Name: Un sensore polianilina a base di acidi nucleici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri la sintesi di polianilina dispersa in acqua per la rilevazione senza marcatori di acidi nucleici. Questo metodo economico e sensibile consente di distinguere differenze di singoli nucleotidi senza manipolazione enzimatica.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

1. Processabile PANI Sintesi <ol><li> Sciogliere anilina (1 ml, 11 mmol) completamente in 60 ml di cloroformio in 250 ml pallone a fondo rotondo. Mescolare a 600 rpm per 5 minuti e raffreddare a 0-5 ° C con ghiaccio. Questo richiede di solito 15-20 minuti (Figura 2A). </li><li> Aggiungere sodio dodecil benzene solfonato (NaDBS) (7,44 g, 21 mmoli) alla soluzione di anilina in un pallone a fondo rotondo sotto agitazione a 600 rpm. </li><li> Sciogliere ammonio persolfato (APS) (3.072 g, 13,5 mmol) in 20 ml di acqua e aggiungere tutto questo goccia a goccia nel corso di 30 minuti per evitare il surriscaldamento della reazione. </li><li> Effettuare la reazione a 0-5 ° C per 24 ore, e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per un altro 24 ore. </li><li> Osservare la miscela di reazione inizialmente girare bianco latte dopo 15 min, marrone scuro poi, dopo 2 ore, e, infine, al verde scuro dopo 24 ore (Figura 2B-F). </li><li> Filtrare la soluzione PANI-NaDBS con un imbuto di Buchner. Mescolare con 80 ml di cloroformio e 120 ml di acqua comeeparation imbuto (Figura 2G). </li><li> Incubare la soluzione per 24 ore a temperatura ambiente e raccogliere il PANI verde scuro dalla imbuto separatore, lasciando NaDBS reagiti e APS nel surnatante acquoso. </li></ol> 2. miscelazione PANI-sonda e irradiazione UV <ol><li> Diluire soluzione PANI 10x con cloroformio-acqua (1: 3 v / v) e miscelare 200 ml di PANI diluito con 6,4 micromol di sonde oligonucleotidi di DNA mediante dolce dondolio per 15 minuti in una provetta per microcentrifuga. </li><li> Irradiare la soluzione PANI-DNA con 1.200 μJ / cm 2 di UV in un reticolante per 2 min. È fondamentale che l&#39;esposizione UV è limitata all&#39;importo indicato. L&#39;esposizione prolungata ai raggi UV compromette la variazione di fluorescenza in PANI, probabilmente a causa di cross-linking covalente di Pani e il DNA. </li><li> complessi di pellet per centrifugazione a 17.000 xg per 6 minuti, e lavare con tampone fosfato (PBS). Pellet di nuovo, e risospendere in PBS. </li></ol> 3. Hybridization di PANI-probe <ol><li> Aggiungere 8 ml di 100 micron oligonucleotidi di DNA complementare o indirizzare gli acidi nucleici per 200 ml di complessi PANI-sonda. </li><li> Eseguire ibridazione dondolo miscela soluzione per 15 min a 40 ° C. </li><li> Pellet i complessi PANI per centrifugazione a 17.000 xg per 6 min. Lavare con PBS e risospendere in acqua. </li></ol> 4. Emissione costante di misura Stato fluorescenza <ol><li> Aggiungere PANI da diversi trattamenti in una micropiastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza emissione nel campo 270-850 nm per eccitazione a 250 nm. Un picco di emissione per PANI deve osservare circa 500 nm. </li></ol> 5. microscopia a fluorescenza Misura della ibridato Duplex <ol><li> Goccia cappotto PANI su un vetrino di vetro borosilicato e asciutto a 40 ° C per 48 ore. </li><li> Aggiungere sonda (8 ml di 100 mM) su un film PANI essiccato e irradiare con luce UV (1.200 μJ / cm 2 </sup&gt;) per 2 min. </li><li> Lavare il film PANI-sonda con PBS e asciugare a 40 ° C per 48 ore. </li><li> Eseguire ibridazione per 15 minuti con l&#39;aggiunta di acidi nucleici bersaglio. Questo potrebbe essere un campione biologico o un oligonucleotide destinazione di controllo (8 ml di 100 mM). Seguire con un lavaggio PBS. </li><li> Ottenere le immagini fluorescenti a 40X di ingrandimento, con un filtro passaggio lungo 500 nm. </li></ol>

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</ol>

Il lavoro è stato sostenuto dal College of Science and Technology della University of Southern Mississippi e dal Mississippi College of Science and Technology e dal programma Mississippi INBRE (Award Number P204M103476 dal National Institute of General Medical Science).

Un sensore PANI basata su acidi nucleici richiede la solubilizzazione del polimero in acqua per interagire con il DNA e RNA. La dispersione di PANI in acqua è realizzato utilizzando tensioattivi, formando micelle come precedentemente riportato 8. Oltre alle NaDBS qui utilizzati altri tensioattivi anionici come dodecil estere dell&#39;acido 4-sulfophthalic, tensioattivi non ionici come nonilfenolo etossilato, o tensioattivi cationici come bromuro di ammonio cetyltrimethyl potrebbero anche essere utilizzati per...

I polimeri coniugati offrono molte opzioni per i sensori molecolari. Ciò include le risposte a fluorescenza, elettroniche e colorimetriche1. Ci sono stati molti sforzi per incorporare polimeri coniugati nei sensori di acidi nucleici. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi richiede un rilevamento secondario, limitando le opzioni di rilevamento2. Recentemente, abbiamo segnalato una piattaforma di sensori a base di polimero coniugato costruita su polianilina (PANI) che sfrutta le proprietà di questo polimero, creando un sistema label-free3. PANI è un polimero elettroattivo ampiamente coniugato con proprietà come la fluorescenza e la resistenza adatte per misurare i sistemi biologici4. Gli eccitoni all'interno della struttura non sono localizzati, portando alla mobilità della carica positiva tra le subunità monomeriche. Ciò fornisce un'impalcatura flessibile di cariche positive che possono interagire con la spina dorsale caricata negativamente del DNA5,6. È importante sottolineare che il DNA attaccato elettrostaticamente è orientato in modo tale che le basi azotate possano partecipare all'accoppiamento delle basi. L'associazione con il DNA altera le proprietà elettroniche del PANI, un effetto che può essere potenziato dall'irradiazione UV (Figura 1)3. Utilizzando questo sistema, gli oligonucleotidi complementari agli acidi nucleici bersaglio possono essere immobilizzati su PANI. Diversi studi hanno dimostrato che dopo l'ibridazione gli oligonucleotidi adsorbiti elettrostaticamente si dissociano da PANI o da altre matrici cationiche a causa di cambiamenti conformazionali causati dal passaggio a una struttura di DNA a doppio filamento3,5,7.
In un sistema di sensori in cui l'attacco della sonda modula le proprietà del polimero coniugato, gli eventi di ibridazione possono essere trasdotti senza etichette o modifiche enzimatiche delle sonde o degli acidi nucleici target. I polimeri coniugati offrono una grande flessibilità nei metodi di rilevamento, uno dei quali è la fluorescenza. Attraverso il monitoraggio della fluorescenza PANI, è possibile rilevare concentrazioni di acidi nucleici target fino a 10-11 M (10 pM)3. Il rilevamento è rapido, avviene entro 15 minuti dall'ibridazione ed è specifico quando è possibile differenziare un singolo disadattamento in una molecola bersaglio3. 
La fabbricazione dei sensori PANI è semplice. PANI ad alto peso molecolare può essere generato ben disperso in acqua utilizzando procedure di sintesi standard che coinvolgono monomero di anilina, tensioattivo e aggiunta controllata di un ossidante. La resa può essere molto elevata e l'ossidante non reagito può essere rimosso mediante lavaggio con acqua, garantendo che non vi sia ulteriore crescita di PANI. L'associazione PANI-sonda si verifica spontaneamente dopo la miscelazione e la formazione del complesso è migliorata da una lieve esposizione ai raggi UV. L'ibridazione può essere effettuata immediatamente e le variazioni della fluorescenza PANI possono essere analizzate dopo una breve incubazione. La semplicità di questa tecnologia la rende altamente accessibile a molti laboratori.

<table><tbody><tr><td>Anilina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A7401-500&nbsp;</td><td>ACS, liquido, refrigerato</td></tr><tr><td>Perossidisolfato di ammonio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A682-500&nbsp;</td><td>ACS, cristallino</td></tr><tr><td>Sodio dodecilbenzene solfonato</td><td>Pfaltz & Bauer</td><td>D56340&nbsp;</td><td>95% solido</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCX 10601&nbsp;</td><td>liquido</td></tr><tr><td>Primer DNA</td><td>Operone MWG</td><td>n/a</td><td>sequenza di DNA personalizzata ~20&nbsp; </td></tr><tr><td>bps Micropiastra&nbsp;</td><td>Stati Uniti Scientifici&nbsp;</td><td>1402-9800&nbsp;</td><td>96 pozzetti, polipropilene in quanto non reattivo al cloroformio</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva per micropiastre</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0000&nbsp;</td><td>Riduce la contaminazione da pozzetto a pozzetto, la fuoriuscita e l'evaporazione dei campioni</td></tr><tr><td>Vetro di copertura per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D&nbsp;</td><td>PANI rivestito su vetro di copertura irradiato UV</td></tr><tr><td>Reticolante UV&nbsp;</td><td>UVP&nbsp;</td><td>HL-2000&nbsp;</td><td>Energia: X100 &mu; J/cm2; Tempo: 2 min</td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>VWR</td><td>01014705 T</td><td>Temperatura: 400&nbsp; &#176; C; con oscillazione per 15 min</td></tr><tr><td>Apparecchio in vetro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pallone a fondo tondo a tre colli per reazione; imbuto di gocciolamento, tappi, condensatore, imbuto separatore</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica IMC S80</td><td>Ingrandimento 20X; Pseudo colore 536 nm; Esposizione 86 msec; Guadagno 1.0x; Gamma 1.6</td></tr><tr><td>Lettori di micropiastre</td><td>Dispositivi molecolari&nbsp;</td><td>Codice 89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

un sensore polianilina a base di acidi nucleici

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Il rilevamento degli acidi nucleici è al centro delle tecnologie diagnostiche utilizzate nella ricerca e nella clinica. Gli approcci standard utilizzati in queste tecnologie si basano su modifiche enzimatiche che possono introdurre distorsioni e artefatti. Un elemento critico delle piattaforme di rilevamento di prossima generazione sarà il rilevamento molecolare diretto, evitando così la necessità di amplificazione o marcature. I nanomateriali avanzati possono fornire le modalità chimiche adatte per realizzare sensori senza marcatura. I polimeri coniugati sono ideali per il rilevamento biologico, possiedono proprietà compatibili con le biomolecole e mostrano un'elevata sensibilità ai cambiamenti ambientali localizzati. In questo articolo, viene presentato un metodo per rilevare gli acidi nucleici utilizzando il polimero elettroconduttivo polianilina. Semplici oligonucleotidi "sonda" di DNA complementari agli acidi nucleici bersaglio sono attaccati elettrostaticamente al polimero, creando un sistema di sensori in grado di differenziare le differenze di singolo nucleotide nelle molecole bersaglio. Al di fuori della natura specifica e imparziale di questa tecnologia, è altamente conveniente.

Figura 2A cattura la configurazione reazione all&#39;inizio del processo di polimerizzazione, cioè prima APS aggiunta. Formazione di micelle è il primo passo nella reazione di sintesi avviene processo PANI all&#39;interfaccia micellare. La Figura 2B mostra una soluzione lattescente dopo 5 min. 30 min dopo APS è aggiunta la reazione si rivolge ad un colore leggermente marrone. Figura 2C mostra il cambiamento di colore associata a...

Gli acidi nucleici sono analiti comuni per la valutazione dei sistemi biologici; tuttavia, le distorsioni derivanti dalla manipolazione enzimatica possono causare preoccupazione. Qui viene descritto un metodo per la rilevazione senza marcatura di acidi nucleici utilizzando la polianilina. Questa tecnologia di sensori sensibile ed economica è in grado di distinguere le differenze di un singolo nucleotide tra le molecole.

Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare polianilina dispersa in acqua che possa essere utilizzata per rilevare acidi nucleici in modo privo di marcatura. Questa tecnica rappresenta un metodo economico per il rilevamento di acidi nucleici. I laboratori che la adottano la troveranno semplice, robusta e sensibile.Il principale vantaggio della tecnica è che è priva di marcatura e può essere utilizzata per rilevare direttamente RNA e DNA senza la necessità di manipolazioni enzimatiche. Questa tecnica ha potenzialità per nuove tecnologie diagnostiche e, poiché non utilizza un marcatore, può essere impiegata per l'elaborazione di campioni di pazienti con minima manipolazione. Una dimostrazione visiva contribuirà a chiarire il funzionamento del sensore.Questa piattaforma comprende la scienza dei polimeri e la biologia, che possono sembrare molto esotiche ma in realtà sono estremamente facili da implementare. Sciogliere completamente l'anilina in 60 ml di cloroformio in un pallone da 250 ml. Dopo aver agitato a 600 giri al minuto per cinque minuti, raffreddare a zero-cinque gradi Celsius con ghiaccio.Questo di solito richiede da 15 a 20 minuti. Successivamente, aggiungere il dodecilbenzensolfonato di sodio alla soluzione di anilina in un pallone a fondo rotondo sotto agitazione a 600 giri al minuto. Sciogliere il persolfato di ammonio in 20 ml di acqua e aggiungerlo goccia a goccia nell'arco di 30 minuti per evitare un surriscaldamento della reazione.Eseguire la reazione da zero a cinque gradi Celsius per 24 ore. Osservare la miscela di reazione diventare inizialmente di colore bianco latteo dopo 15 minuti, quindi marrone scuro dopo due ore e infine verde scuro dopo 24 ore. Successivamente, lasciarla raggiungere la temperatura ambiente per altre 24 ore.Filtrare la soluzione di PANI sodio dodecilbenzensolfonato con un imbuto di Büchner. Mescolare il filtrato con 80 ml di cloroformio e 120 ml di acqua in un imbuto separatore. Incubare la soluzione per 24 ore a temperatura ambiente, quindi raccogliere la PANI di colore verde scuro dall'imbuto separatore, lasciando il sodio dodecilbenzensolfonato non reagito e il PAS nel sopranatante acquoso.Diluire la soluzione di PANI 10 volte con acqua cloroformata, quindi mescolare 200 microlitri di PANI diluito con 6,4 micromoli di oligonucleotidi di DNA sonda agitando delicatamente per 15 minuti in un tubo da microcentrifuga. Irradiare la soluzione di DNA PANI con 1200 microjoule per centimetro quadrato di UV in un incrociatore per due minuti. È fondamentale che l'esposizione ai raggi UV sia limitata alla quantità indicata.L'esposizione prolungata ai raggi UV compromette il cambiamento di fluorescenza nel PANI, probabilmente a causa del legame covalente indesiderato tra PANI e DNA. Raccogliere i complessi in pellet mediante centrifugazione a 17.000 x g per sei minuti e lavare con soluzione salina tamponata al fosfato o PBS. Dopo aver effettuato una seconda centrifugazione, risospendere in PBS.Aggiungere otto microlitri di oligonucleotidi di DNA complementari o acidi nucleici bersaglio a 100 micromolari a 200 microlitri di complessi di sonde PANI. Eseguire l'ibridazione agitando delicatamente la miscela per 15 minuti a 40 gradi Celsius. Dopo la sedimentazione dei complessi PANI mediante centrifugazione a 17.000 x g per sei minuti, lavare con PBS e risospendere in acqua.Aggiungere il PANI proveniente da diversi trattamenti in una piastra microtiter a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza di emissione nell'intervallo da 270 a 850 nanometri eccitando a 250 nanometri. Si dovrebbe osservare un picco di emissione per il PANI intorno a 500 nanometri. Per effettuare la misurazione mediante microscopia a fluorescenza del duplex ibridato, depositare per gocciolamento il PANI su un coprioggetto in vetro borosilicato e asciugare a 40 gradi Celsius per 48 ore.Aggiungere otto microlitri di sonda a 100 micromolare su un film di PANI essiccato, quindi irradiarlo con luce UV per due minuti. Dopo l'irradiazione, lavare il film di sonda PANI con PBS ed essiccare a 40 gradi Celsius per 48 ore. Eseguire l'ibridazione per 15 minuti aggiungendo acidi nucleici bersaglio.Questo potrebbe essere un campione biologico o un oligonucleotide bersaglio controllato. Procedere con un lavaggio in PBS. Acquisire le immagini fluorescenti a 40x di ingrandimento utilizzando un filtro passa-lungo a 500 nanometri.Qui è mostrata l'interazione elettrostatica tra PANI e sonde di DNA potenziata dall'irradiazione UV. L'ibridazione dell'acido nucleico bersaglio induce la formazione di un duplex, modificando la conformazione strutturale, con conseguente dissociazione della sonda bersaglio dalla superficie del PANI. Questa figura mostra la variazione della fluorescenza del PANI in assenza o in presenza della sonda, sia in soluzione che in un rivestimento solido.L'aumento della fluorescenza è dovuto al flusso di elettroni dal DNA carico negativamente, che aumenta la densità elettronica del polimero. A seguito dell'ibridazione con oligonucleotidi bersaglio complementari, le sonde si staccano, portando al ripristino della fluorescenza basilare. Al contrario, l'ibridazione con oligonucleotidi bersaglio con un singolo appaiamento errato non determina questo ripristino della fluorescenza basilare.La principale novità di questa tecnica consiste nell'utilizzo di raggi UV leggeri per un'interazione precisa, che in effetti aiuta a distinguere l'interazione non specifica da quella indotta dalla luce. Una volta padroneggiata, questa tecnica potrebbe richiedere fino a due ore, esclusi i tempi di esposizione e di essiccazione dei rivestimenti. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il DNA si scioglie in acqua e che il tè acido modifica effettivamente le proprietà elettroniche del PANI.Dopo aver visto questo video, gli spettatori dovrebbero avere una buona comprensione di come sintetizzare la polianilina dispersa in acqua e utilizzare le sue proprietà fluorescenti per rilevare gli acidi nucleici. Saranno in grado di immobilizzare le sonde di DNA ed eseguire l'ibridazione per rilevare le sequenze bersaglio. Lavorando con il monomero, è importante ricordare che questa sintesi è pericolosa e deve essere effettuata in una cappa con dispositivi di protezione come occhiali di sicurezza, guanti e camici da laboratorio.

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Presentiamo un protocollo per l'ingegnerizzazione della fase corona di nanotubi di carbonio fluorescenti a parete singola (SWNT) nel vicino infrarosso utilizzando polimeri anfifilici e DNA per sviluppare sensori per bersagli molecolari senza elementi di riconoscimento noti.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all'idrolisi di β-lattami.

L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Questo protocollo descrive la realizzazione di una cassetta piccola, ready-to-use che possa essere applicata per rilevamento visivo degli acidi nucleici multipli in un singolo, test che è facile da usare. In questo approccio, una matrice capillare è stata utilizzata per il rilevamento di multiplex e altamente efficiente di bersagli di OGM.

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Qui, segnaliamo il protocollo per la realizzazione di un sensore di pH micro di Nafion-rivestito, polyaniline-funzionalizzati, elettrochimicamente ridotta grafene ossido chemiresistive. Questo sensore a stato solido, basato su chemiresistor di pH micro in grado di rilevare variazioni di pH in tempo reale durante un processo di fermentazione di Lactococcus lactis .

Produzione di Nafion rivestite, ridotto grafene ossido/Polyaniline Chemiresistive sensore al pH Monitor in Real-Time durante la fermentazione microbica

Qui, descriviamo un protocollo per creare nanostrutture inorganiche discrete e accurate sui substrati utilizzando forme di origami di DNA come modelli guida. Il metodo è dimostrato dalla creazione di antenne plasmoniche a forma di papillon in oro su un substrato trasparente (sapphire).

Il nanopatterndifid antistrato DNA Mediato delle strutture inorganiche per applicazioni di rilevamento

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

Scopri la sintesi di polianilina dispersa in acqua per la rilevazione senza marcatori di acidi nucleici. Questo metodo economico e sensibile consente di distinguere differenze di singoli nucleotidi senza manipolazione enzimatica.

Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

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