Name: Lisolamento e lattivazione di linfociti murini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Impara a purificare linfociti murini con microsfere magnetiche anti-CD43 per studiare le capacità funzionali cellulari in vitro e in vivo. Questo metodo consente analisi comparative tra linfociti di controllo e geneticamente modificati.

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Lo studio è sostenuto dal Ministero della Pubblica Istruzione, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 e Tier2-MOE2013-T2-2-038). Il manoscritto è stato curato da Amy Sullivan da Obrizus Communications.

Tutti i topi sono allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni e tutti i protocolli del mouse sono condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e uso istituzionale degli animali. 1. Preparazione di tamponi e reagenti <ol><li> Preparare completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (siero 10% inattivato al calore bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 UI / ml) / streptomicina (100 mcg / ml), 55 mM 2-mercaptoetanolo ). </li><li> Preparare 20x soluzione salina bilanciata (BSS) 1 Stock e della 2, separatamente. <ol><li> Preparare 20x BSS magazzino 1 (111 mm destrosio, potassio fosfato 8,8 mm, 26,7 mM sodio fosfato bibasico in 1 L di acqua sterile) e aggiungere 40 ml di 0,5% rosso fenolo a 20x BSS giacenza 1 prima della messa a punto finale del volume. filtro sterile con 0,2 micron filtro prima di riporre a 4 ° C. </li><li> Preparare 20x BSS magazzino 2 (25.8 mM cloruro di calcio diidrato, cloruro di potassio 107 mM, ch 2,73 M di sodioLoride, 19.6 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 16,6 mM solfato di magnesio in 1 L di acqua sterile). filtro sterile con 0,2 micron filtro prima di riporre a 4 ° C. </li><li> Per preparare 1x BSS per uso sperimentale, diluire 50 ml di BSS magazzino 1 e 50 ml BSS magazzino 2, separatamente, in 400 ml di acqua sterile ciascuno. Combinare entrambe le soluzioni diluite, regolare a pH 7, e aggiungere 20 ml di FBS (2%). Top fino a 1 L con acqua sterile e filtro sterile con 0,2 micron filtro. NOTA: soluzioni madri BSS devono essere preparati separatamente perché la miscelazione delle scorte BSS concentrati direttamente può provocare precipitazioni. </li></ol></li><li> Globuli rossi (RBC) Lysis Buffer <ol><li> Per preparare tampone di lisi RBC, mescolare 9 parti magazzino cloruro di ammonio (155 mm cloruro di ammonio in acqua sterile) e 1 parte di magazzino Tris-base (130 mm Tris (idrossimetil) aminomethane in acqua sterile, pH 7,65) prima dell&#39;uso. NOTA: Conservare soluzioni madre sterili di cloruro di ammonio e Tris-base a 4 ° C. Preparare lisi BUffer fresco per garantire efficiente lisi dei globuli rossi. </li></ol></li></ol> 2. Generazione di linfociti sospensione dalla milza o linfonodi NOTA: E &#39;importante preparare tutti i reagenti e le attrezzature necessarie per l&#39;esperimento prima che l&#39;eutanasia del mouse e di generare sospensioni singola cella di linfociti nel più breve tempo possibile mantenere alti Viabilità cellulari. <ol><li> Eutanasia del mouse sperimentale di dislocazione cervicale o CO 2 asfissia. NOTA: Da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in modo asettico. </li><li> Immergere l&#39;intero del mouse in etanolo al 70% prima di effettuare qualsiasi incisioni. Rimuovere la milza e linfonodi asettico 8, e metterli in separati da 15 ml provette contenenti 5 ml di ghiacciata RPMI / FBS (RPMI con il 2% FBS) o BSS / FBS (dal punto 1.2.3). NOTA: Dal momento che BSS impedisce efficiente lisi RBC, usare RPMI per la preparazione della sospensione cellulare della milza e passare a BSS after RBC lisi. </li><li> Per generare una sospensione singola cella da milza o linfonodi, posizionare l&#39;organo (s) tra due pezzi di sterile 100 mesh filtro micron delle cellule in una capsula di Petri contenente 2 ml di ghiacciata RPMI / FBS o BSS / FBS. Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 ml, schiacciare l&#39;organo (s) finché non è stato strappato in parti molto fini. </li><li> Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml e lavare il filtro cella di maglia con ghiacciata RPMI / FBS o BSS / FBS. Raccogliere la sospensione cellulare residua, aggiungerlo alla stessa tubo da 15 ml, e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. NOTA: risospendere le cellule in pellet muovendo il tubo con le dita prima di aggiungere buffer di lisi RBC o medio nelle fasi successive. </li><li> Preparare temperatura ambiente tampone di lisi (RT) RBC durante la centrifugazione della sospensione cellulare (vedi passo 1.3.). Dopo pellet cellule e rimuovere il surnatante, risospendere le cellule con 1 ml di tampone di lisi RBC per ogni 10 8 cellule. Incubate la reazione di lisi a temperatura ambiente per 3-4 min. </li><li> Smettere di RBC lisi con 14 ml di BSS ghiacciata / FBS e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li></ol> 3. Purificazione di B e le cellule T <ol><li> Purificazione di cellule B <ol><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Risospendere fino a 10 8 cellule della milza in 300 ml BSS / FBS e aggiungere 50 ml di anti-CD43 microsfere magnetiche 9,10. Per rimuovere le cellule morte, aggiungere 30 ml annessina V sfere magnetiche. Incubare la sospensione cellulare in frigorifero a 4 ° C per 30 min. </li></ol></li><li> Purificazione di cellule T <ol><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Risospendere fino a 10 8 cellule in non-T anticorpi deplezione delle cellule cocktail (anticorpi biotinilati contro CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 e CD4 o CD8 seconda popolazione di cellule bersaglio per essere purificato), diluito 1: 200 in 200 ml BSS / FBS 4,5. Incubare la sospensione cellulare in un4 ° C frigorifero per 15 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 10 ml BSS / FBS per lavare le cellule e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 165 microlitri BSS / FBS con 30 microlitri microsfere streptavidina e 15 microlitri annessina V sfere magnetiche. Incubare la sospensione cellulare in frigorifero a 4 ° C per 30 min. NOTA: per garantire anche l&#39;etichettatura con le microsfere magnetiche, incubare le cellule con microsfere per 15 minuti, poi mescolare la sospensione cellulare con delicatezza toccando il tubo da 15 ml e incubare un altro 15 minuti durante la fase 3.1.1. o 3.2.2. </li></ol></li><li> Preparazione di separazione colonna per Cell Purificazione <ol><li> Preparare una colonna di separazione non utilizzata durante l&#39;etichettatura microperla delle cellule (fase 3.1.1. E 3.2.2.). Pre-caldo BSS (senza FBS) per RT e utilizzare 2 ml per lavare ed equilibrare la colonna in modo asettico. Dopo equilibrio con BSS, la colonna lavato non dovrebbe essere permesso di asciugare. NOTA: Usiamo i LS column invece della colonna LD consigliato a causa della sua riutilizzabilità (vedi punto 3.4.). </li><li> Dopo l&#39;etichettatura con le sfere magnetiche, aggiungere 14 ml BSS / FBS per lavare le cellule e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1-3 ml di RT BSS. </li><li> Attaccare sterile 21 ago G alla punta della colonna di ridurre la portata durante il processo di purificazione. Caricare la sospensione cellulare sulla colonna equilibrata e raccogliere il flusso attraverso contenente cellule bersaglio purificate. NOTA: evitare l&#39;introduzione di bolle nella colonna durante il caricamento. </li><li> Lavare la colonna una volta con 1 ml BSS / FBS e raccogliere il flusso attraverso contenente le cellule bersaglio purificate. Ricarica la colonna con il flusso attraverso nuovamente. Raccogliere il flusso attraverso dopo il secondo carico nello stesso tubo 15 ml. </li><li> Lavare la colonna 3 volte con 1 ml BSS / FBS e raccogliere il flusso attraverso contenente le cellule bersaglio purificate. Successivamente, aggiungere 5 ml BSS / FBS a the colonna e, con stantuffo, lavare le cellule marcate magneticamente su colonna in un nuovo tubo 15 ml. </li><li> Controllare la purezza delle cellule raccolte mediante citometria di flusso utilizzando anticorpi che si legano alla superficie antigeni di B purificati o cellule T 4,5. </li></ol></li><li> Riutilizzare la colonna di separazione NOTA: La colonna LS può essere riutilizzato fino a 4 volte senza compromettere l&#39;efficienza di purificazione. <ol><li> Lavare la colonna 3 volte con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) e 3 volte con 5 ml di acqua distillata dall&#39;alto con il pistone. </li><li> Lavare la colonna con 5 ml di etanolo al 70% e asciugare la colonna ampiamente utilizzando un rubinetto dell&#39;aria per evitare la formazione di ruggine nella colonna. </li><li> Per preparare una colonna LS utilizzato per un esperimento di purificazione separata, lavare la colonna dal basso verso l&#39;alto con 5 ml di etanolo al 70% utilizzando l&#39;adattatore siringa. Successivamente, lavare la colonna dal basso verso l&#39;alto due volte con 5 ml di PBS sterile, seguiti da 5 ml di PBS volta dalla sommità della colonna. Aggiungere 2ml RT BSS per equilibrare la colonna e quindi procedere al caricamento la colonna con cellule marcate. </li></ol></li></ol> 4. CFSE Etichettatura e stimolazione NOTA: Purified cellule possono essere sottoposte ad una varietà di in vitro e in vivo saggi funzionali. Qui, usiamo le cellule T purificate per determinare la capacità di stimolazione delle cellule T di APC 5. <ol><li> soluzione Pre-caldo etichettatura (0,1% FBS in PBS) per 37 ° C prima del CFSE carico. NOTA: l&#39;utilizzo di una bassa percentuale di FBS in PBS riduce la morte delle cellule durante CFSE carico e riduce al minimo la perdita di cellule durante la centrifugazione. Tuttavia, troppo FBS possono interferire con CFSE carico. </li><li> Lavare le cellule due volte con purificate soluzione di etichettatura, poi ri-sospese a 2 x 10 7 cellule / ml in soluzione di etichettatura pre-riscaldato in una provetta da 15 ml. </li><li> Preparare 10 soluzione CFSE mM (1: 500 diluizione di 5 mm CFSE soluzione madre) in soluzione di etichettatura pre-riscaldato. soluzione CFSE dovrebbeessere preparato fresco ogni volta per ottenere l&#39;etichettatura ottimale. </li><li> Per caricare cellule con CFSE, aggiungere sospensione cellulare 1 parte a 1 parte 10 mM soluzione CFSE in una provetta da 15 ml e incubare al buio per 10 minuti a 37 ° C. Una concentrazione finale di 5 mM CFSE viene utilizzato per etichettare 1 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Invertire il tubo ogni 2 minuti per assicurare una miscela omogenea di cellule durante CFSE carico. </li><li> Per arrestare la reazione, aggiungere diversi volumi di medie RPMI completo ghiacciata e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Al successo CFSE di carico, il pellet cellulare apparirà giallastro. </li><li> Lavare CFSE caricato cellule una volta con RPMI completo ghiacciata e spin giù a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C prima dell&#39;uso per la coltura in vitro o in vivo di stimolazione. </li></ol> 5. In Vitro Stimolazione <ol><li> Preparare una soluzione 2x magazzino di stimoli (2x stimoli soluzione stock) immediatamente prima dell&#39;uso in modo che il 100 microlitri di 2x stimoli soluzione madre può essere aggiunto a 100 ml di cellule in un volume finale di 200 microlitri per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Se è necessaria una piastra ricoperta di stimoli (IgM o CD40 per le cellule B o CD3 e CD28 per le cellule T), diluire gli stimoli in PBS e pre-coat la piastra di coltura a 4 ° C durante la notte. In alternativa, la piastra di coltura può essere rivestita a 37 ° C per 1 ora il giorno dell&#39;esperimento. Lavare la piastra rivestita due volte con PBS (Non lasciare che la piastra si asciughi in qualsiasi momento). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Per le cellule B </td><td></td></tr><tr><td> Stimoli </td><td> concentrazione finale </td></tr><tr><td> (Ab &#39;) 2 di capra anti-topo IgM F </td><td> 0.6-2.4 mg / ml </td></tr><tr><td> Anti-topo CD40 mAb </td><td> 0,5-2 mg / ml </td></tr><tr><td> ricombinanteMouse IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> lipopolisaccaride </td><td rowspan="2"> 0.1-10 mg / ml </td></tr><tr><td> (LPS) da E. coli sierotipo 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Per le cellule T </td><td></td></tr><tr><td> Stimoli </td><td> concentrazione finale </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (piatto rivestito) </td><td> 2-10 mg / ml </td></tr><tr><td> (50 ul / pozzetto per il rivestimento) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (piatto rivestito) </td><td> 2 ug / ml </td></tr><tr><td> Ricombinante IL-2 </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (Phorbol estere) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (calcio ionoforo) </td><td> 250 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Concentrazioni di stimoli utilizzati per stimolare i linfociti in coltura in vitro.<ol start="3"><li> Per le cellule B CFSE-etichettati, ri-sospendere o 3 x 10 6 cellule / ml in terreno completo RPMI e cultura in triplice copia con 3 x 10 5 cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti fondo piatto per 72 ore. </li><li> Per le cellule T CFSE-etichettati, ri-sospendere a 0,5-3 x 10 6 cellule / ml in terreno RPMI completo e la cultura in triplice copia con 0,5-3 x 10 5 cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti a fondo sferico per 48 o 72 ore . </li></ol> 6. In Vivo Stimolazione <ol><li> Per la stimolazione in vivo, trasferimento adoptively 4 x 10 6 cellule T CFSE-etichettati per mouse (per via endovenosa (iv) in 200 ml di PBS) in ogni mouse destinatario MHC-abbinato. NOTA: In questo protocollo, le cellule T CFSE-etichettati possono essere trasferiti utilizzando adoptively vena della coda o iniezione retro-orbitale come queste cellule saranno a casa per linfoidi organi come i milza e nei linfonodi. </li><li> Sfida i topi riceventi un giorno in più con l&#39;antigene. NOTA:In questo esempio, usiamo ovalbumina (proteina OVA, 50 mg / mouse) come antigene perché OVA-specifici, recettore delle cellule T (TCR), le cellule T sono state -transgenic adoptively trasferite in topi riceventi. Preparare proteine OVA in PBS sterile e iniettare 100 ml di OVA proteine / PBS o il controllo PBS, per via sottocutanea (SI), in ogni topo ricevente 5. </li><li> Harvest e generare sospensioni singola cellula da organi linfoidi (linfonodi e milza) di topi riceventi 3 giorni dopo l&#39;immunizzazione con la proteina OVA o PBS. linfonodi separare in linfonodi prossimali (PLN), che comprende ascellare, brachiale e superficiali linfonodi cervicali) e linfonodi distali (DLN), che comprende mesenterica, poplitea, inguinali, lombari, e linfonodi caudale. cellule macchia con gli anticorpi FACS appropriate per verificare la presenza di proliferazione delle cellule T. NOTA: In questo esperimento di monitoraggio delle cellule CFSE, CFSE-etichettati cellule T da topi di controllo PBS-iniettati stabilire una linea di base per la fluorescenza non dividing cellule. Divisioni cellulari di proliferare, le cellule, CFSE-etichettati antigene-stimolata sono visualizzati misurando i picchi di fluorescenza 12,13. Con il controllo PBS, il numero di divisioni cellulari di proliferanti, cellule T CFSE etichettati può essere determinato 12,13. </li><li> Analizzare i dati di proliferazione cellulare CFSE marcato confrontando il numero di divisioni cellulari o picchi tra i campioni (figure 1 e 2). NOTA: Per esempio, CFSE marcato, le cellule T specifiche per OVA adoptively trasferite in topi riceventi ricevono l&#39;antigene OVA saranno sottoposti proliferazione attiva rispetto ai topi di controllo PBS-iniettati 5,12. Inoltre, è degno di nota sottolineare che ci sono molti modi per analizzare i dati di proliferazione cellulare CFSE, come dimostrato da Hawkins e colleghi 14. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, dimostriamo una procedura per purificare i linfociti da organi linfoidi. la purificazione delle cellule usando magnetica ordinamento tallone è un metodo semplice e veloce che produce vitali, cellule bersaglio altamente purificate. I passaggi critici all&#39;interno del protocollo La vitalità cellulare e la resa delle cellule Il mantenimento di vitalità delle cellule lignaggio ematopoietiche in ...

I linfociti maturi generalmente esistono nello stato di riposo se non c'è un'infezione o un'infiammazione preesistente nell'individuo. Pertanto, è importante mantenere lo stato naïve dei linfociti durante il processo di isolamento prima di eseguire saggi funzionali in vitro o in vivo. La chiave per garantire risultati coerenti e riproducibili è limitare qualsiasi manipolazione non necessaria delle cellule. 
La selezione magnetica delle cellule utilizza anticorpi e microsfere per marcare le cellule in modo da arricchire la popolazione cellulare di interesse. Con questo approccio, ci sono due strategie di purificazione: arricchimento positivo e esaurimento negativo. L'arricchimento positivo arricchisce la popolazione cellulare di interesse utilizzando un anticorpo che si lega alle cellule bersaglio. La deplezione negativa, d'altra parte, esaurisce le cellule non bersaglio, lasciando la popolazione cellulare di interesse. Nel nostro laboratorio, preferiamo la deplezione negativa all'arricchimento positivo perché il legame degli anticorpi alle cellule bersaglio potrebbe potenzialmente alterare le caratteristiche e il comportamento delle cellule. Infatti, molti marcatori di superficie cellulare stabiliti adatti all'isolamento di una particolare popolazione cellulare sono anche recettori funzionali. 
La selezione magnetica delle cellule non solo produce popolazioni altamente pure di cellule bersaglio vitali, ma richiede anche meno tempo ed evita lo stress cellulare indotto dal flusso ad alta pressione utilizzato nella selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Etichettando le popolazioni cellulari indesiderate e deplendole utilizzando una colonna di separazione magnetica, siamo in grado di eseguire un rapido isolamento cellulare senza compromettere la vitalità della popolazione cellulare bersaglio. In questo protocollo, dimostriamo l'uso di strategie di deplezione negativa per purificare le cellule B o le cellule T naive.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (senza L-Glutammina)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td><td></td><td></td> Fetale Bovino <td>Inattivato al Calore&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere magnetiche anti-CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Mescolare bene prima dell'uso</td></tr><tr><td>Microsfere di streptavidina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Mescolare bene prima dell'uso</td></tr><tr><td>Perle magnetiche anti-annessina V</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Mescolare bene prima dell'uso</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>piastra di coltura sterile con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>piastra di coltura sterile con fondo F a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m cell strainer mesh</td><td></td><td></td><td>Per sterilizzare utilizzando la radiazione UV prima dell'uso</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m&nbsp; unità filtranti sterili monouso</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Può essere sostituito con qualsiasi dispositivo filtrante sterile</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV in breve; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY in breve; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR in breve; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>Colorante per la proliferazione cellulare eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 in breve; alternativa a CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternativa a CFSE</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</strong</td><td>>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo Rosso</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Può utilizzare da altre fonti</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr> <tr><td>(5-(e 6-) carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE)</td><td>Sonde molecolari</td><td>C-1157</td><td>Ricostituire in DMSO</td></tr><tr><td>Forbolo 12,13-dibutirrato (PBDU, Estere del forbolo)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Ionoforo di calcio)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda </td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorpi e proteina ricombinante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b biotina (clone m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>CD11c biotina (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>Biotina Gr-1 (clone RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>Ter119 biotina (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>TCR-&gamma; e delta; biotina (clone GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>CD19 biotina (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>B220 biotina (clone RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>CD49b biotina (clone DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>CD4 biotina (clone GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>Cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>CD8 biotina (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>cocktail di deplezione delle cellule T</td></tr><tr><td>F(ab')2 IgM anti-topo di capra (rivestite in piastra)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 &micro; l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti)</td></tr><tr><td>Anti-topo CD40 mAb (rivestito su piastra)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 &micro; l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti)</td></tr><tr><td>IL-4 ProSpec ricombinante</td><td>&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS da E. coli Sierotipo 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (rivestito con piastra)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &micro; l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clone clone 37.51) (rivestito su piastra)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 &micro; l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti)</td></tr><tr><td>Albumina ricombinante IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>da albume d'uovo di gallina, Ovalbumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Le cellule B e T, con i loro repertori antigene-recettore estremamente diversi, hanno la capacità di montare risposte immunitarie specifiche contro quasi tutti i patogeni invasori1,2. Comprensibilmente, tali intricate capacità sono controllate da un gran numero di molecole coinvolte in vari processi cellulari per garantire risposte immunitarie tempestive e spazialmente regolate3. Qui, descriviamo le procedure sperimentali che consentono l'isolamento rapido di linfociti murini altamente purificati utilizzando la tecnologia di smistamento cellulare magnetico. I linfociti purificati risultanti possono quindi essere sottoposti a vari saggi funzionali in vitro o in vivo, come la determinazione della capacità di segnalazione dei linfociti dopo stimolazione mediante immunoblotting4 e lo studio delle capacità proliferative mediante incorporazione di 3H-timidina o marcatura dell'estere succinimidil (CFSE)5-7 della carbossifluoresceina diacetato (CFSE). Oltre a confrontare le capacità funzionali dei linfociti di controllo e dei linfociti geneticamente modificati, possiamo anche determinare la capacità stimolatoria delle cellule T delle cellule presentanti l'antigene (APC) in vivo, come mostrato nei nostri risultati rappresentativi utilizzando cellule T OT-I marcate con CFSE trapiantate.

depurazione cellule magnetica dei linfociti consente di purificare una popolazione di cellule bersaglio in un tempo relativamente breve lasso di tempo. Utilizzando il nostro protocollo di esaurimento, siamo stati in grado di aumentare la percentuale di cellule T CD8 (OT-I in ricombinazione attivante del gene-1 (RAG-1) topi -carente) dal 72,8% (prima della depurazione) al 94,2% (dopo la depurazione; Figura 1A) 4,5. Questi linfociti purificati possono poi essere...

I linfociti sono i principali attori nelle risposte immunitarie adattative. Qui, presentiamo un protocollo di purificazione dei linfociti per determinare le funzioni fisiologiche delle molecole desiderate nell'attivazione dei linfociti in vitro e in vivo. Le procedure sperimentali descritte sono adatte per confrontare le capacità funzionali tra linfociti di controllo e linfociti geneticamente modificati.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le capacità funzionali dei linfociti murini purificati mediante l'utilizzo di diversi saggi funzionali in vitro e in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'Immunologia e della Biologia Molecolare, ad esempio investigando la funzione di una proteina di interesse in linfociti privi del gene corrispondente.Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di purificare rapidamente i linfociti con manipolazioni minime e ridotto stress ambientale. Per purificare le cellule B, risospendere fino a 1×10⁸ cellule spleniche totali lisate dei globuli rossi in 300 µL di soluzione salina bilanciata o BSS integrata con FBS. Quindi aggiungere 50 µL di microperle magnetiche anti-CD43.Per rimuovere le cellule morte, aggiungere 30 microlitri di microsferette magnetiche di Annexina V per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Agitare delicatamente la sospensione cellulare ogni 15 minuti per garantire un'etichettatura uniforme delle cellule. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule etichettate con 14 millilitri di BSS integrato con FBS.Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante, agitare delicatamente il tubo e risospendere il pellet in uno-tre millilitri di BSS a temperatura ambiente integrato con FBS. Durante la centrifugazione, posizionare una colonna di separazione su un supporto magnetico e collegare un ago sterile da 21 gauge all'estremità della colonna per ridurre la velocità di flusso. Equilibrare la colonna con due millilitri di BSS a temperatura ambiente.Dopo aver risospeso il pellet in uno a tre millilitri di BSS a temperatura ambiente, posizionare il tubo di raccolta sotto l'ago e quindi caricare le cellule marcate con B sulla colonna equilibrata. Raccogliere il flusso in uscita in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, risciacquare la colonna con un millilitro di BSS fresco integrato con FBS.Unire il lavaggio con le cellule bersaglio raccolte e ricaricare la colonna con l'aluetto contenente le cellule bersaglio, raccogliendo il flusso in uscita nello stesso tubo da 15 millilitri. Lavare quindi la colonna tre volte con un millilitro di BSS integrato con FBS, continuando ad aggiungere i lavaggi alla sospensione delle cellule bersaglio. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere la colonna dal magnete e caricarla con cinque millilitri di BSS integrato con FBS.Utilizzare lo stantuffo della colonna per trasferire le cellule non bersaglio marcate magneticamente in un nuovo tubo da 15 millilitri. Successivamente, verificare la purezza delle cellule separate mediante citometria a flusso. Per riutilizzare una colonna di separazione, dopo aver espulso le cellule marcate con le microsferette magnetiche, lavare la colonna tre volte dall'alto con cinque millilitri di PBS per ogni lavaggio e tre volte con cinque millilitri di acqua distillata per ogni lavaggio.Successivamente, lavare la colonna con cinque millilitri di etanolo al 70 percento nello stesso modo e utilizzare un flusso d'aria per asciugare completamente la colonna prima dell'immagazzinamento. Per riutilizzare la colonna in un nuovo esperimento di purificazione, lavare nuovamente la colonna dal basso verso l'alto con cinque millilitri di etanolo al 70 percento, seguiti da due lavaggi con cinque millilitri di PBS ciascuno. Quindi caricare la parte superiore della colonna con cinque millilitri di PBS per un ultimo lavaggio.E si proceda all'equilibrazione della colonna con due millilitri di BSS a temperatura ambiente. La colonna può quindi essere caricata con la popolazione cellulare sperimentale. Per etichettare le cellule B purificate con CFSE, si lavino le cellule due volte con soluzione di etichettatura appena preparata in un tubo conico da 15 millilitri.Risospendere il secondo pellet a una concentrazione di due volte 10 alla settima cellule per millilitro in una soluzione di marcatura fresca a 37 gradi Celsius. Centrifugare ogni volta i campioni, rimuovere il soprannatante e agitare leggermente i tubi. Quindi etichettare le cellule in rapporto di una parte di sospensione cellulare a una parte di soluzione fresca di CFSE 10 micromolare, al buio per 10 minuti a 37 gradi Celsius.Invertire il tubo ogni due minuti per garantire una distribuzione uniforme del colorante. È necessario prestare attenzione affinché il pellet cellulare venga completamente sospeso nella soluzione di marcatura. Aggregati cellulari possono influenzare l'omogeneità della marcatura con CFSE.Al termine dell'incubazione, aggiungere mezzo RPMI per bloccare la reazione del CFSE e lavare le cellule due volte con diversi volumi di mezzo RPMI completo freddo su ghiaccio. Se le cellule sono state etichettate correttamente, il pellet sarà di colore giallo. Successivamente, lavare due volte una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto rivestita con lo stimolo appropriato in PBS.Per le cellule B marcate con CFSE, risospendere a tre volte 10 alla sesta cellule B per millilitro in mezzo RPMI completo e seminare 100 microlitri di cellule B per pozzetto su piastre rivestite, in triplice replicato, per 72 ore. Con questo metodo di deplezione, la purezza delle cellule T OT1-CD8 isolate con perle può aumentare dal 72,8 percento al 94,2 percento. Le cellule possono quindi essere marcate con CFSE come appena illustrato e trasferite adottivamente in animali riceventi per analizzarne la proliferazione in vivo.Inoltre, l'etichettatura con anticorpo anti-CD45.1 può essere utilizzata per confermare ulteriormente l'identità delle cellule che esprimono CFSE come linfociti T OT1-CD8 donatori CD45.1 positivi trasferiti per via adottiva negli organi linfoidi dei topi riceventi. In alternativa, i linfociti T purificati possono essere stimolati in vitro e la loro proliferazione può essere valutata mediante incorporamento di timidina triziata. Un notevole aumento della purezza delle cellule B spleniche viene inoltre ottenuto con questo metodo.Facilitare opportunità simili per l'analisi funzionale successiva delle cellule B purificate. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in due ore. Eseguendo questa procedura, è importante mantenere la sospensione di CI sempre sul ghiaccio, eccetto durante la purificazione e la marcatura con CFSE.I linfociti purificati possono essere utilizzati anche in altri saggi funzionali, come il blotting immunochemico, per valutare la capacità di segnalazione terminale dei linfociti modificati geneticamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione più chiara di come purificare le cellule B e T e di come utilizzare tali cellule per diversi saggi funzionali in vitro e in vivo.

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