Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come ad esempio il modo in cui i singoli canali ionici voltaggio-dipendenti contribuiscono alle funzioni di un neurone specifico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di mappare la funzione dei canali ionici a livello subcellulare nei neuroni. Inizia questa procedura posizionando il cervello su una capsula di Petri di 9 centimetri con il fondo coperto da uno strato di SiliGuard.

Successivamente, circonda il cervello con saccarosio-ACSF ghiacciato. Per preparare le fette coronali, fai due tagli per rimuovere il cervelletto e la parte rostrale del cervello. Quindi applicare la colla cianoacrilica sul vassoio dei campioni e incollare il blocco cerebrale al vassoio in modo che la parte rostrale sia rivolta verso la fase di affettatura.

Successivamente, applicare alcune gocce di saccarosio-ACSF sul cervello e immergere lentamente il vassoio nella camera di taglio. Successivamente, regolare la lama del rasoio con un angolo di 15 gradi rispetto al piano orizzontale. Tagliare fette di cervello coronale di circa 500 micrometri in direzione nasale a chiazze prima di raggiungere la substantia nigra.

Quindi regolare lo spessore per tagliare fette di 300 micrometri contenenti la regione di interesse. Separare le fette dal blocco di tessuto con un ago a profusione molto sottile attaccato a una siringa parallela al bordo della lama del rasoio. Successivamente, trasferire le fette nella camera di riserva a 34 gradi Celsius per un'ora.

In questa procedura, trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione. Ancorare la fetta sul fondo della camera di registrazione con un anello di platino e assicurarsi che la fetta sia di buona qualità con una superficie liscia e uniforme. Quindi seleziona un neurone con un dendrite che si estende su una lunga distanza sullo stesso piano e assicurati che il dendrite di interesse possa essere seguito fino a un soma ben definito.

Quindi, riempire la pipetta per cerotti con la soluzione dell'elettrodo. Per applicare un patch al dendrite in modalità cell-attachment, identificare e concentrarsi su una parte del dendrite. Applicare una pressione positiva alla pipetta e abbassarla utilizzando il micromanipolatore.

Quindi posizionare la pipetta vicino alla membrana e regolare la pressione in modo da creare una piccola fossetta. Successivamente, rilasciare la pressione sul puntale della pipetta e applicare il patch al dendrite, controllando la resistenza della pipetta. Cerca di ottenere una resistenza di tenuta più grande di un gigaohm, al massimo tra tre e dieci gigaohm, per le registrazioni collegate a celle.

Successivamente, ritrarre la pipetta lontano dalla membrana, di un paio di micrometri, per evitare la deformazione del dendrite. Le correnti d'azione qui viste rappresentano i potenziali d'azione spontanei dei neuroni nigrali. Per sopprimere le correnti d'azione, applicare bloccanti dei canali del calcio e del sodio all'ACSF.

Quindi applicare un passo di tensione di 90 millivolt, da un potenziale di mantenimento di zero millivolt, per evocare la corrente cationica attivata dall'iperpolarizzazione. Al termine della registrazione, rompere la patch per ottenere la modalità cella intera. Successivamente, prelevare lentamente e delicatamente la pipetta dendritica dalla membrana neuronale per ottenere un cerotto esterno-esterno.

Per registrare dal soma corrispondente in modalità cellula intera, individuare il soma corrispondente del dendrite. Abbassare una pipetta con resistenza compresa tra cinque e dieci megaohm con una soluzione intracellulare a base di potassio nel corpo cellulare. Quindi applicare una breve pressione negativa sulla punta della pipetta per rompere la membrana al fine di ottenere la modalità a cellula intera.

Verificare l'identità del neurone in modalità current-clamp applicando lunghi passaggi di corrente iper e depolarizzanti e consentire alla biocitina dalla pipetta di diffondersi lungo i dendriti. Dopo 10 minuti, prelevare la pipetta per ottenere un cerotto dall'esterno verso l'esterno. Utilizzare una sequenza di brevi movimenti laterali verso l'alto per favorire la corretta chiusura della membrana cellulare, una volta che la pipetta si trova sopra la fetta, per uscire completamente dalla camera di registrazione.

Tenere la fetta nella camera di registrazione per altri 15 minuti in ACSF standard per consentire l'equilibrio della biocitina e del neurone registrato. Quindi trasferire delicatamente la fetta in un flacone di vetro ambrato da 25 millilitri contenente ACSF standard per istologia. In questa procedura, individuare approssimativamente il neurone marcato in modo fluorescente nella fetta con epifluorescenza.

Esaminare brevemente l'arbor dendritico dei neuroni e localizzare l'assone e la bolla assonale utilizzando un obiettivo 10X. Quindi, passa al microscopio confocale e seleziona il diodo laser a 488 nanometri per eccitare il neurone marcato. Segui l'estensione dell'assone e dei dendriti sull'asse Z e registra immagini successive in modo da ottenere una pila Z per l'intera cellula.

Regola la risoluzione dell'asse Z e raccogli le immagini confocali della cella a basso e alto ingrandimento. Al termine, apri il file immagine del neurone con un software di imaging. Confrontare l'immagine di proiezione Z con un'immagine IR-DGC a occhio per individuare la posizione precisa della pipetta patch durante la registrazione elettrofisiologica.

Qui è mostrata l'immagine IR-DGC di un neurone dopaminergico e di una pipetta sul dendrite prossimale. La traccia di corrente mostra la capacità delle correnti di dispersione EN in risposta a un comando di tensione di cinque millivolt, in configurazione collegata a cella, con la resistenza di tenuta di cinque gigaohm. Il passo di tensione iperpolarizzante, da un potenziale di membrana di zero millivolt, induceva una corrente cationica attivata dall'iperpolarizzazione che si attivava lentamente.

La traccia di corrente è stata invertita e dotata di una singola funzione esponenziale, fornendo una costante di tempo di 632 millisecondi. Ecco le risposte di tensione dell'intera cellula registrata soma a impulsi di corrente iper e depolarizzanti di un secondo in presenza di bloccanti di corrente di sodio e calcio voltaggio-dipendenti per rimuovere i potenziali d'azione durante la registrazione collegata alla cella. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottenere tessuti sani e condizioni di registrazione stabili. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunoistochimica, per rispondere a ulteriori domande come l'identità del neurone registrato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurofisiologia per esplorare la funzione delle proprietà e il ruolo dei canali ionici voltaggio-dipendenti nelle cellule eccitabili.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare ed esaminare la distribuzione delle correnti che scorrono attraverso i canali ionici voltaggio-dipendenti nei dendriti.