti di altre specie vegetali.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per la valutazione di fenotipi circadiani in Arabidopsis mediante imaging luminescente di protoplasti. La tecnica consente un'analisi rapida dei periodi circadiani in diverse linee mutanti, senza la necessità di linee transgeniche stabili.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia circadiana
- Fisiologia vegetale
- Analisi genetica
Sfondo
- L'orologio circadiano influenza una porzione significativa del trascrittoma di Arabidopsis.
- Comprendere quali geni contribuiscono alla regolazione del tempo è fondamentale per la biologia circadiana.
- I metodi tradizionali richiedono linee transgeniche stabili, la cui creazione richiede molto tempo.
- Questo nuovo metodo semplifica il processo utilizzando reporter circadiani espressi in modo transitorio.
Scopo dello studio
- Determinare il periodo circadiano in linee di Arabidopsis.
- Identificare i geni che agiscono in retroazione sul meccanismo di regolazione del tempo circadiano.
- Fornire un metodo rapido ed efficiente per analizzare i ritmi circadiani in linee mutanti.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di protoplasti del mesofillo da foglie di Arabidopsis.
- Trasfezione dei protoplasti con un reporter luminiscente del ritmo circadiano.
- Misurazione della luminiscenza per valutare i ritmi circadiani.
- Analisi dei dati di luminiscenza mediante software specializzato.
Risultati Principali
- Dimostrata la capacità di misurare i periodi circadiani in diversi mutanti di Arabidopsis.
- Confermato che il mutante cca1/lhy presenta un periodo libero più breve.
- Mostrato che il mutante ztl ha un periodo di oscillazione circadiana più lungo.
- Validato il metodo rispetto agli approcci transgenici tradizionali.
Conclusioni
- Questo metodo consente una valutazione rapida dei ritmi circadiani in Arabidopsis.
- Può essere applicato a qualsiasi linea mutante, potenziando la ricerca in biologia circadiana.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altre specie vegetali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La fenotipizzazione rapida della funzione dell'orologio circadiano in protoplasti di Arabidopsis mediante reporter luminescenti consente una validazione accelerata delle proteine bersaglio e una riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca e sviluppo in biologia vegetale. Questo approccio semplifica la valutazione delle perturbazioni genetiche sulla regolazione circadiana, fornendo una maggiore affidabilità predittiva nei primi punti critici della scoperta. La flessibilità del metodo permette schermate su un ampio portfolio senza l'ingorgo legato alla generazione di linee transgeniche stabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta della funzione genica nella regolazione circadiana mediante saggi transitori con reporter.
- Facilita la riduzione rapida dei rischi biologici distinguendo i mutanti con fenotipi del ritmo circadiano alterati.
- Supporta la previsione affidabile nella selezione dei bersagli fornendo misurazioni quantitative del periodo.
- Accelera il triage del portafoglio consentendo lo screening ad alto rendimento di mutanti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi basati su protoplasti validati per flussi di lavoro di genomica funzionale a valle.
- Fornisce letture luminiscenti standardizzate e riproducibili per lo sviluppo di saggi quantitativi.
- Consente lo screening su larga scala di diversi background genetici senza trasformazione stabile.
- Supporta una valutazione affidabile delle perturbazioni geniche in un ambiente controllato.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori collegando la funzione genica agli output circadiani.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica nei sistemi vegetali.
- Riduce il rischio nell'avanzamento dei candidati confermando l'impatto meccanicistico sulla funzione del clock.
- Offre una previsione di riduzione del rischio per caratteri rilevanti per la produttività agricola.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio luminiscente con protoplasti si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, consentendo test rapidi delle ipotesi e schermature funzionali prima di intraprendere lavori transgenici più dispendiosi in termini di risorse.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi della funzione genica nella regolazione circadiana.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili di luminescenza per analisi comparative.
- Analisi: Genera output in serie temporali adatti alla stima statistica del periodo e alla classificazione dei fenotipi.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica in modelli vegetali.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per diversi sfondi mutanti e di specie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro di fenotipizzazione standardizzati, scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di tipo go/no-go e migliora l'efficienza del capitale nella fase iniziale della ricerca e sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo dei bersagli genetici con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di protoplasti, nella trasfezione e nell'analisi con immagini luminescenti.
- Necessita dell'accesso a lettori di luminescenza basati su piastre e a software di analisi compatibili.
- Richiede una manipolazione accurata e una standardizzazione per garantire la vitalità dei protoplasti e la qualità dei dati.
- Adattabile ad altre specie vegetali con un'ottimizzazione del protocollo.
- Limitato dalla natura transitoria dell'espressione del reporter e dalla stabilità dei protoplasti.
