Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso
18 ottobre 2016
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per fenotipici e analisi quantitativa dei macrofagi residenti da reni di ratto mediante citometria di flusso. Le cellule colorate risultanti possono essere utilizzati anche per altre applicazioni, incluse separazione delle cellule, analisi di espressione genica o studi funzionali, aumentando così le informazioni ottenute nel modello sperimentale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare e caratterizzare i macrofagi residenti nei reni di ratto mediante citometria a flusso. Questo metodo può avere una domanda chiave di risposta nella fluidità come qual è il contributo di ogni macrafago di tipo nel danno renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente il cateterismo renale di diversi marcatori proteici. Pertanto, a limitare l'integrità cellulare di Dimostrare la procedura saranno Elena Olivares, studentessa A.P.A.S.D. dell'Università Complutense e Melania Guerrero, studentessa A.P.A.S.D. di Per la perfusione e l'estrazione renale, iniziano pizzicando una piccola piega della pelle per confermare che il ratto ha raggiunto il livello appropriato di sedazione. E copri gli occhi con un unguento veterinario. Posizionare l'animale su un tavolo chirurgico in posizione supina. E immergere l'addome con il 70% di etanolo. Successivamente, praticare un'incisione centrale attraverso la pelle addominale e il peritoneo dal pube alla gabbia toracica per esporre le cavità pleuriche e addominali. Utilizzare il sistema di perfusione per iniettare una soluzione salina allo 0,9% nell'aorta addominale per lavare i reni. Tagliare l'aorta all'addome per aiutare a rilasciare il sangue. Quando tutto il sangue è stato rimosso dai reni, recidere l'ilo renale. Quindi premere il bordo di ciascun rene per decapsulare accuratamente gli organi. E trasferire i reni estratti in H.B.S.S.To freschi generare una singola sospensione di cellule renali, usare le forbici per tagliare metà di un rene in piccoli frammenti. Trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 1 mL di collagenasi appena preparata alla provetta per un'incubazione di 30 minuti a 37
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'analisi fenotipica e quantitativa di macrofagi residenti provenienti da reni di ratto mediante citometria a flusso. Le cellule colorate risultanti possono essere utilizzate per diverse applicazioni, migliorando le informazioni ottenute nel modello sperimentale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- I macrofagi svolgono un ruolo cruciale nella salute e nelle malattie renali.
- La citometria a flusso consente un'analisi dettagliata delle popolazioni cellulari.
- Comprendere il comportamento dei macrofagi può orientare le strategie terapeutiche.
- I modelli ratini sono comunemente utilizzati per lo studio delle funzioni renali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'isolamento e l'analisi dei macrofagi renali.
- Favorire ulteriori ricerche sulle funzioni dei macrofagi in contesti renali.
- Fornire una risorsa per i ricercatori in campi correlati.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso per l'analisi cellulare.
- Tecniche di colorazione per l'identificazione dei macrofagi.
- Protocolli per il sorting cellulare e l'analisi dell'espressione genica.
- Studi funzionali per valutare l'attività dei macrofagi.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di macrofagi residenti dai reni di ratto.
- Caratterizzazione dettagliata dei fenotipi dei macrofagi.
- Applicazioni potenziali negli studi sull'espressione genica e funzionali.
- Migliore comprensione del ruolo dei macrofagi nella salute renale.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'analisi dei macrofagi.
- I risultati possono orientare futuri studi sulle malattie renali.
- La ricerca può essere estesa ad altre applicazioni oltre la citometria a flusso.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una caratterizzazione fenotipica accurata dei sottogruppi di macrofagi nei modelli di malattia renale è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi in patologie renali indotte dall'infiammazione. Questo protocollo di citometria a flusso consente una discriminazione quantitativa dei fenotipi di macrofagi pro-infiammatori (M1) e immunoregolatori (M2) nei reni di ratto, fornendo informazioni meccanicistiche su fibrosi e modulazione immunitaria. Fornendo un metodo affidabile per valutare il contributo dei macrofagi al danno renale, questo approccio rafforza la sicurezza predittiva nella selezione preclinica degli obiettivi e nell'analisi dei percorsi biologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando i rapporti tra macrofagi M1/M2 in modelli di danno renale.
- Valore operativo: Utilizza un doppio gating su CD45/CD68 con marcatura superficiale di CD86/CD163 per definire i fenotipi dei macrofagi con elevata specificità.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio sui bersagli collegando gli stati di polarizzazione dei macrofagi a vie di fibrosi e immunoregolazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output standardizzati e quantitativi di citometria a flusso per la frequenza dei macrofagi e l'espressione dei marcatori.
- Riproducibilità: Mostra una bassa mortalità cellulare e un'integrità preservata, consentendo letture fenotipiche costanti tra esperimenti.
- Utilizzabilità successiva: I macrofagi isolati rimangono vitali per il sorting cellulare, nonché per l'analisi di mRNA e proteine, favorendo analisi multi-omiche successive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Direttamente applicabile ai modelli di malattie renali infiammatorie in cui i fenotipi dei macrofagi determinano la patogenesi.
- Continuità traslazionale: I dati fenotipici ottenuti dai macrofagi separati possono guidare la scoperta di biomarcatori e la validazione funzionale in studi preclinici.
- Decisioni basate sul rischio: Permette una valutazione oggettiva degli effetti di composti immunomodulatori sulla polarizzazione dei macrofagi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla valutazione preclinica, fornendo letture immunologiche che informano l'ottimizzazione del composto promettente e gli studi sul meccanismo d'azione nei modelli di malattia renale.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi su percorsi mediati dai macrofagi nel danno renale attraverso la quantificazione fenotipica.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili sui macrofagi, adatti alla validazione di saggi e a campagne di screening di composti.
- Analisi: Fornisce letture multiparametriche mediante citometria a flusso (CD45+/CD68+/CD86+ per M1; CD45+/CD68+/CD163+ per M2) che consentono analisi comparative tra gruppi.
- Ricerca traslazionale: Collega il fenotipaggio dei macrofagi a saggi funzionali successivi e al profilo di espressione genica in sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato di immunofenotipaggio applicabile a diversi modelli di malattia renale e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nel danno renale mediato dai macrofagi consentendo una discriminazione fenotipica precisa.
- Valore operativo: Fornisce un isolamento e una colorazione standardizzati dei macrofagi con bassa variabilità, compatibili con le strutture centrali di citometria a flusso.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo collegando la modulazione del bersaglio a modifiche misurabili nella polarizzazione dei macrofagi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati immunomodulatori in base alla modulazione del fenotipo dei macrofagi nei modelli preclinici, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella compensazione della citometria a flusso, nella strategia di gating e nella validazione dei marcatori dei macrofagi.
- Dipende dall'accesso a strumentazione per la digestione con collaghenasi e a infrastrutture sterili per la lavorazione delle cellule.
- Necessita della standardizzazione di pannelli anticorpali e controlli di fluorescenza tra diversi siti per una quantificazione riproducibile di M1/M2.
- L'adattamento ad altri tessuti potrebbe richiedere l'ottimizzazione degli enzimi di dissociazione e dei pannelli di marcatori.
- Limitato dalla disponibilità di marcatori specifici per macrofagi di ratto (CD86, CD163) rispetto ai repertori murini più estesi.
