Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare la polianilina dispersa in acqua che potrebbe essere utilizzata per rilevare gli acidi nucleici in modo privo di marcature. Questa tecnica è un metodo economico per rilevare gli acidi nucleici. I laboratori che lo adottano lo troveranno facile, robusto e sensibile.

Il vantaggio principale della tecnica è che è priva di marcatura e può essere utilizzata per rilevare direttamente RNA e DNA senza la necessità di manipolazione enzimatica. Questa tecnica ha un potenziale per le nuove tecnologie diagnostiche e, poiché non utilizza un'etichetta, può essere utilizzata per l'elaborazione di campioni di pazienti con poca manipolazione. La dimostrazione visiva aiuterà a demistificare il sensore.

Questa piattaforma include la scienza e la biologia dei polimeri, che sembrano molto esotiche ma in realtà sono straordinariamente facili da implementare. Sciogliere completamente l'anilina in 60 ml di cloroformio in un matraccio a fondo tondo da 250 ml. Dopo aver mescolato a 600 giri/min per cinque minuti, raffreddare a zero a cinque gradi Celsius con ghiaccio.

Questo di solito richiede dai 15 ai 20 minuti. Quindi, aggiungere il dodecilbenzensolfonato di sodio alla soluzione di anilina in un pallone a fondo tondo mescolando a 600 giri/min. Sciogliere il persolfato di ammonio in 20 ml di acqua e aggiungerlo goccia a goccia nell'arco di 30 minuti per evitare di surriscaldare la reazione.

Eseguire la reazione da zero a cinque gradi Celsius per 24 ore. Osservare la miscela di reazione che inizialmente diventa bianco latte dopo 15 minuti, poi marrone scuro dopo due ore e infine verde scuro dopo 24 ore. Quindi lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per altre 24 ore.

Filtrare la soluzione di dodecilbenzensolfonato di sodio PANI con un imbuto buchner. Miscelare il filtrato con 80 ml di cloroformio e 120 ml di acqua in un imbuto separatore. Incubare la soluzione per 24 ore a temperatura ambiente, quindi raccogliere il PANI verde scuro dall'imbuto di separazione, lasciando inalterato il dodecilbenzensulfonato di sodio e l'APS nel surnatante acquoso.

Diluire la soluzione di PANI 10 X con acqua cloroformio, quindi miscelare 200 microlitri di PANI diluito con 6,4 micromoli di oligonucleotidi DNA sonda facendo oscillare delicatamente per 15 minuti in una provetta per microfuge. Irradiare la soluzione di DNA PANI con 1200 microjoule per centimetro quadrato di UV in un reticolante per due minuti. È fondamentale che l'esposizione ai raggi UV sia limitata alla quantità indicata.

L'esposizione prolungata ai raggi UV compromette la variazione della fluorescenza nel PANI, probabilmente a causa della perdita incrociata covalente di PANI e DNA. Il pellet si complessa, per centrifugazione, a 17.000 x g per sei minuti e lavato con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Dopo aver pellettato una seconda volta, risospendere in PBS.

Aggiungi otto microlitri di oligonucleotidi di DNA complementari da 100 micromoli o acidi nucleici target a 200 microlitri di complessi di sonde PANI. Eseguire l'ibridazione facendo oscillare la miscela di soluzione per 15 minuti a 40 gradi Celsius. Dopo aver pellettato i complessi PANI mediante centrifugazione a 17.000 x g per sei minuti, lavare con PBS e risospendere in acqua.

Aggiungete PANI da diversi trattamenti in una micropiastra a 96 pozzetti e misurate la fluorescenza di emissione nell'intervallo da 270 a 850 nanometri mediante eccitazione a 250 nanometri. Un picco di emissione per PANI dovrebbe essere osservato intorno ai 500 nanometri. Per eseguire la misurazione al microscopio a fluorescenza del duplex iberdico, applicare PANI su un vetrino di vetro borosilicato e asciugare a 40 gradi Celsius per 48 ore.

Aggiungere otto microlitri di sonda da 100 micromoler su una pellicola PANI essiccata, quindi irradiarla con luce UV per due minuti. Dopo la radiazione, lavare la pellicola della sonda PANI con PBS e asciugare a 40 gradi Celsius per 48 ore. Eseguire l'ibridazione per 15 minuti aggiungendo acidi nucleici target.

Potrebbe trattarsi di un campione biologico o di un oligonucleotide bersaglio controllato. Seguire con un lavaggio PBS. Ottieni le immagini fluorescenti con un ingrandimento di 40x con un filtro passa lungo da 500 nanometri.

Qui è mostrata l'interazione elettrostatica delle sonde PANI e DNA potenziata dall'irradiazione UV. L'ibridazione dell'acido nucleico bersaglio innesca la formazione di duplex, modificando la conferma strutturale, che si traduce nella dissociazione del bersaglio della sonda dalla superficie PANI. Questa figura mostra la variazione della fluorescenza PANI in assenza o presenza di sonda, sia in soluzione che in mezzo di rivestimento solido.

L'aumento della fluorescenza è dovuto al flusso di elettroni dal DNA caricato negativamente, aumentando la densità elettronica del polimero. Dopo l'ibridazione di oligonucleotidi bersaglio complementari, le sonde si staccano, portando al ripristino della fluorescenza del basilico. Al contrario, l'ibridazione con singoli oligonucleotidi bersaglio non corrispondenti non porta a questo ripristino della fluorescenza del basilico.

La principale novità di questa tecnica è che utilizza l'UV delicato per un'interazione esatta e che in realtà lo aiuta a distinguere l'interazione non specifica e quella della luce. Una volta padroneggiata, questa tecnica potrebbe richiedere fino a due ore escludendo il tempo dei sensi e il tempo di asciugatura dei rivestimenti. Mentre si prova questa procedura, è importante ricordare che il DNA si dissolve in acqua e il tè acido cambia effettivamente la proprietà elettronica del PANI.

Dopo aver visto questo video, gli spettatori dovrebbero avere una buona comprensione di come sintetizzare la polianilina dispersa in acqua e utilizzare le sue proprietà fluorescenti per rilevare gli acidi nucleici. Saranno in grado di immobilizzare i DNA della sonda ed eseguire l'ibridazione per rilevare i bersagli. Lavorando con il monomero, è importante ricordare che questa sintesi è pericolosa e dovrebbe essere eseguita in un cappuccio con i dispositivi di protezione come occhiali di sicurezza, guanti e camici da laboratorio.